BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP XÁC ĐỊNH MƠI TRƯỜNG KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM CỦA VI KHUẨN LACTIC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƯƠNG Sinh viên thực MSSV: 1051110045 : PHAN THỊ NGỌC ÁI Lớp: 10DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2014 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu “Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm vi khuẩn lactic” tơi thực Các số liệu kết luận nghiên cứu trình bày đồ án chƣa đƣợc công bố nghiên cứu khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nghiên cứu Tp.Hồ Chí Minh, 8/2014 Sinh viên thực Phan Thị Ngọc Ái Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn toàn thể quý thầy cô trƣờng Đại học Công Nghệ Tp.HCM tận tình dạy bảo em năm học vừa qua Xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi Trƣờng trƣờng Đại học Công Nghệ Tp.HCM quan tâm bảo, nhiệt tình giảng dạy cung cấp kiến thức quý báo cho em suốt thời gian học tập trƣờng Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Nguyễn Hồi Hƣơng định hƣớng, tận tình hƣớng dẫn quan tâm theo dõi em suốt trình làm đồ án tốt nghiệp Em xin cảm ơn thầy quản lý phịng thí nghiệm tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thời gian giúp em hoàn thành tốt đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến tất bạn lớp 10DSH01 bạn thực đề tài phịng thí nghiệm đồng hành tơi suốt quãng đời sinh viên, động viên tinh thần giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Cuối em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị em, ngƣời bên cạnh chia sẻ, quan tâm, kịp thời cổ vũ động viên tinh thần, giúp em có thêm nghị lực để hoàn thành tốt đồ án Với khuôn khổ đồ án không tránh khỏi thiếu sót, mong đƣợc đóng góp giúp đỡ quý thầy cô Em xin chân thành cảm ơn! Tp Hồ Chí Minh, 8/2014 Sinh viên thực Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Độc tố nấm tiết 1.1.3 Tác hại nấm 1.1.4 Một số chủng nấm mốc gây độc cho thực phẩm 1.1.5 Các biện pháp chống nấm sau thu hoạch 13 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 15 1.2.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 15 1.2.2 Sản phẩm trao đổi chất ứng dụng vi khuẩn lactic 29 1.2.3 Khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 30 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 Địa điểm nghiên cứu 37 2.2 Thời gian thực 37 2.3 Vật liệu nghiên cứu 37 2.3.1 Giống vi sinh vật 37 2.3.2 Hóa chất mơi trường sử dụng 37 2.4 Thiết bị dụng cụ 38 2.4.1 Thiết bị 38 2.4.2 Dụng cụ 38 2.5 Phƣơng pháp luận 38 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu 40 2.6.1 Sơ đồ nghiên cứu 40 2.6.2 Thí nghiệm khẳng định chủng vi khuẩn lactic tính khiết 41 2.6.3 Xác định mơi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm 42 i Đồ án tốt nghiệp 2.6.4 Khảo sát khả kháng nấm Aspergillus niger chủng vi khuẩnlactic 48 2.6.5 Phương pháp định danh tuyển chọn 50 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 53 3.1 Định danh sơ khảo sát sinh lý – sinh hóa khiết chủng vi khuẩn lactic 53 3.1.1 Nhuộm Gram 53 3.1.2 Nhuộm bào tử 54 3.1.3 Thử nghiệm khả sinh acid lactic thuốc thử Uffelmann 55 3.1.4 Kiểm tra khả lên men đường khả sinh khí 55 3.1.5 Xác định hàm lượng acid tổng 57 3.2 Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính nấm 58 3.2.1 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng ảnh hưởng lên sinh khối vi khuẩn lactic 59 3.2.2 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả tăng trưởng nấm mốc 60 3.3 Khảo sát khả kháng Aspergillus niger chủng vi khuẩn lactic 70 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74 4.1 Kết luận 74 4.2 Kiến nghị 74 PHỤ LỤC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số chủng nấm Aspergillus độc thƣờng gặp thực phẩm độc tố vi nấm chúng sinh Bảng 1.2 Chủng nấm mốc Fusarium độc tố 10 Bảng 1.3 Một số chủng nấm Penicillium độc tố chúng 12 Bảng 1.4 Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler Weiss, 1986) 19 Bảng 1.5 Một số hợp chất xác định có tiềm kháng nấm mốc nấm men 31 Bảng 1.6 Các loài LAB khác sản xuất chất kháng nấm 33 Bảng 3.1 % acid lactic chủng LAB 24 nuôi cấy 57 Bảng 3.2 Kết định danh sơ chủng phân lập 58 Bảng 3.3 Bảng theo dõi mật độ quang vi khuẩn acid lactic môi trƣờng 59 Bảng 3.4 Đƣờng kính (cm) đặc điểm nấm Mucor sp.B1 môi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 60 Bảng 3.5 Khả phát triển nấm Mucor sp.B1 môi trƣờng nuôi cấy 62 Bảng 3.6 Đƣờng kính (cm) đặc điểm nấm Aspergillus sp.X2 môi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 64 Bảng 3.7 Khả phát triển nấm Aspergillus sp.X2 môi trƣờng nuôi cấy 65 Bảng 3.8 Đƣờng kính (cm) đặc điểm nấm Aspergillus sp.Đ1 môi trƣờng MRS cổ điển, MRS 1, MRS 2, MRS 67 Bảng 3.9 Khả phát triển nấm Aspergillus sp.X2 môi trƣờng nuôi cấy 68 Bảng 3.10 Tỉ lệ ức chế cực đại vi khuẩn Lactobacillus sp.L5 71 iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Chủng nấm Aspergillus Hình 1.2 Chủng nấm Fusarium 10 Hình 1.3 Chủng nấm Penicillium 11 Hình 1.4 Hình dạng tế bào Lactobacillus 18 Hình 1.5 Hình dạng tế bào Streptococcus 20 Hình 1.6 Hình dạng tế bào Leuconostoc 21 Hình 1.7 Hình dạng tế bào Pediococcus 22 Hình 1.8 Hình dạng tế bào Bifidobacterium 23 Hình 1.9 Sơ đồ tổng quan nghiên cứu khả kháng nấm vi khuẩn lactic 36 Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu xác định môi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm 40 Hình 2.2 Sơ đồ khẳng định chủng vi khuẩn lactic tính khiết chúng 41 Hình 2.3 Sơ đồ chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào sinh khối vi khuẩn lactic 44 Hình 2.4 Sơ đồ chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả tăng trƣởng nấm mốc 46 Hình 2.5 Sơ đồ khảo sát khả kháng nấm Aspergillus niger chủng vi khuẩn lactic 48 Hình 3.1 Kết nhuộm Gram chủng vi khuẩn 54 Hình 3.2 Kết nhuộm bào tử chủng vi khuẩn 54 Hình 3.3 Khả sinh acid lactic chủng vi khuẩn 55 Hình 3.4 Khả lên men đƣờng vi khuẩn lactic 56 Hình 3.5 Đồ thị biểu % acid lactic sinh chủng vi khuẩn lactic sau 24 nuôi cấy 57 Hình 3.6 Đƣờng kính (cm) nấm Mucor sp.B1 môi trƣờng ngày nuôi cấy 63 Hình 3.7 Đƣờng kính trung bình (cm) nấm Aspergillus sp.X2 môi trƣờng ngày nuôi cấy 66 iv Đồ án tốt nghiệp Hình 3.8 Đƣờng kính trung bình (cm) nấm Aspergillus sp.Đ1 mơi trƣờng ngày nuôi cấy 69 Hình 3.9 Khả ức chế nấm Aspergillus niger chủng Lactobacillus sp.L5 khơng pha lỗng 71 Hình 3.10.Tỉ lệ ức chế nấm Aspergillus niger chủng Lactobacillus sp.L5 từ đến 20 lần pha loãng 72 v Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Ngày nay, với phát triển xã hội, nhu cầu ăn uống ngƣời ngày đƣợc trọng, vấn đề an toàn thực phẩm lại trở nên quan trọng hết Vệ sinh an toàn thực phẩm nƣớc nói chung thực phẩm nói riêng vấn đề xã hội xúc cần giải kịp thời có hiệu Theo thống kê hàng năm số ca ngộ độc thực phẩm tăng lên đáng kể bối cảnh xã hội phát triển, gây hoang mang cho ngƣời tiêu dùng Trong ngộ độc vi sinh vật chủ yếu nấm mốc chiếm phần lớn, bắt nguồn nhiễm từ nông sản, sản phẩm thực phẩm,… Cuộc sống công nghiệp với tốc độ vũ bão ngƣời vào vịng quay sản phẩm đơng lạnh, thức ăn nhanh mà hầu hết chúng đƣợc bảo quản chất hóa học Hàng trăm loại hóa chất khác đƣợc sử dụng cho mục đích bảo quản thực phẩm Trong số loại sở hữu độc tính cao bị hạn chế, cấm sử dụng loại đồ ăn, thực phẩm nhƣ: natri nitrate (NaNO3), lƣu huỳnh dioxit, muối diêm, hàn the, Tuy nhiên, hóa chất đƣợc sử dụng trái phép.Thậm chí, số chất nhƣ natri benzoat kali sorbate, hàn the bị số nhà sản xuất lạm dụng vƣợt liều Theo chuyên gia, việc sử dụng hóa chất độc hại gây hậu nghiêm tới sức khỏe ngƣời nhƣ ung thƣ, đột biến gene, qi thai,… Trƣớc thực trạng đó, địi hỏi ngƣời phải có hƣớng giải kịp thời để đảm bảo an toàn cho ngƣời tiêu dùng Hƣớng giải sử dụng lợi khuẩn từ vi khuẩn lactic để ức chế khả phát triển nấm loại thực phẩm Do đó, chúng tơi xin đề xuất đề tài “Xác định môi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm củavi khuẩn lactic” Tình hình nghiên cứu Có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để tạo chế phẩm nông nghiệp nƣớc giới Đồ án tốt nghiệp Ở nƣớc có cơng trình nghiên cứu nhƣ sản xuất chế phẩm Sadi Bio (là tên gọi chế phẩm vi sinh Biomix 2) Viện công nghệ Môi trƣờng Việt Nam Chế phẩm Sadi Bio đƣợc sản xuất từ chủng vi sinh vật hữu ích thuộc nhóm xạ khuẩn Streptomyces ƣa ấm (nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu 15 -370C) sinh tổng hợp mạnh enzym ngoại bào (xenlulaza, amylaza proteinaza) có khả sinh kháng sinh ức chế nấm mốc, vi khuẩn Gram âm Ngồi ra, sản phẩm cịn chứa vi khuẩn Lactobacillus có tác dụng ức chế mạnh vi khuẩn gây bệnh (Coliform, Salmonella) Chế phẩm sinh học Sagi Bio-1 có tác dụng xử lý mùi chuồng trại chăn ni bãi chơn lấp chất thải Ngồi nƣớc có cơng trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm vi khuẩn lactic cách ly từ Kim chi chống Aspergillus fumigatus Jeong-Dong Kim viện công nghệ sinh học công nghiệp thuộc đại học Inha, Inhcheon 402-75, Hàn Quốc Ngồi cịn có nhiều cơng trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm vi khuẩn lactic nhiều nƣớc giới Mục đích ngiên cứu Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm vi khuẩn lactic Mục đích cuối sản xuất chế phẩm vi sinh vật LAB hay sản phẩm trao đổi chất chúng để ức chế nấm mốc Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát đặc điểm ni cấy vi khuẩn thí nghiệm để khẳng định vi khuẩn lactic tính khiết - Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng gây ảnh hƣởng lên sinh khối vi khuẩn lactic không ảnh hƣởng lên khả tăng trƣởng nấm mốc - Khảo sát khả kháng nấm Aspergillus niger chủng vi khuẩn lactic Đồ án tốt nghiệp lần lần lần lần lần lần 70 81,82 69,84 60 51,11 58,33 73,33 60,32 53,75 43,33 100 86,96 74,60 61,33 46,25 50 84,09 77,78 68 57,78 58,33 84,44 80,16 75 66,67 70 80,43 77,78 72 60 60 81,82 72,22 62,67 55,56 100 95,56 90,48 85 75,56 44,44 63,33 54,41 40,00 38,89 42,86 62,07 17,78 8,62 9,54 100 82,14 67,14 53,09 44,44 100 86,67 76,47 60,00 54,44 42,86 55,17 8,89 1,72 4,11 100 100 88,57 77,78 70,00 33,33 53,33 41,18 26,67 24,44 28,57 56,90 8,89 0,86 1,37 45,00 67,86 55,71 45,06 38,33 44,44 58,33 46,32 30,67 27,78 21,43 53,45 8,89 1,72 1,37 40,00 39,29 39,29 25,93 20,00 55,56 68,33 50,00 34,67 31,11 28,57 67,24 35,56 25,86 24,66 10 lần 12 Đồ án tốt nghiệp 11 lần 12 lần 13 lần 14 lần 15 lần 16 lần 17 lần 70,00 60,71 52,86 40,74 33,33 28,57 46,67 48,00 43,18 40,00 55,55 61,76 53,85 44,03 41,18 45,45 55,00 50,00 42,42 41,18 14,28 36,67 36,00 31,06 30,59 44,44 55,88 47,12 40,30 37,65 59,09 53,33 50,00 42,42 41,18 21,43 46,67 44,00 50,76 61,18 44,44 55,88 46,15 38,81 36,47 36,36 40,00 38,00 31,82 30,59 14,28 55,00 51,00 43,94 42,35 22,22 52,94 42,31 35,82 35,29 36,36 4,67 38,00 31,82 32,35 14,28 46,67 42,00 36,36 34,12 16,67 50,00 36,54 40,30 36,47 50 50,00 44,00 39,39 36,47 53,85 65,63 55,1 48,85 43,95 36 50,82 42,8 29,51 22,06 52 5,67 50,00 43,08 40,63 46,15 71,88 59,18 54,2 49,04 28 59,02 53,06 40,16 31,62 32 58,33 50,00 41,54 37,5 13 Đồ án tốt nghiệp 18 lần 19 lần 20 lần 61,54 76,56 67,35 59,54 55,41 28 55,74 52,04 40,16 30,88 32 58,33 44,79 38,46 36,25 30,77 56,25 46,94 38,93 36,31 32 63,93 52,04 40,98 30,88 28 43,33 34,38 29,23 34,38 34,62 60,94 48,98 38,93 37,58 36 60,66 53,06 40,16 33,09 32 60,00 54,17 48,46 46,25 Bảng C.2 Bảng theo dõi mật độ quang chủng vi khuẩn Lactobacillus từ đến 20 lần pha loãng Mật độ tế bào Mẫu Độ pha loãng OD 610nm Khơng pha lỗng 12,67 0,394 39,45×107 lần 6,0 0,386 18,27×107 lần 3,67 0,398 11,55×107 lần 3,0 0,398 9,44×107 lần 2,67 0,368 7,71×107 lần 2,33 0,386 7,09×107 14 (cfu/ml) Đồ án tốt nghiệp lần 2,0 0,400 6,33×107 lần 1,83 0,386 5,57×107 lần 1,5 0,395 4,68×107 10 lần 1,33 0,379 3,97×107 11 lần 1,17 0,381 3,51×107 12 lần 0,398 3,15×107 13 lần 0,380 2,99×107 14 lần 0,340 2,65×107 15 lần 0,288 2,20×107 16 lần 0,262 1,97×107 17 lần 0,241 1,79×107 18 lần 0,235 1,74×107 19 lần 0,216 1,57×107 20 lần 0,201 1,44×107 Bảng C.3 Khả kháng nấm Aspergillus niger chủng Lactobacillus sp.L5 từ đến 20 lần pha loãng Độ pha Ng loãng ày ĐỐI CHỨNG 15 Đồ án tốt nghiệp KHƠNG PHA LỖNG LẦN 16 Đồ án tốt nghiệp LẦN LẦN 17 Đồ án tốt nghiệp 5 LẦN LẦN 18 Đồ án tốt nghiệp LẦN LẦN 19 Đồ án tốt nghiệp LẦN 10 LẦN 20 Đồ án tốt nghiệp 11 LẦN 12 LẦN 21 Đồ án tốt nghiệp 13 LẦN 14 LẦN 22 Đồ án tốt nghiệp 15 LẦN 16 LẦN 23 Đồ án tốt nghiệp 17 LẦN 18 LẦN 24 Đồ án tốt nghiệp 19 LẦN 20 LẦN 25 Đồ án tốt nghiệp 26 ... 3.2.1 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng ảnh hưởng lên sinh khối vi khuẩn lactic 59 3.2.2 Xác định môi trường khảo sát hoạt tính kháng nấm dựa vào khả tăng trưởng nấm mốc... 2: Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm - Chọn lọc mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm không gây ảnh hƣởng lên sinh khối vi khuẩn lactic - Chọn lọc môi trƣờng khảo sát hoạt tính. .. sau: Khảo sát đặc điểm ni cấy vi khuẩn thí nghiệm để khẳng định vi khuẩn lactic tính khiết Xác định mơi trƣờng khảo sát hoạt tính kháng nấm khơng gây ảnh hƣởng lên sinh khối vi khuẩn lactic Xác định