Di truyen

Đối với Pseudomonas , plasmid của chúng thường có kích thước lớn 50-100Kb , trong vòng DNA này , plasmid mang một hoặc một số gen có khả năng tổng hợp các enzym cần thiết cho qúa trì[r]

Câu : phương pháp thu nhận gen :

Khả tách gen riêng lẻ đoạn DNA tương đối không lớn chứng minh trước kỹ thuật di truyền đời Vào năm 1969 nhóm Becwitt, shapiro cơngbố cơng trình tách gen operon lactose E.coli dựa sở kết hợp phương pháp di truyền vi sinh cổ điển, phương pháp vật lý tách lai phân tử DNA

Có thể thu nhận gen cho việc thực kỹ thuật di truyền phương pháp sau :

-Tách đoạn DNA có chứa gen từ gen -Tổng hợp hố học

-Sinh tổng hợp gen từ mRNA tương ứng 1- Tách đoạn DNA có chứa gen từ bộ gen

-Đây phương pháp sử dụng rộng rãi buổi đầu kỹ thuật di truyền , toàn DNA sinh vật cắt thành những đoạn nhỏ từ 15-20000 cặp base phương pháp lắc học hay enzym cắt hạn chế rồi gắn vào vector chuyển gen để tạo plasmid tái tổ hợp

2-Tổng hợp gen phương pháp hoá học :

-Gen đầu tiên giới tổng hợp phương pháp hóa học gen tRNA - alanin nấm men, gen dài 77 cặp nucleotid, khơng có trình tự điều hồ khơng có hoạt tính Về sau người ta đã tổng hợp gen đầu tiên có hoạt tính, gen tRNA ức chế -tyrosin E.coli , gen có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotid

Việc hoàn thiện phương pháp nghiên cứu cấu trúc bậc protein sản phẩm gen đã thúc đẩy nhanh chóng việc tổng hợp nhân tạo gen

hormone somatostatin ĐV có vú biểu tế bào E.coli… Kỹ thuật di truyền đã nhanh chóng đưa gen tổng hợp hố học vào sản xuất Lần đầu tiên vào năm 1977 K.Itakura Boyer đã thành công việc cho gen tổng hợp nhân tạo mã hoá

-Câu : Phản ứng PCR( polymerase chain reaction ) Phản ứng PCR phản ứng nhân tạo thực phịng thí nghiệm, với tham gia thành phần sau : DNA làm khn : hệ gen vi sinh vật, NST tế bào, hoặc đoạn DNA nào, với lượng nhỏ, dấu vết

Oligonucleotid hay primer : chuỗi nucleotid ngắn, tổng hợp nhân tạo, bám vào vùng đặc biệt làm khuôn trượt gần lại

Enzym DNA – polymerase : sản xuất vàchuẩnđộ rồi sử dụng với liều lượng cần thiết, loại enzym chịu nhiệt cao, 95độC Hiện người ta sử dụng Taq – DNA – polymerase, enzym chiết xuất tứ loạivi khuẩn sống suối nước nóng chiu nhiệt tốt đến 96 độ C gần gen tái tổ hợp vào plasmid E.coli sản xuất theo công nghệ sinh học với số lượng lớn

PCR phản ứng nhạy xác, tỷ lệ sai sót khơng đáng kể 1/100.000 Tức 100.000 nucleotide tổng hợp có nucleotid bị nhầm lẫn

-Đoạn DNA phản ứng PCR tạo dài đến vài nghìn nucleotid, tối đa 5000 nucleotide

Quy trình phản ứng PCR :

Mỗi chu ky øtiến hành qua bước thay đổi nhiệt độ Bung liên kết (Denaturation):

94 – 95 độ Cvài chục giây đến – phút Tất thành phần tham gia phản ứng gồm DNA làm khuôn, enzym taq – DNA –

polymerase, hỗn hợp dNTP môi trường đệm cho vào ống nghiệm PCR, nhiệt độ nâng lên 94 – 95 độ C vài chục giây đến – phút Chuỗi DNA bị bung mối liên kết H2 tạo nên sợi DNA làm khuôn

Câu : Kỷ thuật gen vấn đề môi trường :

Môi trường bị ô nhiễm trầm trọng,đặc biệt chất thải công nghiệp, ảnh hưởng lớn đến mơi sinh Ngồi ra, chất thải dân dụng , rác thành phố, phế phẩm nông nghiệp…đã gây ô nhiễm nghiêm trọng môi trường sống

* Làm giải tiêu hủy khối lượng khổng lồ loại chất thải ngày chồng chất mà không ảnh hưởng đến môi trường

*Làm vô hiệu loại chất độc sinh qúa trình phân huỷ loại phế thải công nghiệp, đã gây nhiễm nghiêm trọng đất , nước, khơng khí gây nguy hiểm đến sức khoẻ người ĐV

1/ Vi sinh vật phân hủy chất thải công nghiệp

Hầu hết chất thải cơng nghiệp độc hại Chỉ tính riêng chất độc penta chlorophenol (PCP) , thải môi trường 50.000 tấn/năm , dùng hóa chất hoặc phương pháp vật lý để vô hiệu chất thải độc tốn kém lại tạo loại hình gây độc : gây nhiễm MT khơng khí, hoặc đất, hoặc nước Từ giữa những năm 1960 , việc phát số vi sinh vật sống hoại sinh đất có khả phân hủy vật chất sinh học ngoại lai (xenobiotics) đã mở hướng khai thác tận dụng vi sinh vật loại VSV sống hoại sinh đất đã góp phần không nhỏ việc phân hủy chất hữu độc tự nhiên Chúng có khả phân hủy hàng trăm hợp chất hữu khác sở sử dụng cacbon hợp chất làm ng̀n cung cấp cacbon cho q trình sinh trưởng

Ủ với primer ( Annealing):

Lúc t0 hạ xuống 37 – 65 độ C, thông thường 45 – 55 độ C thích hợp primer bám vào sợi DNA vị trí thích hợp Tổng hợp ( synthesis hay primer extension):

Khi nâng nhiệt độ lên 72 độ C, enzym DNA – polymerase hoạt hố primer để chúng trượt sợi khn, lấy dNTP môi trường bổ sung vào sợi tạo nên DNA

Thông thường sau 25 – 35 chu kỳ tốt người ta thường kéo dài bước3 thêm vài phút Cụ thể sau : ( giả sử dụng hệ gen virus làm khuôn )

Chu kỳ : 94 độ C phút 45 độ C phút 72 độ C phút Chu kỳ cuối 94 độ C phút 45 độ C phút 72 độ C phút Hướng ứng dụng kỹ thuật PCR :

- Phản ứng PCR sử dụng phổ biến tin cậy việc chẩn đoán bệnh truyền nhiễm HIV/AIDS, ung thư … -Sử dụng kỹ thuật khoa học hình sự…

-Dùng để giám định nhân chủng học … -Dùng giám định dòng họ…

-Nghiên cứu gen đột biến …

-Phản ứng PCR ứng dụng nghiên cứu khoa học phục vụ đời sống người đa dạng hiệu

độc lập , số vi khuẩn khác phải nhờ trợ giúp hoặc nhiều loại plasmid sống cộng sinh TB chất chúng Đối với Pseudomonas , plasmid chúng thường có kích thước lớn 50-100Kb , vòng DNA , plasmid mang hoặc số gen có khả tổng hợp enzym cần thiết cho qúa trình phân hủy chất hữu độc

@ Nguyên lý kỹ thuật gen ứng dụng công nghệ sinh học phân huỷ chất thải

Muốn có loại vi khuẩn có khả tổng hợp nhiều enzym, mà đa số gen tổng hợp enzym lại plasmid, có hướng giải :

-Chuyển nhiều gen vào plasmid loại vi khuẩn ( tạo plasmide đa gen)

-Chuyển gen vào vi khuẩn ( tạo quần thể plasmid đơn gen)

-Chuyển nạp quần thể plasmid đa đơn gen vào số loại vi khuẩn, từ ta có loạt vi khuẩn “cưu mang” loạt loại plasmid chứa nhiều gen tổng hợp phân huỷ khác

2/ Phân huỷ rác thải chứa cellulose tận dụng cellulose : Để tìm hiểu thực chất công nghệ sinh học ứng dụng phân huỷ rác có chứa cellulose, tận dụng cellulose, cần phân biệt cellulose theo nhóm :

-Nguồn cellulose sơ cấp : bao gồm loại thực vật thu hoạch sử dụng công nghiệp tiêu dùng : đay, gỗ …

-Nguồn cellulose phế thải nông nghiệp công nghiệp ( nguồn thứ cấp) : Phần cịn lại sau thu hoạch sản phẩm nơng nghiệp chế biến nông lâm nghiệp : rơm, rác, cây, trấu, bã mía …

-Ng̀n cellulose sau sử dụng bao gói : Bao gờm loại bìa, giấy, bao, hộp phé thải công nghiệp giấy …

- Phương pháp tổng hợp hoá học gen sử dụng để tạo nòi vi khuẩn sản sinh Isulin, hormone quan trọng để chữa bệnh tiểu đường (Diabet)

3-Sinh tổng hợp gen từ mRNA tương ứng:

-Phương pháp thu nhận gen cách cắt tồn DNA sinh vật có nhiều bất lợi : Thứ , số đoạn DNA đựơc tạo lớn, động vật có vú lên đến hàng triệu đoạn cần có hàng triệu dịng vi khuẩn mang đoạn DNA này, số có những dịng chứa đoạn DNA tương tự Thứ hai, phần lớn DNA eucaryote bậc cao dư thừa gen khơng mã hóa cho protein -Trong thực tiễn kỹ thuật di truyền người ta sử dụng rộng rãi phương pháp thứ ba tạo gen từ mRNA thông tin chúng Phương pháp dựa vào trình phiên mã ngựơc nhờ sử dụng enzyme phiên mã ngược reverse transcriptase Enzyme có tên gọi nghĩa DNA – polimerase phụ thuôc RNA ( RNA – dependent DNA – polimerase )lần đầu tiên phát nghiên cứu chép RNA virus gây ung thư Có khả tổng hợp nên DNA mạch gọi c – DNA (complementary DNA) từ khuôn mRNA hoặc từ đoạn poliribonucleotid tổng hợp hố học Nhờ enzyme revertase tổng hợp hầu gen riêng biệt miễn có mặt mRNA gen

Các c – DNA mạch đơn biến thành mạch kép nhờ DNA – polimerase gọi c – DNA kép ( c – DNA duplex) Đoạn c – DNA kép gắn vào plasmid rồi vào vi khuẩn để tạo dòng c – DNA

-Hiện nay, số lượng ngân hàng gen DNA nhiễm sắc thể c – DNA không ngừng tăng chúng nguồn cho nhà nghiên cứu, đồng thời số đáng kể thương mại hoá