Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn nghiên cứu tạo chế phẩm Lactobacillus acidophilus - Chương 3.
Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ‐ 42 ‐ Chương 3: Kết bàn luận 3.1 Luận văn tốt nghiệp Đặc điểm hình thái Lactobacillus acidophilus 3.1.1 Hình dạng khuẩn lạc Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc L.acidophilus Sau phân lập chọn giống môi trường MRS – agar, L.acidophilus có khuẩn lạc màu trắng đục, tròn, nhô cao, đường kính khuẩn lạc 0,9 – 1,2 mm, rìa khuẩn lạc trơn bề mặt khuẩn lạc khô 3.1.2 Hình dạng tế bào Hình 3.2: Hình dạng tế bào L.acidophilus kính hiển vi điện tử Tiến hành nhuộm gram quan sát kính hiển vi có độ phóng đại 100X Kết nhuộm gram cho thấy chủng phân lập giữ phức chất violet crystal lugol nên có màu tím Vì vậy, L.acidophilus vi khuẩn gram dương, hình que, đứng riêng lẻ hay tập trung thành sợi ngắn ‐ 43 ‐ Chương 3: Kết bàn luận 3.2 Luận văn tốt nghiệp Các đặc tính sinh lý sinh hoá L.acidophilus 3.2.1 Khả sinh acid Hình 3.3: Khả sinh acid làm phân giải CaCO3 Sau 48 nuôi môi trường CaCO3 – agar, kết cho thấy L.acidophilus có khả làm phân giải CaCO3 tạo thành vòng tan suốt xung quanh khẩn lạc trắng đục CaCO3 Như vậy, trình sinh trưởng phát triển, vi khuẩn L.acidophilus sử dụng glucose môi trường carbonate – agar sinh acid lactic ‐ 44 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp 3.2.2 Khả sinh acid lactic Hình 3.4: Phản ứng với thuốc thử Uphenmen Ống nghiệm số chứa dung dịch nuôi vi khuẩn sau 15 làm đổi màu thuốc thử Uphenmen từ màu xanh tím sang vàng rơm trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn L.acidophilus sinh acid lactic, phù hợp với ống nghiệm số chứa acid lactic làm đổi màu thuốc thử Uphenmen Hai ống nghiệm số số chứa nước cất môi trường huyết sữa, không chứa acid lactic nên không làm đổi màu thuốc thử Uphenmen Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy vi khuẩn L.acidophilus có khả sinh acid lactic ‐ 45 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp 3.2.3 Khả lên men nguồn carbonhydrate Hình 3.5: Khả lên men nguồn carbonhydrate L.acidophilus ĐC: mẫu đối chứng Glu: glucose; Fruc: fructose; Lac: lactose; Sac: saccharose; Mal: maltose; Man: mannose; Sor: sorbitol; Dex: dextrose; Gly: glycerol Kết thí nghiệm cho thấy ống nghiệm chứa glucose, fructose, lactose, saccharose maltose làm chất thị phenol red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng Điều chứng tỏ chủng L.acidophilus sử dụng nguồn đường môi trường nuôi cấy để sinh acid lactic làm môi trường giảm pH dẫn đến đổi màu chất thị phenol red Các ống nghiệm lại chứa loại đường mannose, sorbitol, dextrose glycerol không bị đổi màu chủng L.acidophilus không sử dụng nguồn đường nên pH không thay đổi để làm đổi màu chất thị pH môi trường phenol red Kết thí nghiệm đạt giống với kết nghiên cứu Adrian Vamanu cộng (2005) khả sử dụng nguồn carbonhydrate Lactobacillus sp Như vậy, L.acidophilus sử dụng nguồn đường sau: glucose, fructose, lactose, saccharose maltose ‐ 46 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp 3.2.4 Quan hệ với oxy Hình 3.6: Quan hệ với oxy L.acidophilus Sau 48 nuôi cấy, khuẩn lạc L.acidophilus xuất dọc theo vết cấy từ đáy ống nghiệm lên bề mặt thạch Như L.acidophilus vi khuẩn kỵ khí tuỳ tiện ‐ 47 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp 3.2.5 Khả tăng trưởng L.acidophilus pH khác Hầu hết vi khuẩn có pH tối ưu cho trình sinh trưởng phát triển pH trung tính Sự tăng giảm pH (chính tăng giảm ion H+) môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sống sót vi sinh vật nói chung Khảo sát tăng trưởng Lactobacillus acidophilus môi trường huyết sữa pH khác từ pH 3,5 đến pH 8,0 Kết sau: 7.2 log(cfu/ml) 6.8 6.6 6.4 6.2 3.5 pH Hình 3.7 : Khả tăng trưởng L.acidophilus giá trị pH khác môi trường nuôi cấy Dựa vào hình 3.7 ta thấy vi khuẩn L.acidophilus có khả tăng trưởng tốt khoảng pH môi trường nuôi cấy từ pH 5,0 đến pH 7,0 Và pH tối thích cho giống vi khuẩn môi trường huyết sữa 6,6 ‐ 48 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp 3.2.6 Khả tăng trưởng L.acidophilus nhiệt độ khác Tốc độ phản ứng sinh hoá xảy tế bào phụ thuộc vào hoạt tính enzyme tế bào vi sinh vật Trong số trường hợp, nhiệt độ tăng trưởng tối ưu cho số vi sinh vật nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzyme tham gia vào phản ứng sinh hoá xảy tế bào vi sinh vật Ở nhiệt độ thấp ức chế hoạt tính enzyme Ngược lại, nhiệt độ cao enzyme bị biến tính không thuận nghịch Vì nhiệt độ cao hay thấp ảnh hưởng tới phát triển vi sinh vật Khảo sát tăng trưởng L.acidophilus môi trường huyết sữa giá trị nhiệt độ khác nhau, ta kết sau: 7.4 7.2 log(cfu/ml) 6.8 6.6 6.4 6.2 20 30 37 40 50 toC Hình 3.8: Khả tăng trưởng L.acidophilus môi trường nuôi cấy giá trị nhiệt độ khác Dựa vào hình 4.8 ta thấy khoảng nhiệt độ thích hợp cho phát triển L.acidophilus từ 30oC đến 40oC Và nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn phát triển môi trường huyết sữa 37oC ‐ 49 ‐ Chương 3: Kết bàn luận 3.3 Luận văn tốt nghiệp Xây dựng đường cong sinh trưởng Lactobacillus acidophilus môi trường huyết sữa Hình 3.9: Đường cong sinh trưởng L.acidophilus môi trường huyết sữa Dựa vào kết đường cong tăng trưởng L.acidophilus hình 4.1 ta thấy: môi trường huyết sữa, vi khuẩn L.acidophilus có pha lag kéo dài khoảng – với µ = 0,219, pha log kéo dài khoảng – 10 với µ = 1,03, pha ổn định thứ 14 – 16 Như dựa vào đường cong tăng trưởng ta thu sinh khối thứ 15 ‐ 50 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghieäp y = 3.76x + 2.43 log(cfu/ml) 8.25 R2 = 0.986 7.75 7.25 6.75 1.2 1.25 1.3 1.35 1.4 1.45 OD570nm 1.5 1.55 1.6 Hình 3.10: Mối tương quan tuyến tính mật độ tế bào độ đục ‐ 51 ‐ 1.65 Chương 3: Kết bàn luận 3.4 Luận văn tốt nghiệp Tối ưu hoá môi trường nuôi cấy L.acidophilus 3.4.1 Xác định ảnh hưởng nhân tố sinh trưởng đến phát triển Lactobacillus acidophilus Huyết sữa môi trường lý tưởng để nhân giống vi khuẩn lactic Tuy nhiên tỷ lệ hàm lượng chất dinh dưỡng cân đối so với sữa tươi Đặc biệt hàm lượng phosphate huyết sữa thấp, từ tính đệm môi trường bị giảm Hơn nữa, hàm lượng môt số nguyên tố đa lượng vi lượng khác huyết sữa thấp so với sữa tươi Để khắc phục nhược điểm này, ta bổ sung thêm peptone, yeast extract K2HPO4 vào huyết sữa Khảo sát ảnh hưởng nhân tố sinh trưởng đến phát triển Lactobacillus acidophilus với hàm lượng nhân tố sinh trưởng khác nhau, ta thu kết sau: 8.5 log(cfu/ml) 7.5 6.5 0.6 0.8 1.2 Hàm lượng peptone (%) Hình 3.11: Ảnh hưởng hàm lượng peptone đến tăng trưởng L.acidophilus ‐ 52 ‐ 1.4 Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp log(cfu/ml) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 Hàm lượng yeast extract (%) Hình 3.12: Ảnh hưởng hàm lượng yeast extract đến tăng trưởng L.acidophilus 8.5 log(cfu/ml) 7.5 6.5 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 Hàm lượng K2HPO4 (% ) Hình 3.13: Ảnh hưởng hàm lượng K2HPO4 đến tăng trưởng L.acidophilus ‐ 53 ‐ 0.35 Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp Dựa vào hình 4.11, 4.12, 4.13 ta thấy haøm lượng peptone, yeast extract, K2HPO4 bổ sung vào môi trường huyết sữa khoảng 0,62%, 0,9%, 0,32% so với thể tích mơi trường thích hợp để thu sinh khối vi khuẩn 3.4.2 Tối ưu hoá thành phần môi trường huyết sữa nuôi cấy L.acidophilus phương pháp thực nghiệm Xác định điều kiện tối ưu để thu sinh khối vi khuẩn L.acidophilus cực đại, ta tiến hành tối ưu hoá môi trường theo phương pháp thực nghiệm, cách tiến hành sau: - Xét k = nhân tố ảnh hưởng đến phát triển L.acidophilus (hàm lượng - peptone, hàm lượng yeast extract, hàm lượng K2HPO4) Ta tiến hành thí nghiệm n = mức giá trị nhân tố - Vậy số thí nghiệm cần thực là: (thí nghiệm) - Hàm mục tiêu Y sinh khối vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (cfu/ml) Bảng 3.1: Mức biến thiên nhân tố sinh trưởng Các mức Các nhân tố sinh trưởng Mức sở 0,62 0,90 0,32 Khoảng biến thiên 0,18 0,20 0,04 Mức 0,80 1,10 0,36 Mức 0,44 0,70 0,28 Trong đó: : hàm lượng peptone bổ sung vào môi trường huyết sữa (% so với môi trường) : hàm lượng yeast extraxt bổ sung vào môi trường huyết sữa (% so với môi trường) : hàm lượng K2HPO4 bổ sung vào môi trường huyết sữa (% so với môi trường) ‐ 54 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp Bảng 3.2: Bố trí kết thí nghieäm Y1 106 Y2 106 Y3 106 106 STT Z1 0,8 1,10 0,36 12,972 11,246 12,218 12,145 0,8 1,10 0,28 78,524 62,806 46,105 62,478 0,8 0,70 0,36 5,358 5,012 5,572 5,314 0,8 0,70 0,28 6,109 9,183 8,035 7,776 0,44 1,10 0,36 34,674 38,019 40,926 37,873 0,44 1,10 0,28 324,34 97,724 114,815 178,96 0,44 0,70 0,36 19,011 22,803 14,355 18,723 0,44 0,70 0,28 31,477 38,905 36,308 35,563 Z2 Z3 Bảng 3.3: Chuyển sang hệ trục toạ độ không thứ nguyên STT x0 x1 x2 x3 106 + + + + 12,145 + + + - 62,478 + + - + 5,314 + + - - 7,776 + - + + 37,873 + - + - 178,96 + - - + 18,723 + - - - 35,563 ‐ 55 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp Bảng 3.4: Hệ số phương trình hồi quy b0 b1 b2 b3 44,854 -22,926 28,01 -26,34 - Ta có phương trình hồi quy tổng quát sau: Bảng 3.5: Thí nghiệm tâm phương án STT 124,165 128,233 - Yo 106 Ytb 106 107,647 1012 (Yo – Ytb)2 1012 17,223 67,536 120,015 118,863 10,902 152,967 Kiểm tra có nghóa phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student: STT 44,854 11,635 -22,926 5,947 28,01 -26,34 3,855 7,266 6,833 Tra bảng tp(f) với p = 0,05; bậc tự df = N(k – 1) = 8(3-1) = 16 Ta có t(0,05;16) = 2,12 Các hệ số phương trình hồi quy có nghóa khí tj > tp(f) Như vậy, tất hệ số phương trình hồi quy có nghóa Ta có phương trình hồi quy sau: ‐ 56 ‐ Sth 106 Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 57 ‐ Chương 3: Kết bàn luận - Luận văn tốt nghiệp Kiểm tra tương thích phương trình so với thực tế: STT Y 106 Y* 106 (Y – Y*)2 1012 12,145 23,598 62,478 76,278 109,642 5,314 -32,422 1423,93 7,776 20,258 155,95 37,873 69,45 997,107 178,96 122,13 3229,649 18,723 13,43 27,984 35,563 66,11 F 131,125 106 951,106 1756,623 14,779 Tra baûng F0,95(4,2) = 19,3 Ta thaáy F = 14,779 < F0,95(4,2) = 19,3 nên phương trình hồi quy tương thích với thực tế 3.4.3 Tối ưu hoá thành phần môi trường huyết sữa nuôi cấy L.acidophilus theo phương pháp đường dốc Bảng 3.6: Các giá trị hệ số phương trình hồi quy mức biến thiên STT bj j -22,926 0,18 4,127 28,01 0,20 5,602 -26.34 0,04 1,054 Chọn bước nhảy ‐ 58 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp Xác định bước nhảy lại: Quá trìn tối ưu hoá bắt đầu thí nghiệm mà giá trị biến số ấn định mức sở, toạ độ xác định theo công thức: (với j = 1, 2, 3) Bảng 3.7: Kết thí nghiệm tối ưu hoá môi trường theo phương pháp leo dốc Y1 106 Y2 106 Y3 106 106 STT Z1 Z2 Z3 0,62 0,90 0,32 0,745 0,107 0,352 334,195 374,973 762,079 490,416 0,87 1,24 0,384 587,789 639,735 554,626 0,995 1,41 0,416 309,742 399,025 353,997 354,255 1,12 1,58 0,448 283,792 215,278 254,097 251,056 1,245 1,75 0,48 103,753 129,42 111,173 114,782 1,37 1,92 0,512 51,523 25,942 29,512 35,659 1,495 2,09 0,544 15,631 20,323 26,062 20,672 206,538 304,789 317,687 276,338 ‐ 59 ‐ 593,95 Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp y 600 500 400 300 200 100 TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 Hình 3.14: Kết thí nghiệm tối ưu hoá môi trường theo phương pháp leo dốc Như vậy, để thu sinh khối vi khuẩn cực đại ta chọn thành phần môi trường huyết sữa theo tỷ lệ sau: Peptone: 0,87% so với môi trường Yeast extract: 1,24% so với môi trường K2HPO4: 0,384% so với môi trường ‐ 60 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp 4.5 Đánh giá hiệu phương pháp sấy phun 10 log(cfu/ml) 9.6 9.2 Tr ước sấy phun Sau sấy phun 8.8 8.4 Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Mẫu Hình 3.15: Mật độ tế bào vi khuẩn trước sau sấy phun Sau tiến hành sấy phun thu kết sau: Tỷ lệ tế bào sống sót sau sấy phun mẫu thí nghiệm với công thức chất vi bao khác 10,05%; 13,41%, 34,33%; 40,72%, 63,45%, 54,14% Như với công thức sấy phun mẫu số cho tỷ lệ tế bào L.acidophilus sống sót cao Điều chứng tỏ phương pháp tạo probiotic sấy phun với công thức mẫu số tối ưu Qua nhận thấy rằng, hàm lượng sữa gầy 20% vi bao tốt so với hàm lượng sữa gầy 15% Ngoài ra, muối có tác dụng giúp tế bào chống chịu với nhiệt độ nên làm tăng tỷ lệ sống sót Tuy nhiên lượng muối cao ức chế vi sinh vật làm giảm tỷ lệ sống sót tế bào Ngoài ra, độ ẩm mẫu sấy phun có ý nghóa quan trọng Nếu độ ẩm thấp tỷ lệ sống sót vi sinh vật giảm nhanh Theo Ananta.E (2004) độ ẩm mẫu sấy phun tối thiểu 7% để đảm bảo ảnh hưởng tới tỷ lệ sống sót vi khuẩn chế phẩm Như mẫu sấy phun có độ ẩm > 6% đạt yêu cầu ‐ 61 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp ‐ 62 ‐ ... + + 37 ,8 73 + - + - 178,96 + - - + 18,7 23 + - - - 35 ,5 63 ‐ 55 ‐ Chương 3: Kết bàn luận Luận văn tốt nghiệp Bảng 3. 4: Hệ số phương trình hồi quy b0 b1 b2 b3 44,854 -2 2,926 28,01 -2 6 ,34 - Ta... 18,7 23 0,44 0,70 0,28 31 ,477 38 ,905 36 ,30 8 35 ,5 63 Z2 Z3 Bảng 3. 3: Chuyển sang hệ trục toạ độ không thứ nguyên STT x0 x1 x2 x3 106 + + + + 12,145 + + + - 62,478 + + - + 5 ,31 4 + + - - 7,776 + - +... 109,642 5 ,31 4 -3 2,422 14 23, 93 7,776 20,258 155,95 37 ,8 73 69,45 997,107 178,96 122, 13 3229,649 18,7 23 13, 43 27,984 35 ,5 63 66,11 F 131 ,125 106 951,106 1756,6 23 14,779 Tra baûng F0,95(4,2) = 19 ,3 Ta