Luận văn xây dựng quy trình xác định vi khuẩn verotoxigenic escherichia coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction

93 495 0

Kira Gửi tin nhắn Báo tài liệu vi phạm

Tải lên: 23,602 tài liệu

  • Loading ...
1/93 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 27/11/2013, 22:18

luận văn BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------  --------- LƯU THỊ HẢI YẾN XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ðỊNH VI KHUẨN VEROTOXIGENIC ESCHERICHIA COLI TRONG THỊT BẰNG KỸ THUẬT PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) LUẬN VĂN THẠC SỸ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. ðỖ NGỌC THÚY Hà Nội - 2011 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2011 Tác giả Lưu Thị Hải Yến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, phải kể tới sự giúp ñỡ về vật chất và tinh thần của các thầy, cô giáo, gia ñình và bạn bè của tôi. Trước hết, tôi xin ñược bày tỏ sự cảm ơn chân thành tới TS. ðỗ Ngọc Thúy – người ñã trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin ñược cảm ơn TS. Nguyễn Bá Hiên, các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật – Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã giúp ñỡ và tạo mọi ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Cù Hữu Phú, các cán bộ nghiên cứu công tác tại bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia ñã giúp ñỡ, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong quá trình thực hiện ñề tài. Cuối cùng, gia ñình và bạn bè tôi là một sự cổ vũ to lớn, là ñộng lực ñể tôi hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 28 tháng 10 năm 2011 Tác giả Lưu Thị Hải Yến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ HIỆU A/E Attaching and Effacing (Bám dính và xâm nhập) BHI Brain Heart Infusion BPW Buffer Peptone Water cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic Acid E. coli Escherichia coli FDA Food and Drug Administration (Cơ quan thực phẩm và dược phẩm Mỹ) HC Hemorrhagic colitis (Viêm ruột xuất huyết) HUS Hemolytic uremic syndrome (Hội chứng huyết niệu) LB Luria Bertani MR Methyl Red m-TSB modified Trypticase Soy Broth NB Nutrient Broth PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) TTP Thrombotic thrombocytopenic purpure (Ban xuất huyết giảm tiểu cầu) VK Vi khuẩn VP Voges-Proskauer VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm VT Verotoxin VTEC Verotoxigenic Escherichia coli WHO World Health Organisation (Tổ chức y tế thế giới) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp iv DANH MỤC BẢNG TT Tên bảng Trang 2.1. Trình tự mồi dùng ñể xác ñịnh các gen VT1, VT2 và eae 36 2.2. Thành phần các chất trong phản ứng PCR dùng ñể xác ñịnh gen VT1, VT2 và eae 37 2.3. Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR dùng ñể xác ñịnh gen VT1, VT2 và eae 37 2.4a. Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn E. coli ñối chứng dương .38 2.4b. Một số yếu tố gây bệnh chủ yếu của các chủng vi khuẩn ñối chứng âm .39 3.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR ñơn và ña mồi ñể phát hiện một số gen ñộc lực của VTEC 45 3.2. Kết quả xác ñịnh môi trường thích hợp nuôi cấy vi khuẩn ñể chiết tách DNA cho phản ứng PCR .47 3.3a. Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức ñể phát hiện các chủng vi khuẩn ñối chứng dương .48 3.3b. Kết quả thực hiện phản ứng PCR phức với các chủng vi khuẩn ñối chứng âm 49 3.4. Kết quả ñếm số hai chủng vi khuẩn ñối chứng dương trên một số môi trường nuôi cấy .51 3.5. Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phản ứng PCR trên môi trường nuôi cấy .52 3.6. Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phản ứng PCR trong mẫu thịt sạch 55 3.7. Tổng hợp số lượng và chủng loại mẫu thu thập ñược 60 3.8. Kết quả kiểm tra các ñặc tính của vi khuẩn E. coli phân lập ñược 61 3.9. Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ các mẫu thịt 63 3.10. Khả năng sản sinh ñộc tố VT của các chủng VTEC phân lập ñược 69 3.11. Kết quả xác ñịnh serotyp của các chủng VTEC phân lập ñược 70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp v DANH MỤC BIỂU, HÌNH Hình 1.1: Cơ chế tác ñộng của ñộc tố VT .16 Hình 3.1: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các chủng vi khuẩn ñối chứng dương và âm sau quá trình ñiện di 48 Hình 3.2: Kết quả ñếm số chủng FD636 trên thạch máu .51 Hình 3.3: Các sản phẩm của phản ứng PCR với các nồng ñộ pha loãng khác nhau từ môi trường LB ñã nuôi cấy chủng FD636 54 Hình 3.5: Xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm .60 Hình 3.6: Tính chất mọc của E. coli trên môi trường MacConkey 62 Hình 3.7: Tính chất mọc của E. coli trên môi trường thạch máu .62 Hình 3.8: Tính chất mọc của E. coli trên môi trường EMB 62 Hình 3.9: Tính chất mọc của E. coli trên môi trường CT-SMAC 62 Hình 3.10: Khả năng lên men sinh hơi một số loại ñường của E. coli .62 Hình 3.11: Khả năng sinh Indol của E. coli 62 Hình 3.12: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu thịt sau quá trình ñiện di 64 Biểu ñồ 3.1: Tỷ lệ phân lập vi khuẩn VTEC từ các mẫu thịt .64 Hình 3.13: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của một số mẫu thịt sau quá trình ñiện di .66 Hình 3.14: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các mẫu phân và mẫu lau .67 thân thịt sau quá trình ñiện di .67 Hình 3.15: Sản phẩm của phản ứng PCR từ các khuẩn lạc riêng biệt của mẫu phân sau quá trình ñiện di .67 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vi MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ HIỆU iii DANH MỤC BẢNG .iv DANH MỤC BIỂU, HÌNH .iv MỤC LỤC vi MỞ ðẦU .1 PHẦN I - TỔNG QUAN 3 1.1. Lịch sử nghiên cứu .3 1.2. Phân loại E. coli 6 1.3. ðặc tính của vi khuẩn E. coli 7 1.4. Verocytogenic Escherichia coli (VTEC) 12 PHẦN II - ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1. ðối tượng, ñịa ñiểm nghiên cứu 34 2.2. Nội dung nghiên cứu 34 2.3. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 34 2.4. Phương pháp nghiên cứu 35 PHẦN III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Thiết lập và chuẩn hóa phương pháp PCR .44 3.1.1. Lựa chọn giữa PCR ñơn và PCR phức 44 3.1.2. Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp ñể tách chiết DNA mẫu 46 3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng với các chủng ñối chứng .47 3.2. Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh VTEC 49 3.2.1. Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh VTEC trong môi trường nhân tạo .50 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp vii 3.2.2. Kết quả xác ñịnh ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của phương pháp PCR dùng ñể xác ñịnh VTEC trong mẫu thịt sạch 55 3.3. Quy trình xác ñịnh sự có mặt của vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt57 3. 4. Kết quả phân lập vi khuẩn VTEC trong các mẫu thịt 58 3.4.1. Kết quả áp dụng quy trình trong phân lập và xác ñịnh vi khuẩn VTEC có trong các mẫu thịt thu thập từ các chợ và lò mổ .59 3.4.2. Kết quả giám ñịnh các chủng vi khuẩn VTEC phân lập ñược 68 PHẦN IV - KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ .71 4.1. Kết luận 71 4.2. ðề nghị .71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 73 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 1 MỞ ðẦU 1. Tính cấp thiết của ñề tài Trên phạm vi thế giới, ước tính hàng năm có khoảng 2 tỷ người bị ngộ ñộc thực phẩm (ðậu Ngọc Hào, 2011). Ở Việt Nam, theo ước tính và thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) có khoảng 8 triệu người bị ngộ ñộc thực phẩm mỗi năm, trong ñó phần lớn xảy ra tại các bếp ăn tập thể, khu công nghiệp, bếp ăn của học sinh. Năm 2010, cả nước xảy ra 175 vụ ngộ ñộc thực phẩm, làm hơn 5.000 người mắc và 42 trường hợp tử vong. Thiệt hại kinh tế cho chi phí ñiều trị bệnh và nghỉ làm việc khoảng 8 triệu USD/năm (Phương Thuận, 2011). Các con số trên ñây cho thấy một thực trạng ñáng lo ngại về vấn ñề vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP). VSATTP có vai trò rất quan trọng ñối với cuộc sống con người, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe, tuổi thọ, chất lượng môi trường, chất lượng cuộc sống, phát triển kinh tế và uy tín thương hiệu sản phẩm, uy tín quốc gia. Trong những thập kỷ gần ñây, ô nhiễm vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) thuộc nhóm Verotoxygenic Escherichia coli (VTEC) sản sinh ñộc tố Verotoxin (VT) trong thực phẩm ñã trở thành ñề tài nghiên cứu của nhiều tác giả tính nghiêm trọng của các bệnh do vi khuẩn này gây ra ở người (Bergamini, 2007). Tuy nhiên, tại Việt Nam, có rất ít công trình nghiên cứu tương tự. ðộc tố VT có hai nhóm chính là VT1 và VT2 với nhiều biến thể khác nhau (Gyles và Fairbrother, 2004). ðộc tố này gây ra các loại bệnh như viêm ruột xuất huyết (HC – Hemorrhagic colitis), hội chứng huyết niệu (HUS – Haemolytic uremic syndrome), ban xuất huyết giảm tiểu cầu (TTP – Thrombotic Thrombocytopanic purpura), viêm ñường niệu (Urinary tract Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội - Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp 2 infections), viêm màng não (meningitis) (XU Jian-Guo và cs, 1999; Lake và Cressey, 2002). Vi khuẩn này có thể lây nhiễm qua nhiều ñường khác nhau, như sử dụng thực phẩm, rau xanh, nước uống bị nhiễm vi khuẩn, tiếp xúc trực tiếp với ñộng vật mang trùng, … (Võ Thành Thìn và cs, 2008). Việc xây dựng ñược một quy trình chuẩn ñể xác ñịnh vi khuẩn VTEC phù hợp với ñiều kiện phòng thí nghiệm tại Việt Nam, nhằm xác ñịnh nhanh và chính xác thịt tươi bị nhiễm vi khuẩn VTEC sẽ là nền tảng quan trọng trong chẩn ñoán và ñiều trị các trường hợp ngộ ñộc thực phẩm cũng như cho các nghiên cứu tiếp theo. vậy, chúng tôi ñã tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Xây dựng quy trình xác ñịnh vi khuẩn Verotoxigenic Escherichia coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction)”. Nghiên cứu này cho phép xác ñịnh nhanh và chính xác tiêu chuẩn vi sinh ñối với vi khuẩn VTEC trong thực phẩm, loại bỏ hoặc tiêu hủy kịp thời thực phẩm có nhiễm mầm bệnh này hoặc xác ñịnh nguyên nhân của các vụ ngộ ñộc thực phẩm do VTEC. 2. Mục tiêu nghiên cứu Xây dựng ñược một quy trình thích hợp có thể dùng ñể xác ñịnh chính xác thịt bị nhiễm vi khuẩn VTEC.
- Xem thêm -

Xem thêm: Luận văn xây dựng quy trình xác định vi khuẩn verotoxigenic escherichia coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction , Luận văn xây dựng quy trình xác định vi khuẩn verotoxigenic escherichia coli trong thịt bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction

Từ khóa liên quan

Tài liệu mới đăng

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn