MỤC LỤC TRANG CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.1 Mục tiêu cụ thể 1.3 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.4.1 Nghiên cứu lý thuyết 1.4.2 Nghiên cứu thực nghiệm 1.5 GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA 2.1.1 Lịch sử và phát triển của dứa 2.1.2 Thành phần dinh dưỡng dứa .5 2.1.3 Các bộ phận dứa có thể cho enzyme bromelain 2.1.3.1 Quả 2.1.3.2 Thân 2.1.3.3 Lá 2.1.3.4 Rễ 2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME 2.3 ENZYME PROTEASE 2.3.1 Giới thiệu sơ lược các enzyme protease .8 Trang 2.3.1.1 Protease vi sinh vật 2.3.1.2 Protease động vật 2.3.1.3 Protease thực vật 10 2.3.2 Ứng dụng của enzyme protease 10 2.4 ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA 11 2.4.1 Giới thiệu enzyme bromelain 11 2.4.2 Tính chất vật lý của enzyme bromelain 11 2.4.3 Tính chất hoá học của enzyme bromelain 12 2.4.3.1 Cấu tạo hoá học 12 2.4.3.2 Cấu trúc không gian của bromelain 13 2.4.4 Hoạt tính của enzyme bromelain 13 2.4.4.1 Cơ chế tác động 14 2.4.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain 14 2.4.5 Ứng dụng của enzyme bromelain 16 2.4.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 16 2.4.5.2 Trong y dược học 17 2.4.5.3 Một số enzyme bromelain thương mại 17 2.4.6 Tình hình nghiên cứu và ngoài nước về enzyme bromelain 18 2.4.6.1 Nghiên cứu nước 18 2.4.6.2 Nghiên cứu ngoài nước 18 2.5 KĨ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ 19 2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN 19 2.6.1 Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác 19 2.6.2 Tủa bằng dung môi hữu 20 Trang 2.6.3 Tủa bằng điểm đẳng nhiệt 20 2.6.4 Tủa bằng các loại polymer 20 2.6.5 Tủa bằng các chất đa điện phân 21 2.7 SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME 21 2.7.1 Định nghĩa enzyme cố định 21 2.7.2 Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định 21 2.7.2.1 Ưu điểm 21 2.7.2.2 Nhược điểm 22 2.7.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định 22 2.7.4 Các phương pháp cố định enzyme 23 2.7.4.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định 23 2.7.4.2 Phương pháp hấp thụ vật lí 24 2.7.4.3 Phương pháp nhốt 24 2.7.4.4 Phương pháp khâu mạch 25 2.7.5 Đặc điểm, tính chất của Natrialginate 25 2.7.6 Ứng dụng của enzyme cố định 26 2.7.6.1 Trong công nghiệp 26 2.7.6.2 Trong y học 26 2.7.6.3 Trong nghiên cứu khoa học 27 2.7.6.4 Trong bảo vệ môi trường 27 2.7.7 Tình hình nghiên cứu nước và ngoài nước 27 2.7.7.1 Tình hình nghiên cứu nước 27 2.7.7.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài 28 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .29 Trang 3.1 VẬT LIỆU 29 3.1.1 Chế phẩm enzyme thô 29 3.1.2 Hóa chất 30 3.1.3 Thiết bị 30 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 31 3.2.1 Chiết thô enzyme từ chế phẩm dứa 31 3.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô 32 3.2.2.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 33 3.2.2.2 Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano 35 3.2.3 Tách enzyme bằng các phương pháp tủa bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton(CH3COCH3) 39 3.2.3.1 Nguyên tắc 39 3.2.3.2 Phương pháp thí nghiệm tủa enzyme bằng cồn 960 39 3.2.3.3 Phương pháp thí nghiệm tủa bằng muối Ammonium sulfate 40 3.2.3.4 Phương pháp thí nghiệm tủa bằng aceton 41 3.2.4 Phương pháp xác định tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain 42 3.2.5 Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme bromelain 42 3.2.5.1 Xác định pH tối ưu cho hoạt động của bromelain 42 3.2.5.2 Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của bromelain 42 3.2.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt 43 3.2.6 Cố định enzyme bromelain chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt 43 Trang 3.2.6.1 Tạo dung dịch Natrialginate 3% 43 3.2.6.2 Tiến hành cố định 43 3.2.6.3 Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định .43 3.2.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định Natrialginate 44 3.2.7.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH 44 3.2.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 45 3.2.7.3 Khảo sát độ bền nhiệt 45 3.2.8 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định Natrialginate 45 3.2.9 Bước đầu tinh sạch enzyme bromelain chồi dứa bằng sắc ký lọc gel 46 3.2.9.1 Nguyên tắc 46 3.2.9.2 Thiết bị và hóa chất 46 3.2.9.3 Các bước tiến hành 47 3.2.9.4 Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel .49 3.2.10 Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di SDS - PAGE 49 3.2.10.1 Nguyên tắc 50 3.2.10.2 Thiết bị và hóa chất 50 3.2.10.3 Phương pháp 52 3.2.10.4 Xác định trọng lượng phân tử của protein 54 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 55 4.1 HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN DỊCH CHIẾT THÔ CÁC BỘ PHẬN TRÊN QUẢ DỨA 55 Trang 4.2 KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ CỒN 960 56 4.2.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi dịch tủa là cồn 960 56 4.2.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi dịch tủa cồn với tỉ lệ dứa : cồn 58 4.2.2.1 pH tối ưu 58 4.2.2.2 Nhiệt độ tối ưu 59 4.2.2.3 Khảo sát độ bền nhiệt 60 4.3 KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ MUỐI AMMONIUM SULFATE 61 4.3.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) 61 4.3.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi dịch tủa muối với nồng độ 60% 62 4.3.2.1 pH tối ưu 62 4.3.2.2 Nhiệt độ tối ưu 63 4.3.2.3 Khảo sát độ bền nhiệt 64 4.4 KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ ACETON (CH3COCH3) 66 4.4.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi dịch tủa là aceton (CH3COCH3) 66 4.4.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi dịch tủa aceton với tỉ lệ dứa : aceton 67 4.4.2.1 pH tối ưu 67 4.4.2.2 Nhiệt độ tối ưu 68 4.4.2.3 Khảo sát độ bền nhiệt 69 Trang 4.5 SO SÁNH VIỆC TỦA ENZYME BROMELAIN TRONG CỒN 960, MUỐI AMMONIUM SULFATE VÀ ACETON 70 4.6 CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TRÊN NATRIALGINATE 71 4.6.1 Kết quả quá trình cố định enzyme bromelain chất mang Natrialginate 71 4.6.2 Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme bromelain gel Natrialginate 71 4.6.3 So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước cố định 72 4.6.4 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định Natrialginate theo pH, nhiệt độ và độ bền nhiệt 72 4.6.4.1 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH 72 4.6.4.2 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo nhiệt độ 74 4.6.4.3 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo độ bền nhiệt 75 4.6.5 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định Natrialginate 76 4.6.6 So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước cố định và enzyme cố định Natrialginate 78 4.7 TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100 79 4.7.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước tinh sạch 79 4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel với các thông số 79 4.7.3 Tinh sạch enzyme đã tủa với cồn 960 79 4.7.4 Tinh sạch enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate 80 4.7.5 Tinh sạch enzyme đã tủa với aceton 82 4.7.6 So sánh kết quả giữa chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau đã qua quá trình sắc ký lọc gel 83 Trang 4.8 KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME BROMELAIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS - PAGE 84 4.8.1 Thành phần mẫu điện di 84 4.8.2 Kết quả điện di 84 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87 5.1 KẾT LUẬN 87 5.2 KIẾN NGHỊ 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO .I PHỤ LỤC III Trang CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần người ta dành quan tâm rất nhiều đến việc tách chiết enzyme bromelain để sử dụng làm tác nhân kích thích tiêu hóa, chữa vết thương, ổn định dịch lên men Việc nghiên cứu thành công một enzyme là ở việc chiết xuất, xác định đặt tính, yếu tố ảnh hưởng hoạt động của enzyme Việc tinh chế enzyme cần thiết bởi làm cho enzyme tinh sạch ít lẫn tạp chất (các protein không phải enzyme), nâng cao hoạt tính enzyme so với dạng thô nhiều lần, thuận lợi cho nghiên cứu, bảo quản, nguyên liệu cho một số ngành công nghệ thực phẩm và dược phẩm dùng làm thuốc điều trị và sản xuất Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme bromelain được nghiên cứu Phương pháp cố định enzyme là một những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme Bằng cách cố định enzyme chất mang không tan nước enzyme có thể tách khỏi chất dễ dàng sau phản ứng Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan enzyme Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng nhiều lĩnh vực công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nguyên liệu rất phong phú (dứa, đu đủ, ) Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp khoảng 30% quả dứa được sử dụng, lại 70% phụ phẩm mà chủ yếu là chồi quả dứa, thân dứa (Hội thảo quốc gia năm 2005) Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất thải hữu gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm bromelain bởi vì hầu tất cả các bộ phận của dứa đều có enzyme Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase Bromelain thân, chồi có thể phân hủy cả chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản phẩm bromelain thương mại được ly trích từ thân dứa Trang Trong đề tài này chúng đã tiến hành tách chiết, tinh sạch enzyme bromelain ở quy mô nhỏ Khảo sát các tác nhân tủa, xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme chồi dứa Cố định enzyme bromelain Natrialginate bằng phương pháp tủa muối Ammonium sulfate 1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Tách chiết và tinh sạch enzyme bromelain từ chồi dứa Cố định enzyme bromelain Natrialginate 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Thu nhận dịch enzyme bromelain từ các bộ phận quả dứa: chồi dứa, mắt dứa, thân dứa, cùi dứa Xác định tỉ lệ cồn 96o, nồng độ muối Ammonium sulfate và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme bromelain So sánh các tác nhân tủa của bộ phần chồi dứa sau tủa Cố định enzyme bromelain Natrialginate So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước cố định Tinh sạch enzyme bromelain Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di 1.3 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU Làm sở nghiên cứu để sản xuất enzyme bromelain từ lượng phế phẩm lớn là chồi dứa Đồng thời cố định enzyme bromelain chất Natrialginate để mang lại hiệu quả kinh tế công nghiệp Trang 10 Hoạt tính (U/g) 129.96 Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 100 80 121.34 93.37 100 117.65 90.53 120 88.78 68.31 140 43.12 33.18 160 29.86 22.98 180 17.55 13.50 Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) Thời gian ủ enzyme (phút) 60 Thời gian ủ (phút) Hình 4.18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định gel Natrialginate theo độ bền nhiệt Nhận xét: Hoạt tính enzyme bromelain cố định giảm theo thời gian ủ ở nhiệt độ tối ưu 700C Ở thời gian ủ 140 phút hoạt tính bromelain cố định giảm 66.82% Độ bền nhiệt của bromelain cố định Natrialginate được giải thích: Sau 100 phút ủ ở 70 0C chưa ảnh hưởng nhiều đến gel Natrialginate Tuy nhiên sau 120 phút ủ, gel mang enzyme bị phá vỡ làm cho enzyme bromelain được nhốt gel bị biến tính, vì vậy hoạt tính giảm nhanh sau ủ với thời gian 120 phút, và ở những thời gian ủ sau đó 4.6.5 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định Natrialginate Trang 83 Cân g enzyme cố định đem xác định số lần tái sử dụng của bromelain Natrialginate theo phương pháp mục 3.2.8 Tính hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano mục 3.2.2.2 Thu được kết quả hoạt tính của bromelain cố định qua các lần tái sử dụng bảng sau: Bảng 4.20: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme bromelain cố định qua các lần tái sử dụng Số lần lặp lại Hoạt tính (U/g) Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) 136.15 100 104.97 77.09 73.76 54.18 51.08 37.52 39.75 29.20 31.25 22.96 14.21 10.44 Trang 84 Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) Số lần tái sử dụng Hình 4.19: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định gel Natrialginate theo số lần tái sử dụng Nhận xét: Việc tái sử dụng enzyme là đặc tính quan trọng của enzyme cố định Tuy nhiên qua các lần tái sử dụng hoạt tính của enzyme bị giảm so với hoạt tính ban đầu của enzyme cố định Sự giảm hoạt tính của enzyme cố định phụ thuộc nhiều yếu tố Theo đồ thị thì hoạt tính bromelain cố định Natrialginate giảm rất nhiều so với ban đầu Ở lần tái sử dụng thứ hoạt tính bromelain 37.52% Hiệu suất tái sử dụng của bromelain cố định Natrialginate không cao có thể là chất Natrialginate kém bền với nhiệt độ và các điều kiện phản ứng Sau mỗi lần tái sử dụng, enzyme bị thất thoát nhiều, đó hoạt tính bromelain cố định giảm rất nhanh Tuy nhiên sau lần tái sử dụng hoạt tính bromelain cố định giảm ít so với những lần đầu tiên Có thể là đường kính hạt gel Natrialginate khá lớn nên với những điều kiện phản ứng tác động đến một phần hạt gel làm cho những lần tái sử dụng sau lượng enzyme hạt gel ít thất thoát nên hoạt tính bromelain cố định những lần sau giảm ít và ổn định Tuy vậy hoạt tính của những lần tái sử dụng sau vẫn thấp (hoạt tính giữ lại 10.44% sau lần tái sử dụng) 4.6.6 So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước cố định và enzyme cố định Natrialginate Trang 85 Bảng 4.21: So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu và enzyme cố định Natrialginate Thời gian ủ enzyme (phút) Phần trăm hoạt tính được giữ lại (%) Enzyme nhốt Natrialginate 60 100 100 80 92.21 93.37 100 57.31 90.53 120 35.02 68.31 140 24.74 33.18 160 14.25 22.98 180 7.28 13.50 Phần trăm hoạt tính giữ lại (%) CPE ban đầu (đã tủa với aceton) Thời gian ủ (phút) Nhận xét: Hình 4.20: Đường biểu diễn phần trăm hoạt tính bromelain còn giữ lại theo thời gian ủ Theo đồ thị, độ bền nhiệt của CPE thu được rất thấp, enzyme bromelain dường bất hoạt hoàn toàn ở thời gian ủ 180 phút (hoạt tính được giữ lại 7.28%) Trong Trang 86 đó thì enzyme bromelain được nhốt gel Natrialginate giữ được hoạt tính tốt (hoạt tính được giữ lại 13.5% sau thời gian ủ 180 phút) 4.7 TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100 4.7.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước tinh Bảng 4.22: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của chế phẩm enzyme thô (chồi dứa) trước chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 126.29 Hàm lượng (mg/g) 33.65 Hoạt tính riêng (U/mg) 3.75 4.7.2 Tinh enzyme sắc ký lọc gel với thông số Gel : Biogel P-100 Cột : 50 x 1.5 Flow adaptor : 1.5 cm Tớc đợ dịng : 0.14 ml/phút Vmẫu : 1ml Phân đoạn : 2ml/phân đoạn A280 : Độ hấp thụ protein ở bước sóng 280 nm 4.7.3 Tinh enzyme đã tủa với cồn 960 Dịch chiết của chế phẩm enzyme thô từ chồi dứa đem tủa với cồn 96 ở tỉ lệ tối ưu là : rồi đem ly tâm thu cặn, hoà cặn với 5ml đệm phosphate 0.1M pH 7, lấy dịch enzyme này cho chạy sắc ký với các thông số mục 4.7.2 Trang 87 Kết quả sau: Hình 4.21: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng cồn 960 Kết quả qua lọc gel thu được peak với thứ tự: Peak 1: Từ ống số 13 đến ống số 17 có 10 ml Peak 2: Từ ống số 25 đến ống số 50 có 52 ml Đem các peak này xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của enzyme Có kết quả sau: Bảng 4.23: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa cồn 960 sau chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 70.69 Hàm lượng (mg/g) 5.66 Hoạt tính riêng (U/mg) 12.49 4.7.4 Tinh enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate Trang 88 Dịch chiết của enzyme thô từ chồi dứa đem tủa với muối (NH4)2SO4 ở nồng độ tối ưu 60% rồi đem ly tâm thu cặn, hoà cặn với 5ml đệm phosphate 0.1M pH 7, lấy dịch enzyme này cho chạy sắc ký với các thông số mục 4.7.2 Kết quả sau: Hình 4.22: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng muối (NH4)2SO4 Kết quả qua lọc gel thu được peak sau: Từ ống số 25 đến ống số 47 có 46 ml Đem peak này xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của enzyme Có kết quả sau: Bảng 4.24: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa muối (NH4)2SO4 sau chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 62.42 Hàm lượng (mg/g) 5.45 Hoạt tính riêng (U/mg) 11.45 4.7.5 Tinh enzyme đã tủa với aceton Trang 89 Dịch chiết của chế phẩm enzyme thô từ chồi dứa đem tủa với aceton ở tỉ lệ tối ưu là : rồi đem ly tâm thu cặn, hoà cặn với 5ml đệm phosphate 0.1M pH 7, lấy dịch enzyme này cho chạy sắc ký với các thông số mục 4.7.2 Kết quả sau: Hình 4.23: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng Aceton Kết quả qua lọc gel thu được peak với thứ tự: Peak 1: Từ ống số 15 đến ống số 21 có 14 ml Peak 2: Từ ống số 22 đến ống số 34 có 26 ml Đem các peak này xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của enzyme Bảng 4.25: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng aceton sau chạy sắc ký Hoạt tính (U/g) 76.11 Hàm lượng (mg/g) 5.73 Hoạt tính riêng (U/mg) 13.28 4.7.6 So sánh kết quả chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau đã qua trình sắc ký lọc gel Trang 90 Cách tính độ tinh sạch và hiệu suất về hoạt tính enzyme đã trình bày ở mục 3.2.9.3 Bảng 4.26: Kết quả tinh sạch enzyme bormelain của chồi dứa HT (U/ HL HTR g) (mg/g) (U/mg) Độ tinh Hiệu sạch (lần) suất (%) 126.29 33.65 3.75 100 Tủa cồn sau sắc ký 70.69 5.66 12.49 3.33 55.97 Tủa muối sau sắc ký 76.11 5.73 13.28 3.54 60.27 Tủa aceton sau sắc ký 62.42 5.45 1.45 3.05 49.43 Độ tinh Chế phẩm enzyme thô Hình 4.24: Đồ thị so sánh độ tinh sạch enzyme bromelain với các tác nhân tủa khác Nhận xét: Sau tinh sạch enzyme ta thấy độ tinh sạch enzyme bromelain tủa bằng muối gấp 1.06 lần enzyme tủa bằng cồn và gấp 1.16 lần enzyme tủa bằng aceton Qua kết quả ta thấy được tủa bằng muối thì hiệu quả tinh sạch cao tủa bằng cồn và aceton 4.8 KẾT QUẢ PHÂN TÁCH HỆ ENZYME BROMELAIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI SDS - PAGE 4.8.1 Thành phần mẫu điện di Trang 91 Dịch enzyme sau tủa đã qua tinh sạch bằng sắc ký lọc gel, cụ thể là pick có hoạt tính cao nhất Các dịch enzyme với thang chuẩn được chuẩn bị và cho vào các giếng để chạy điện di lúc 4.8.2 Kết quả điện di Các bước tiến hành chạy điện di được trình bày ở mục 3.2.10.2 Kết quả sau: KDa 97.4 66.2 45 31 21.5 14.4 Hình 4.25: Kết quả điện di enzyme bromelain 1: Thang chuẩn protein 2: Dịch chiết tủa bằng muối đã qua sắc ký 3: Dịch tủa bằng cồn đã qua sắc ký 4: Dịch tủa bằng aceton đã qua sắc ký Bảng 4.27: Giá trị Rf và LogM của thang chuẩn D (cm) Rf 0.7 2.5 3.7 5.4 6.7 7.7 0.080 0.284 0.420 0.614 0.761 0.875 Trang 92 LogM 4.988 4.820 4.653 4.491 4.332 4.158 M (Da) 97400 66200 45000 31000 21500 14400 Hình 4.26: Đồ thị tương quan giữa LogM của protein thang chuẩn với Rf Sau đó chúng ta tiến hành xây dựng phương trình quy tuyến liên quan giữa Rf và Log10M của protein thang chuẩn bằng phần mềm Excel và có được phương trình hồi quy sau: y = - 1.024x + 5.091 Trong đó: Y= LogM : Trọng lượng phân tử protein X=Rf (protein) (Rf là tỉ số giữa khoảng cách di chuyển của protein và khoảng cách di chuyển của phẩm màu Bromphenol Blue) Theo kết quả điện di đồ và áp dụng phương trình hồi quy, ta có bảng sau: Bảng 4.28: Trọng lượng phân tử của enzyme tủa bằng muối và đã qua sắc ký D (cm) Rf 4.6 5.1 0.523 0.580 Trang 93 Y 4.555 4.497 M (Daltons) 35892 31405 Bảng 4.29: Trọng lượng phân tử của enzyme tủa cồn 960 và đã qua sắc ký D (cm) 4.9 Rf 0.557 Y 4.521 M (Daltons) 33189 Bảng 4.30: Trọng lượng phân tử của enzyme tủa bằng aceton và đã qua sắc ký D (cm) 4.7 4.9 Rf 0.534 0.557 Y 4.544 4.521 M (Daltons) 34994 33189 Qua điện di đồ ta xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain của dứa khoảng 31405 – 35892 Daltons Trang 94 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN  Từ kết quả thu qua thí nghiệm ta rút kết luận sau: Đối với các bộ phận quả dứa như: chồi dứa, mắt dứa, thịt dứa và cùi dứa thì chồi quả dứa là bộ phận cho hoạt tính enzyme bromelain cao nhất Tỷ lệ tác nhân tủa enzyme cho hoạt tính enzyme bromelain cao nhất: - Cồn 960 : - Muối (NH4)2SO4 60% - Aceton : Trong đó với tác nhân tủa là muối (NH 4)2SO4 thu được enzyme bromelain cho hoạt tính cao nhất ( nồng độ muối 60% thu enzyme có hoạt tính 338.99 U/g)  Enzyme bromelain thu có đặc tính sau  Đối với dịch enzyme tủa cồn 960 tỉ lệ tới ưu : có: Hoạt tính riêng: U/mg pH tối ưu: Nhiệt độ tối ưu: 600C Độ bền nhiệt: % hoạt tính được giữ lại ủ enzyme ở 180 phút 7.28 %  Đối với dịch enzyme tủa muối (NH4)2SO4 nồng độ tối ưu 60% có: Hoạt tính riêng: 4.34 U/mg pH tới ưu: Trang 95 Nhiệt độ tối ưu: 500C Độ bền nhiệt: % hoạt tính được giữ lại ủ enzyme ở 180 phút 5.48 %  Đối với dịch enzyme tủa aceton tỉ lệ tối ưu : có: Hoạt tính riêng: 2.95 U/mg pH tới ưu: Nhiệt độ tối ưu: 600C Độ bền nhiệt: % hoạt tính được giữ lại ủ enzyme ở 180 phút 8.38 %  Enzyme bromelain nhốt chất mang Natrialginate Hoạt tính riêng: 2.31 U/mg pH tối ưu: Nhiệt độ tối ưu:700C Độ bền nhiệt: % hoạt tính được giữ lại ủ enzyme ở 180 phút 13.5 % Số lần tái sử dụng: % hoạt tính được giữ lại sau lần tái sử dụng 10.44 %  Sau qua sắc ký Hiệu suất về hoạt tính dịch tủa cồn được tinh sạch so với chế phẩm thô là 55.97% Độ tinh sạch của enzyme tăng lên 3.33 lần so với chế phẩm thô Hiệu suất về hoạt tính dịch tủa muối (NH 4)2SO4 được tinh sạch so với chế phẩm thô là 60.27% Độ tinh sạch của enzyme tăng lên 3.54 lần so với chế phẩm thô Hiệu suất về hoạt tính dịch tủa aceton được tinh sạch so với chế phẩm thô là 49.43 % Độ tinh sạch của enzyme tăng lên 3.05 lần so với chế phẩm thô Trang 96 5.2 KIẾN NGHỊ Khảo sát thêm các phương pháp tủa lắng tủa đẳng điện, và lắng tủa bằng các chất đa điện phân Tiến hành thử nghiệm các phương pháp khác để loại muối khỏi chế phẩm, để thu được enzyme bromelain có độ tinh sạch cao Tiến hành chạy sắc ký với các loại gel khác Bio-Gel P-100 nhằm tìm loại gel tốt nhất để phân tích enzyme bromelain cho kết quả tinh sạch Tinh sạch tiếp tục enzyme bromelain bằng sắc ký trao đổi ion sau qua sắc ký lọc gel Nghiên cứu tạo gel Natrialginate với các kích thước khác để thu được hạt gel cho hiệu suất cố định hoạt tính bromelain cao nhất Tiến hành cố định enzyme bromelain bằng các phương pháp cố định khác nhằm tìm phương pháp tốt nhất Trang 97 ... bromelain từ chồi dứa Cố định enzyme bromelain Natrialginate 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Thu nhận dịch enzyme bromelain từ các bộ phận quả dứa: chồi dứa, mắt dứa, thân dứa, cùi dứa Xác định... chủ yếu là từ vi sinh vật ( Nguyễn Tiến Thắng, 2004) 2.4 ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA 2.4.1 Giới thiệu enzyme bromelain Bromelain là enzyme có nhiều quả dứa, được phát từ giữa kỉ... và enzyme cố định Natrialginate 78 4.7 TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100 79 4.7.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước tinh sạch 79 4.7.2 Tinh sạch enzyme