Chương Một số phương pháp phát biến dị di truyền mức phân tử Trong kỷ 20 người ta bắt đầu nghiên cứu biến dị gene, hậu đột biến tích lũy theo thời gian Sự đánh giá đo lường biến dị quần thể gia đình có ý nghĩa quan trọng việc lập đồ gen nhằm xác định vị trí đặc hiệu chúng NST Đây chìa khóa để xác định chức gen đặt sở cho chẩn đoán di truyền Dưới mô tả phương pháp sử dụng để phát biến dị di truyền người I Điện di protein (protein electrophoresis) Kỹ thuật phát triển vào thập niên 1930 áp dụng rộng rãi người vào thập niên 1950 1960 cho phép phát cách đáng kể tính chất đa hình (polymorphism) người Kỹ thuật dựa nguyên tắc khác biệt amino acid phân tử protein xảy đột biến DNA gây khác biệt nhẹ điện tích protein Ví dụ bệnh hồng cầu hình liềm thay glutamic acid valine chuỗi beta globin làm thay đổi điện tích chuỗi globin glutamic acid có hai nhóm carboxyl valine có nhóm carboxyl Điện di sử dụng để xác định người có Hb bình thường (HbA) hay mang Hb bị đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm (HbS) Hemoglobin cho vào khay gel gồm (tinh bột, agarose polyacrylamide) để chạy điện di Do có khác biệt điện tích nên HbS HbA di chuyển với tốc dộ khác gel Sau cho chạy điện di gel nhiều chúng nhuộm dịch hóa chất để thấy vị trí chúng khay gel Căn phân bố chúng khay gel để xác định người đồng hợp tử HbA, đồng hợp tử HbS hay dị hợp tử (HbA/HbS) (hình 1) Điện di protein dùng để phát biến dị amino acid hàng trăm loại protein người Tuy nhiên đột biến thay base không làm đổi nghĩa codon đột biến làm thay đổi amino acid không làm thay đổi điện tích protein khơng thể phát phương pháp Vì lý điện di protein cho phép phát khoảng phần ba đột biến xảy codon DNA Các đột biến xảy đoạn DNA không mang mã không phát phương pháp II Phát đột biến mức DNA Biến dị DNA ngừơi ước tính thay đổi khoảng từ 1/300 đến 1/500 bp Như có khoảng 10 triệu vị trí đa hình (polymorphism sites) có mặt tỷ cặp base có genome người Việc nghiên cứu biến dị DNA thơng qua nhóm máu điện di protein cho phép phát tỷ lệ nhỏ số biến dị Các kỹ thuật phân tử phát triển 20 năm qua giúp phát thêm hàng ngàn biến dị mức DNA Dưới trình bày số phương pháp phổ biến Sự đa hình chiều dài đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment Length Polymorphism: RFLPs) Nỗ lực việc phát biến dị di truyền mức độ DNA đựoc thực thơng qua vai trị enzyme vi khuẩn gọi enzyme giới hạn (restriction endonuclease/restriction enzyme) Các enzyme sản xuất nhiều loại vi khuẩn khác nhằm mục đích ngăn chặn xâm nhập DNA lạ cách cắt nhỏ DNA Các DNA lạ cắt vị trí đặc hiệu DNA gọi vị trí ghi nhận hay vị trí Hình 1: Kỹ thuật điện di protein giới hạn (recognition sites/restriction sites) Ví dụ: Ở Escherichia coli (một loại vi khuẩn có ruột) có enzyme giới hạn EcoRI ghi nhận đoạn DNA có trình tự GAATTC Mỗi bắt gặp đoạn DNA EcoRI cắt vị trí G A dẫn đến việc tạo thành đoạn DNA giới hạn Hình 2: Cắt DNA enzyme giới hạn EcoRI Giả sử có đoạn DNA với chiều dài khoảng vài ngàn nucleotide có vị trí ghi nhận cho enzyme EcoRI Nếu có biến dị xảy vị trí nằm làm đoạn GAATTC trở thành GAATTT, EcoRI không nhận diện vị trí cắt vị trí đầu cuối Do người mang biến dị vị trí cắt (A) có đoạn DNA giới hạn dài so với người bình thường khơng mang biến dị (B) (hình 2) Để quan sát đoạn DNA giới hạn có chiều dài khác người ta thực kỹ thuật gồm bước sau (hình 3): (1) Xử lí enzyme giới hạn (restriction digestion) Trước tiên DNA chiết tách từ mẫu mô, thường từ máu Sau DNA cho tiếp xúc với enzyme giới hạn EcoRI Quá trình tạo triệu đoạn DNA với chiều dài khác (2) Điện di Những đoạn đem điện di gel theo quy trình tương tự điện di protein nhiên đoạn DNA di chuyển gel phụ thuộc vào kích thước khơng phụ thuộc vào điện tích Các đoạn DNA ngắn di chuyển nhanh gel (3) Tách cấu trúc xoắn kép Sau đoạn DNA chuyển từ cấu trúc xoắn kép thành cấu trúc mạch đơn cách cho tiếp xúc với dung dịch kiềm Hình 3: Kỹ thuật phát tính đa hình chiều dài đoạn DNA giới hạn (4) Cố định DNA Để cố định vị trí đoạn DNA người ta thấm chuyển chúng từ gel qua màng rắn nitrocellulose (Southern transfer) Màng chứa hàng ngàn đoạn DNA phân bố theo trật tự tương tự vị trí chúng gel gọi màng thấm Southern (Southern Blot) (5) Xác định đoạn DNA đặc hiệu Nếu người ta nhìn tất đoạn lần màng lai khó phân biệt chúng với số lượng đoạn DNA q lớn Vì để nhận định có mặt đoạn DNA đặc hiệu người ta dựa vào nguyên tắc bổ sung Một mẫu dò (probe) đặc hiệu tạo nhờ kỹ thuật DNA tái kết hợp (recombinant DNA) mang đoạn mạch đơn DNA đặc hiệu có chiều dài khoảng vài ngàn bp đánh dấu chất đồng vị phóng xạ Màng thấm cho tiếp xúc với hàng ngàn probe có hoạt tính phóng xạ Trong điều kiện định trình bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung probe đoạn DNA đặc hiệu tương ứng xảy Do có vài kb nên probe xác định đoạn DNA đặc hiệu (thường có hai đoạn) Để quan sát vị trí xảy trình lai probe đoạn DNA đặc hiệu, màng lai cho tiếp xúc với phim X quang, phóng xạ phát từ đoạn dò tác động lên phim tạo vệt sẫm màu, gọi band Phương pháp gọi phương pháp phóng xạ tự chụp (autoradiogram).(hình 4) Như biến dị Hình 4: Hình phóng xạ tự chụp cho thấy vị trí xảy trình tự của band 4,1kb band 3,3kb Mỗi dãy đại DNA vị trí diện cho thành viên gia đình gia giới hạn đặc hiệu dẫn hệ hình phóng xạ tự chụp đến tính đa hình chiều dài đoạn DNA giới hạn (RFLPs) cắt loại enzyme giới hạn đặc hiệu Hiện tượng tạo đa dạng chiều dài đoạn DNA mà điện di chúng gel, chuyển lên màng lai dùng probe đặc hiệu có hoạt tính phóng xạ để phát đánh giá biến dị Quay trở lại với trường hợp bệnh hồng cầu hình liềm, người bình thường vị trí thứ chuỗi polypeptide globin bêta cấu trúc phân tử Hb glutamic acid Amino acid mã hóa gene codon GAG Trong bệnh hồng cầu hình liềm acid thay valin, mã hóa gene codon GTG Enzym giói hạn Mst II ghi nhận đoạn DNA CCTNAGG (N nghĩa enzyme ghi nhận loại base DNA vị trí đó) Như cắt đoạn DNA bình thường vị trí vị trí giới hạn tương tự nằm hai bên vị trí Kết Mst II tạo hai đoạn DNA, đoạn có chiều dài 1100 bp đoạn có chiều dài 200 bp Ở DNA mang đột biến thay GAG GTG làm Mst II không ghi nhận đoạn giới hạn nên đoạn DNA đột biến khơng cắt vị trí giữa, tạo đoạn DNA có chiều dài 1300 bp Trong điện di đoạn ngắn di chuyển xa gel nên hai đoạn DNA có kích thước khác (1100 1300 bp) phân biệt với dễ dàng màng lai nhờ probe mang DNA gene beta globin Trong trường hợp RFLPs cho phép phát trực tiếp đột biến gây bệnh.(hình 5) Hình 5: Cắt gene beta - globin enzym giới hạn Mst II Trong thực tế có nhiều phương pháp hịêu để đánh giá đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm Tuy nhiên phương pháp cịn hữu ích việc xác định nhiều loại biến dị đột biến gây bệnh khác Hiện người ta biết hàng ngàn enzyme giói hạn, enzyme ghi nhận đoạn DNA đặc hiệu Thêm vào hàng ngàn loại probe khác tổng hợp, probe đại diện cho đoạn ngắn DNA người Bằng cách kết hợp enzyme probe khác nhau, hàng ngàn vị trí đa hình phát genome người Sự đa hình sử dụng làm công cụ việc định vị nhiều gene bệnh quan trọng gene gây bệnh u xơ thần kinh type I (neurofibromatosis type I), bệnh Huntington, bệnh xơ nang (cystic fibrosis) v.v Sự đa hình số lượng đoạn lặp (Variable Number of Tandem Repeat Polymorphism: VNTR) Phương pháp xác định RFLP cho phép phát biến dị có mặt khơng có mặt vị trí hạn chế DNA Các biến dị gọi đa hình vị trí giới hạn ( restriction site polymorphism: RSPs) trường hợp biến dị có allele dẫn đến hạn chế khảo sát biến dị di truyền Sự đa dạng tăng lên biến dị tạo nhiều allele hơn, biến dị thấy DNA tiểu vệ tinh (minisatellites) Biến dị di truyền tính thơng qua số lượng đoạn lặp vùng định Một vùng DNA tiểu vệ tinh lặp 2, lần lên đến 20 lần lặp Số lượng thay đổi lớn từ người qua người khác tạo nhiều biến dị di truyền quần thể chúng gọi số lượng dao động đoạn lặp nối tiếp (variable number of tandem repeats: VNTRs) Các VNTR phát kỹ thuật tương tự kỹ thuật dùng để phát RFLP DNA xử lý loại enzyme giới hạn, đoạn DNA sau điện di, tách xoắn chuyển qua màng thấm Tuy nhiên đa hình vị trí giới hạn cho phép phát biến dị dựa vào có mặt vắng mặt vị trí giói hạn (chỉ có allele) VNTR cho phép phát biến dị thông qua khác số lượng đoạn lặp hai vị trí giới hạn (có thể có > allele) (hình 6) Hình 6: Tính đa hình số lượng đoạn lặp (VNTRs) Giống vùng DNA tiểu vệ tinh, DNA vi vệ tinh (microsatellite) có biến dị chiều dài kết khác số lần lặp Mỗi vi vệ tinh có từ 2, nucleotide chúng gọi đoạn lặp ngắn (short tandem repeat: STR) Mỗi đoạn lặp ngắn lặp lặp lại hàng trăm lần Số lần lặp DNA vi vệ tinh có khác biệt lớn người với người khác hai nhiễm sắc thể tương đồng Tính chất đa hình đoạn lặp ngắn (short tandem repeat polymorphism: STRP) khác với VNTR kích thước đoạn lặp chúng phân lập khơng phải thơng qua vị trí giới hạn nằm cạnh đoạn lặp mà thay vào kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction: phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase) Tính đa hình số lượng VNTR vi vệ tinh hữu ích việc lập đồ gene Đặc biệt DNA vi vệ tinh genome chúng có mặt nhiều hơn, phân bố dễ đánh giá phịng thí nghiệm Do đặc tính mà DNA vi vệ tinh trở thành đa hình chọn lựa hầu hết nghiên cứu để lập đồ gene Ngồi đa hình VNTR vi vệ tinh sử dụng cách hiệu lĩnh vực pháp lý xác định người cha, xác định tội phạm Khuếch đại DNA kỹ thuật PCR Việc sử dụng RFLP VNTR có ích phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật dịng hóa (cloning) kỹ thuật chuyển cố định DNA lên màng thấm Những kỹ thuật có số hạn chế định: (1) việc dịng hóa thường địi hỏi nhiều thời gian (trung bình tuần hơn); (2) việc thực kỹ thuật Southern blot đòi hỏi lượng lớn DNA tinh khiết, thường phải nhiều microgram (để có số lượng thường cần khoảng 1ml máu tươi) Kỹ thuật PCR cho phép nhân đoạn DNA đặc hiệu ngắn (có chiều dài khoảng vài ngàn kb ngắn hơn) nhân lên cách nhanh chóng thành hàng triệu Hình 7: Khuếch đại DNA giống hệt (hình 7) tạo kỹ thuật PCR điều kiện thuận lợi cho việc phát biến dị di truyền mức DNA hiệu nhiều so với phương pháp cổ điển Quá trình thực PCR đòi hỏi thành phần sau: (1) Hai đoạn mồi (primer), đoạn mồi đoạn DNA có từ 15 đến 20 base gọi oligonucleotide (oligo có nghĩa "một vài") Các primer tương ứng với trình tự DNA nằm đoạn quan tâm đoạn chứa đột biến gây bệnh chứa đa hình đoạn lặp DNA vi vệ tinh Các primer tổng hợp nhân tạo phịng thí nghiệm (2)DNA polymerase, loại enzyme định với nhiệt độ trích chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus Xúc tác cho trình nhân đơi DNA, kỹ thuật PCR q trình gọi trình kéo dài primer (primer extension) (3) Một lượng lớn nucleotìde tự (4) DNA từ thể sinh vật cần nghiên cứu, kỹ thuật PCR nhạy nên lượng DNA cần thiết nhỏ Đầu tiên DNA genome đun nóng lên nhiệt độ tương đối cao (95oC hơn) để tách xoắn làm hình thành chuỗi đơn Sau DNA cho tiếp xúc với lượng lớn primer, primer lai với DNA genome theo nguyên tắc bổ sung làm lạnh tới nhiệt độ khoảng từ 35oC tới 65oC DNA lại đun nóng tới nhiệt độ trung gian 70 đến 75oC Trong điều kiện có nhiều nucleotide tự do, chuỗi đơn DNA tổng hợp nhiệt độ xúc tác DNA polymerase đoạn primer Các DNA tổng hợp có cấu trúc xoắn kép với đầu 5' mang primer kéo dài nucleotide theo nguyên tắc bổ sung xúc tác enzyme DNA polymerase Chuỗi xoắn kép DNA lại đun nóng nhiệt độ cao trở lại để tách xoắn Chu kỳ nóng lạnh lập lập lại nhiều lần cho phép DNA tổng hợp đóng vai trị khn để tổng hợp thêm DNA số lượng tăng lên theo lũy thừa Khi chu kỳ lập lập lại từ 20 đến 30 lần tạo hàng triệu DNA ban đầu Tóm lại PCR trình bao gồm ba bước bản: (1) Tách cấu trúc kép DNA nhiệt độ cao (2) Lai với đoạn primer nhiệt độ thấp (2) Kéo dài đoạn primer nhiệt độ trung gian Kết tạo đoạn DNA hoàn toàn giống trình tự Mỗi chu kỳ địi hỏi vài phút từ DNA ban đầu khuyếch đại thành hàng triệu vịng vài Do tính đơn giản kỹ thuật nên máy PCR chế tạo để thực công việc cách tự động Khi DNA khuếch đại, chúng phân tích theo hướng khác Kỹ thuật PCR có nhiều thuận lợi kỹ thuật cổ điển do: (1) Có thể sử dụng với lượng DNA ban đầu nhỏ với đơn vị tính nanogram (10- 9g) picogram (10-12g), số lượng DNA thu từ vết máu khơ nhiều năm, sợi tóc chí từ mặt sau tem dán nước bọt đủ cho việc phân tích (2) Khơng địi hỏi q trình dịng hóa (cloning), PCR cho kết nhanh so với kỹ thuật cũ (3) PCR cho phép tạo lượng lớn DNA tinh khiết nên không cần phải sử dụng probe có hoạt tính phóng xạ để phát đoạn DNA mang đột biến mà dùng probe hoạt tính phóng xạ đánh dấu phương pháp hóa học an tồn Tuy nhiên PCR có bất lợi định: (1) Việc tổng hợp primer địi hỏi phải có hiểu biết trình tự đoạn DNA nằm cạnh đoạn DNA cần khảo sát Khi khơng có thơng tin trình tự đoạn bắt buộc phải sử dụng kỹ thuật khác (2) Do kỹ thuật PCR nhạy nên dễ bị nhiễm DNA từ nguồn khác phịng thí nghiệm (3) PCR khó áp dụng với đoạn DNA dài đến vài kb nên kỹ thuật sử dụng để phát đột biến đoạn gene lớn đoạn DNA Trong trường hợp phải sử dụng kỹ thuật Southern blotting để thay Do ưu việt kỹ thuật PCR, nên PCR sử dụng phổ biến chẩn đoán bệnh di truyền, pháp y di truyền học tiến hóa PCR thay cho kỹ thuật Southern blotting nhiều lãnh vực thường dùng để phân tích RFLP VNTR Xác định trình tự DNA (DNA sequencing) Trong nhiều nghiên cứu di truyền, mục tiêu xác định cho trình tự base tồn phần gene Việc xác định trình tự DNA cho phép tìm hiểu chất đột biến gene, chức gene, mức độ tương tự gene với gene khác biết 10 Hình 8: Kỹ thuật xác định trình tự nucleotide DNA cách sử dụng phương pháp dideoxy Một kỹ thuật sử dụng rộng rãi để xác định trình tự DNA phương pháp dideoxy (dideoxy method) Frederick Sanger đưa Phương pháp thực cách sử dụng dideoxynucleotide chấm dứt chuỗi (chain-terminating dideoxynucleotide) Đây nucleotide có cấu trúc tương tự deoxyribonucleotide bình thường khác khác chỗ chúng thiếu nhóm hydroxyl cấu trúc Sự khác biệt cấu trúc làm cho phân tử tạo 11 thêm liên kết phosphodiester với nucleotide tự Như dideoxynucleotide gắn vào chuỗi DNA tổng hợp sau khơng có thêm nucleotide gắn vào thêm chấm dứt q trình nhân đơi vị trí Người ta sử dụng loại dideoxynucleotide khác nhau, loại bổ sung với deoxyribonucleotide A, T, G, C Trình tự chuỗi đơn DNA cần đọc trình tự đựơc trộn với primer đánh dấu chất hoạt tính phóng xạ, DNA polymerase, nucleotide thơng thường loại dideoxynucleotide Primer lai với vị trí tương ứng chuỗi đơn DNA theo nguyên tắc bổ sung DNA polymerase giúp bổ sung tiếp nucleotide kỹ thuật PCR Dideoxynucleotide gắn vào chuỗi DNA tổng hợp có nucleotide tương ứng theo nguyên tắc bổ sung Tuy nhiên điều xảy trình tổng hợp chuỗi DNA bị ngừng lại Ở vị trí định nào, có nucleotide bình thường dideoxynucleotide thêm vào cách ngẫu nhiên Quá trình cho phép cho phép tạo nên đoạn DNA với chiều dài khác nhau, đoạn kết thúc bời loại dideoxynucleotide Những đoạn DNA phân lập theo chiều dài điện di trình bày phần Bốn loại phản ứng khác thực cho loại nucleotide, đoạn thu từ loại phản ứng chạy điện di bên cạnh gel để vị trí đoạn so sánh với Vì band ứng với chuỗi DNA tận loại base nên trình tự DNA đọc cách quan sát thự tự band gel sau sử dụng kỹ thuật phóng xạ tự chụp (các primer có hoạt tính phóng xạ vị trí đoạn DNA phim) Trong q trình phản ứng đọc trình tự vài trăm cặp base.(hình 8) Tuy nhiên cách đọc trình tự DNA theo cách tương đối chậm, khó khăn dễ sai sót Gần kỹ thuật đọc trình tự DNA tự động (automated DNA sequenced) sử dụng hệ thống phát màu huỳnh quang (fluorescent), hóa chất phát sáng (chemiluminescent) hệ thống đo màu (colorimetric) phát triển Việc sử dụng primer dideoxynucleotide gắn huỳnh quang giúp cho phương pháp trở nên phổ biến Một mạch khuôn DNA đọc trình tự cách sử dụng phương pháp tương tự bước kéo dài primer kỹ thuật PCR Mỗi dideoxynucleotide khác gắn với loại màu huỳnh quang cho 12 phép phát phổ ánh sáng riêng Các đoạn DNA gắn huỳnh quang sau phản ứng tổng hợp điện di gel polyacrylamide mỏng sau kích thích chùm tia laser Ánh sáng phát ghi nhận qua camera kỹ thuật số (digital camera) để chuyển thành tín hiệu điện tử chuyển thành ảnh Ảnh phân tích để chuyển thành dạng đồ thị loại nucleotide khác mô tả đỉnh màu khác nhau, trình tự đỉnh màu đồ thị cho phép đọc trình tự đoạn DNA Một đoạn khoảng 500 bp 64 người khác phân tích gel vòng từ đến Phương pháp đọc trình tự tự động thực cho việc đánh giá tính chất đa hình đoạn lặp ngắn (STRP), tính đa hình đơn nucleotide (single-nucleotide polymorphism: SNP) dạng đa hình khác Một hướng đọc trình tự tự động khác mẫu DNA điện di ống thuỷ tinh nhỏ gọi ống mao dẫn (capillary) khơng phải gel polyacrylamide Vì ống mỏng lượng nhiệt tỏa trình điện di nên việc đọc trình tự diễn nhanh, kỹ thuật cho phép đọc trình tự 600 bp 96 mẫu vòng 15 phút Ngoài kỹ thuật sử dụng sắc ký khối phổ (mass spectroscopy), kỹ thuât có độ phân giải cao trước dùng để phân tích protein Sự phát triển kỹ thuật MALDI-TOF (matrixassisted laser desorption/ionization time-of-flight) cho phép phân tích hàng trăm mẫu DNA vài phút Hiện kỹ thuật thu hút nhiều quan tâm việc sử dụng để đọc trình tự DNA Bằng cách sử dụng vi tính kỹ thuật tự động làm tăng khả đọc trình tự DNA cho phép đọc trình tự tồn tỷ bp genome người Chip DNA (DNA chip) Chip DNA DNA microarray kỹ thuật để phát đột biến đặc hiệu với tốc độ nhanh, xác dựa sở phân tích đột biến vi tính Để sản xuất chip DNA, oligonucleotide đóng vai trị đoạn dị (probe) máy cài lên phiến kính nhỏ Mỗi phiến kính với diện tích khoảng 1cm2 chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại oligonucleotide khác Các oligonucleotide gồm DNA có trình tự bình thường DNA có trình tự mang đột biến 13 gây bệnh biết DNA đối tượng gắn huỳnh quang cho lai với oligonucleotide phiến kính để xác định xem chúng lai với oligonucleotide bình thường hay đột biến Mẫu lai phân tích máy vi tính để xác định DNA đối tượng bình thường hay mang loại đột biến cụ thể (hình 9) Hình 9: Sơ đồ minh hoạ chip DNA Các oligonucleotide đặt chip, sau cho tiếp xúc với DNA gắn huỳnh quang đối tượng Q trình lai xảy có oligonucleotide có trình tự nucleotide bổ sung với trình tự DNA đối tượng Ví trí phát huỳnh quang chip đánh dấu vị trí đoạn oligonucleotide chip Một ứng dụng khác chip DNA là xác định xem gene có biểu (nghĩa phiên mã) mẫu mơ khơng (ví dụ từ khối u) Người ta chiết mRNA từ mơ dùng làm khn để tạo thành đoạn DNA theo nguyên tắc bổ sung Sau đoạn đem lai phiến kính với oligonucleotide đại diện cho nhiều loại gene khác Tín hiệu lai dương tính vị trí phiến kính chứng tỏ gene biểu mẫu mô 14 ... cứu biến dị DNA thông qua nhóm máu điện di protein cho phép phát tỷ lệ nhỏ số biến dị Các kỹ thuật phân tử phát triển 20 năm qua giúp phát thêm hàng ngàn biến dị mức DNA Dưới trình bày số phương. .. trường hợp biến dị có allele dẫn đến hạn chế khảo sát biến dị di truyền Sự đa dạng tăng lên biến dị tạo nhiều allele hơn, biến dị thấy DNA tiểu vệ tinh (minisatellites) Biến dị di truyền tính... thực tế có nhiều phương pháp hịêu để đánh giá đột biến gây bệnh hồng cầu hình liềm Tuy nhiên phương pháp cịn hữu ích việc xác định nhiều loại biến dị đột biến gây bệnh khác Hiện người ta biết