Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não nhật bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Quỳnh Liên THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả trong thí nghiệm này đều được tôi làm thực tế và chưa có công trình nào công bố trên các bài báo, tạp chí, hay các phương tiện thông tin đại chúng. Tác giả Nguyễn Ngọc Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tôi đã nhận được sự giúp đỡ và những kinh nghiệm quý báu từ GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, TS. Lê Văn Sơn, TS. Nguyễn Hữu Cường cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Từ đáy lòng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với sự gúp đỡ đó để tôi có thể hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong bộ môn Sinh, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại trường. Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân bên cạnh đã động viên khích lệ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, ngày 1 tháng 10 năm 2009 Học viên Nguyễn Ngọc Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amp: Ampicillin AS: Acetosyringone A. Tumefaciens: Agrobacterium Tumefaciens Bp : cặp baze Carbe: Carbenicillin CNSH: Công nghệ sinh học CNTBTV: Công nghệ tế bào Thực vật Da: Dalton Đoạn 27aa: Đoạn gen mã hoá cho đoạn peptít 27 axit amin của virut viêm não Nhật Bản Đoạn 27aa_LTB: Đoạn gen nối giữa đoạn 27aa và gen LTB DNA: Deoxyribonucleic acid E.coli: Escheria Coli EDTA: Ethylen dimine tetra- acetic acid HEPES: N-2-huydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid IPTG: Isopropylthio-beta-D-glactoside Kana: Kanamycin Kb: kilobaze LB: Luria Bertani LTB: Labile enterotoxin B OD: Mật độ quang học PBS: Phosphate buffer saline PCR: Polymerase chain reaction Rifa: Rifampicin SDS: Sodium dodecyl sulphat Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn SDS- PAGE: SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis Spec: Spectinomycin TE: Tris-EDTA VNNB: viêm não Nhật Bản X-gal: 5-bromo-4 chloro- 3 indolyl-beta-D-glactoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined. Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU . Error! Bookmark not defined. 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản Error! Bookmark not defined. 1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật BảnError! Bookmark not defined. 1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh . Error! Bookmark not defined. 1.1.3 Đặc điểm biểu hiện của bệnh: Error! Bookmark not defined. 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) Error! Bookmark not defined. 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất lý hoá của virut VNNBError! Bookmark not defined. 1.2.2. Sự nhân bản của virut . Error! Bookmark not defined. 1.2.3. Cấu trúc của virut VNNB . Error! Bookmark not defined. 1.2.4. Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của đoạn peptit kháng nguyên 27 axit amin của virut VNNB Error! Bookmark not defined. 1.3 Các loại văcxin phòng bệnh VNNB Error! Bookmark not defined. 1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuộtError! Bookmark not defined. 1.3.2 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ tế bàoError! Bookmark not defined. 1.3.3 Văcxin sống giảm độc lực . Error! Bookmark not defined. 1.3.4 Nghiên cứu phát triển văcxin mớiError! Bookmark not defined. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined. 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined. 2.1.1. Vật liệu thực vật Error! Bookmark not defined. 2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử Error! Bookmark not defined. 2.1.2.1. Mồi . Error! Bookmark not defined. 2.1.2.2. Plasmid Error! Bookmark not defined. 2.1.2.3 Các chủng vi sinh vật và các nguyên liệu dùng trong thí nghiệm Error! Bookmark not defined. 2.1.2.4 Các loại máy móc . Error! Bookmark not defined. 2.1.3 Hoá chất Error! Bookmark not defined. 2.1.4 Các môi trƣờng nuôi cấy và các dung dịchError! Bookmark not defined. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu . Error! Bookmark not defined. 2.2.1. Nhân đoạn 27 aa và LTB bằng PCRError! Bookmark not defined. 2.2.2 Phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc (colony PCR)Error! Bookmark not defined. 2.2.3 Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli . Error! Bookmark not defined. 2.2.4. Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coliError! Bookmark not defined. 2.2.5. Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật Error! Bookmark not defined. 2.2.6. Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vậtError! Bookmark not defined. 2.2.7. Kiểm tra biểu hiện của protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined. Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined. 3.1 Nhân đoạn gen 27 aa . Error! Bookmark not defined. 3.2 Nhân gen LTB và nối với gen 27 aa . Error! Bookmark not defined. 3.3 Thiết kế vector biểu hiện gen 27 aa_LTB trong E.coliError! Bookmark not defined. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 3.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined. 3.4.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E.coli BL21Error! Bookmark not defined. 3.4.2 Biểu hiện gen 27aa_LTB trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined. 3.5. Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong thực vậtError! Bookmark not defined. 3.5.1 Thiết kế vector biểu hiện gen 27aa_LTB trong thực vậtError! Bookmark not defined. 3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen pCB301 Error! Bookmark not defined. 3.5.3 Biến nạp vào A. tumefaciens . Error! Bookmark not defined. 3.5.4 Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc láError! Bookmark not defined. KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined. KIẾN NGHỊ . Error! Bookmark not defined. TÀI LIỆU THAM KHẢO . Error! Bookmark not defined. PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1 Mồi nhân gen 27 aa và gen LTB 17 Bảng 2 Các loại plasmid dùng trong thí nghiệm 18 Bảng 3 Máy móc dùng trong thí nghiệm 19 Bảng 4 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 19 [...]... miễn dịch niêm mạc để chống lại LT Do vậy, LTB có thể được sử dụng tăng cường hiệu quả miễn dịch của văcxin thực vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.Lrc-tnu.edu.vn Dựa theo những căn cứ trên, do đó chúng tôi đã chọn đề tài: Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng ” Số hóa bởi... là: Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột, văcxin bất hoạt trên nuôi cấy tế bào, văcxin sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào 1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột Những năm 1940 khi bắt đầu nghiên cứu sản xuất văcxin này ở dạng thô, văcxin này chứa toàn bộ protein não chuột và hàm lượng Myelin rất cao do đó tỷ lệ gây viêm não dị ứng cũng cao Ngày nay công nghệ tinh chế hiện đại hơn đã làm giảm... ổn định cao trong quá trình bảo quản và sử dụng, an toàn Bên cạnh đó, những nghiên cứu trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản cho thấy đoạn 27 axit amin nằm trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản có khả năng tạo ra kháng thể chống lại virut này Ngoài ra, nghiên cứu trên tiểu đơn vị liên kết nội độc tố không bền nhiệt của E.coli (heat- labile enterotoxin: LT) cho thấy tiểu đơn vị B (LTB) có... thiết Đã từ lâu văcxin là phương thuốc phòng ngừa bệnh hiệu quả cho con người Và để phòng bệnh viêm não Nhật Bản thì cũng đã có rất nhiều loại văcxin được sản xuất Tuy nhiên, đại đa số các loại văcxin này thường có quy trình sản xuất phức tạp, trải qua các quá trình làm lạnh khắt khe Gần đây, văcxin thực vật được quan tâm nhiều vì nó có nhiều ưu điểm như dễ dàng thu sinh khối, dễ tăng quy mô sản xuất, ... có virut viêm não Nhật Bản (Japanese Encephalitis Virus- JEV) Virut viêm não Nhật Bản xâm nhập vào cơ thể làm tổn hại hệ thần kinh gây ra những tổn thương nghiêm trọng dẫn đến tử vong hoặc để lại các di chứng nặng sau khi hồi phục Ðến nay, bệnh viêm não Nhật Bản cũng như nhiều bệnh do siêu vi gây ra khác chưa có thuốc đặc trị Ðiều trị chủ yếu là làm bớt đi phần nào các triệu chứng, cứu người bệnh qua. .. hiện đại hơn đã làm giảm tối đa protein Myelin ( . đã chọn đề tài: Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng ”.. NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG
