Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21 1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi

Thông tin tài liệu

Luận văn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐOÁN UNG THƯ PHỔI Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN 2. GS.TSKH. NGUYỄN TÀI LƯƠNG THÁI NGUYÊN - 2013 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới PGS.TS. Lê Quang Huấn – Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; GS.TSKH. Nguyễn Tài Lương, là những người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong su ốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Di truyền và Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên. Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của Phòng Quản lý Sau đại học và Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên. Tôi cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức đã tạo đ iều kiện cho tôi trong suốt thời gian làm nghiên cứu sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ quý báu của tất cả các anh, chị em và các bạn phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Cuối cùng, tôi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả người thân trong gia đình đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận án này! Thái Nguyên, ngày tháng n ăm 2013 NCS. Lê Đình Chắc ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả là đồng tác giả với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần cũng đã được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác giả. Phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác. Thái Nguyên, ngày tháng n ăm 2013 Tác giả Lê Đình Chắc iii MỤC LỤC Mục Tên chương, phần, mục và tiểu mục Trang Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục hình ix Danh mục bảng xii Mở đầu 1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Nguồn gốc và đặc điểm ung thư 4 1.1.1. Nguồn gốc tế bào ung thư 4 1.1.2. Đặc điểm của tế bào ung thư 6 1.1.3 Ung thư ph ổi 7 1.2. Kháng nguyên CYFRA21-1 12 1.2.1. Cytokeratin 12 1.2.2. Cấu trúc của Cytokeratin 15 1.2.3. Biểu hiện của Cytokeratin 15 1.2.4. Kháng nguyên CYFRA21-1 17 1.3. Kháng thể 21 1.3.1. Một số kháng thể đang được sử dụng trong nghiên cứu và thực tiễn hiện nay 21 1.3.2. Các nghiên cứu về kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 29 1.4. Công nghệ phage display 30 1.4.1. Giới thiệu công nghệ phage display 30 1.4.2. Ứng dụng của kháng thể phage-scFv trong chẩn đoán và điều trị 31 iv Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Vật liệu 33 2.1.1. Mẫu bệnh phẩm 33 2.1.2. Sinh phẩm và hóa chất 33 2.1.3. Trang thiết bị 35 2.1.4. Phần mềm máy tính 36 2.2. Phương pháp 37 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 37 2.2.2. Các phương pháp thao tác với DNA 38 2.2.3. Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 45 2.2.4. Các kỹ thuật phage display 48 Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1. Tách dòng và xác định trình tự đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 55 3.1.1. Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi 55 3.1.2. Nhân bản đoạn gen mã hoá kháng nguyên CYFRA21-1 57 3.1.3. Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng nguyên CYFRA21-1 58 3.1.4. Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 62 3.2. Biểu hiện và thu kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.1. Nhân bản vùng mã hóa epitope kháng nguyên CYFRA21-1 64 3.2.2. Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng nguyên CYFRA21-1 66 3.2.3. Thiết kế vector biểu hiện pET-21a(+)/Cyfra21-1 67 3.2.4. Biểu hiện protein CYFRA21-1 tái tổ hợp 72 3.2.5. Tinh sạch kháng nguyên CYFRA21-1 74 3.2.6. Kết quả phân tích khối phổ protein tái tổ hợp 75 v 3.3. Gây miễn dịch gà bằng kháng nguyên CYFRA21-1 77 3.4. Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 81 3.4.1. Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương và lách của gà đã được gây miễn dịch 81 3.4.2. Nhân bản đoạn gen mã hóa vùng biến đổi của kháng thể gà đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 81 3.4.3. Quy trình tạo dòng phage biểu hiện kháng thể scFv (kháng thể phage) 85 3.4.4. Kết quả chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21-1 86 3.4.5. Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu epitope kháng nguyên CYFRA21-1 89 3.5. Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu được để định lượng kháng nguyên CYFRA21-1 91 3.6. Kết quả định lượng CYFRA21-1 trong các mẫu bệnh phẩm do bệnh viện Bạch Mai cung cấp 97 KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 101 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 103 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AML Acute Myelogenous Leukemia Amp Ampicillin APS Amoniumpersulphate cDNA complement DNA CDR Complement Determining Region CEA Carcinoembryonic Antigen CLL Chronic lymphocytic leukemia ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate DEPC Diethyl Procarbonate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtBr Ethidium Bromide FcR Frament cristallisable Recetor FDA Food and Drug Administration HCDM Human Cell Differentiation Molecules HCL Hairy cell leukemia HL Hodgkin Lymphoma HLDA Human Leukocyte Differentiation Antigens HRP horseradish peroxidase vii HT Huyết thanh IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside KN Kháng nguyên Jak Janus tyrosine kinase LAK Lymphokine activated killer LB Luria Betani mAb Monoclonal Antibody MPBS skimmed milk in PBS NHL Non-Hodgkin lymphoma NK Natural Killer NES Neuron specific enolase NRE Negative Regulatory Element NSCLC Non small cell lung carcinoma OD Optical Density PASI Psoriasis Area and Severity Index PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction PD-IPCR Phage display-IPCR PEG Polyetylene Glycol PRR Positive Regulation Region RT-PCR Revert Transcriptase - Polymerase Chain Reaction viii scFv Single chain variable fragment SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SCLC Small cell lung carcinoma TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA TEMED N, N, N’, N’ tetramethylethane-1,2-diamine TMB 3, 3’, 5, 5’ tetramethyl benzidine TPA Tissue polypeptide antigen TPBS Tween 20 in PBS TPS Tissue polypeptide specific antigen V H immunoglobulin heavy chain variable region V L immunoglobulin light chain variable region X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl- β - D-galactopyranoside UTP Ung thư phổi

Ngày đăng: 04/12/2013, 10:30

Xem thêm: Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21 1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi , Nghiên cứu tạo kháng thể tái tổ hợp đặc hiệu kháng nguyên CYFRA21 1 nhằm phát triển KIT chẩn đoán ung thư phổi