Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu nhân giống vô ích cây tiêu bằng phương pháp cấy mô
i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001-2005 Sinh viên thực hiện : NGUYỄN HỮU ĐỊNH Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Trần Thị Dung Nguyễn Hữu Định KS. Nguyễn Thị Kim Linh Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 7/2005 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Quí thầy cô trƣờng Đại học Nông Lâm, đặc biệt là các quí thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Các quí thầy, cô, cán bộ, công nhân viên của khoa Công Nghệ Sinh Học của trƣờng đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá luận này. Đặc biệt, tôi xin đƣợc tỏ lòng biết ơn chân thành đến o Tiến sĩ Trần Thị Dung o Kỹ sƣ Nguyễn Thị Kim Linh Đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khoá luận. Xin đƣợc gửi lời cám ơn đến tất cả các bạn bè, các anh chị em trong và ngoài lớp Công Nghệ Sinh Học 27 dã góp ý, động viên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trƣờng Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và thành kính tới cha mẹ, anh chị em trong gia đình và ngƣời thân. ii TÓM TẮT NGUYỄN HỮU ĐỊNH, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2005. “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”. Giáo viên hƣớng dẫn: Tiến sĩ TRẦN THỊ DUNG Kỹ sƣ NGUYỄN THỊ KIM LINH Thí nghiệm “Bƣớc đầu nghiên cứu nhân giống vô tính cây tiêu (Piper nigrum) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô” đƣợc tiến hành tại bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm – TP.HCM từ ngày 3 tháng 3 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005. Gồm 3 thí nghiệm. 1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy Thí nghiệm 1a: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh Tetracylin. Thí nghiệm 1b: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch chất kháng sinh Streptomycin. Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS. Kết quả đạt đƣợc: sau 15 ngày nuôi cấy kết quả cho thấy thời gian khử trùng mẫu tốt nhất là 6 giờ và Tetracylin cho hiệu quả khử trùng tốt hơn Streptomycin. 2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá Nghiệm thức BA (mg/L) IBA (mg/L) Số chai Số mẫu MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7 MS8 MS9 0 0 0 1 1 1 3 3 3 0 1 2 0 1 2 0 1 2 9 9 9 9 9 9 9 9 9 36 36 36 36 36 36 36 36 36 iii Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng BA và IBA có hàm lƣợng thay đổi theo 9 nghiệm thức đƣợc bố trí theo bảng trên. Kết quả đạt đƣợc: sau 45 ngày nuôi cấy mẫu lá cho thấy môi trƣờng có 3mg/L BA + 1mg/L IBA cho mô sẹo mọc sớm nhất (7 ngày sau cấy) và có khả năng phát triển chồi. Ngoài ra, môi trƣờng có 3mg/L BA + 2mg/L IBA và môi trƣờng có 1mg/L BA + 1mg/L IBA cũng cho mô sẹo phát triển tốt. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên môi trƣờng MS có bổ sung chất kích thích sinh trƣởng 3mg/L BA và hàm lƣợng TDZ hoặc Ki thay đổi theo 5 nghiệm thức đƣợc bố trí theo bảng sau: Nghiệm thức BA (mg/L) TDZ (mg/L) Ki (mg/L) Số bình Số mẫu C1 C2 C3 C4 C5 3 3 3 3 3 0,1 0,3 0,5 0 0 0 0 0 1 0 15 15 15 15 15 45 45 45 45 45 Kết quả đạt đƣợc: Sau 60 ngày nuôi cấy mô sẹo kết quả cho thấy môi trƣờng có 0,3mg/L TDZ cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất. Ngoài ra, môi trƣờng có 0,1mg/L TDZ và môi trƣờng có 0,5 mg/L TDZ cũng cho hiệu quả nhân chồi khá cao. iv MỤC LỤC Nội dung Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt . ii Mục lục . iv Danh mục các từ viết tắt vii Danh mục các bảng . viii Danh mục các hình . ix PHẦN 1. GIỚI THIỆU . 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục đích 2 1.3 Yêu cầu 2 1.4 Giới hạn đề tài . 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô tế bào thực vật 3 2.1.1 Giai đoạn khởi xƣớng (1898-1930) . 3 2.1.2 Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930-1950) 3 2.1.3 Giai đoạn nghiên cứu phát sinh hình thái (1950-1960) . 4 2.1.4 Giai đoạn triển khai nuôi cấy mô vào công nghệ sinh học thực vật 4 2.2 Tổng quan về cây tiêu . 5 2.2.1 Nguồn gốc và lịch sử phát triển cây tiêu . 5 2.2.2 Tình hình sản xuất và tiêu thụ hạt tiêu trên thế giới và Việt Nam 5 2.2.2.1 Thế giới . 5 2.2.2.2 Việt Nam . 7 2.3 Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu 10 2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nƣớc 11 2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài 12 2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trƣởng ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô 12 2.4.1 Auxin . 12 2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin 13 2.4.1.2 Auxin trong cây trồng . 13 v 2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp . 14 2.4.2 Gibbérelline . 14 2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline 14 2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng . 15 2.4.3 Cytokinine . 15 2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine 15 2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng . 16 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 17 3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm . 17 3.2.1 Phòng chuẩn bị 17 3.2.2 Phòng cấy 17 3.2.3 Phòng nuôi cây 17 3.2.4 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm 17 3.3. Vật liệu nuôi cấy 18 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm 18 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy . 19 3.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá . 21 3.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo . 23 3.5 Phân tích thống kê 24 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy . 25 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ BA kết hợp với IBA lên sự tạo mô sẹo từ lá . 27 4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự tái sinh chồi từ mô sẹo 29 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34 5.1 Kết luận . 34 5.2 Đề nghị . 34 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHẦN 7. PHỤ LỤC . 37 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NT: Nghiệm thức T2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Tetracylin T6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Tetracylin T10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Tetracylin S2: Thời gian xử lí mẫu 2 giờ bằng Streptomycin S6: Thời gian xử lí mẫu 6 giờ bằng Streptomycin S10: Thời gian xử lí mẫu 10 giờ bằng Streptomycin TLMS: Trọng lƣợng mô sẹo HSTTMS: Hệ số tăng trƣởng mô sẹo HSNC: Hệ số nhân chồi TLTCC: Trọng lƣợng tƣơi cụm chồi NSC: Ngày sau cấy TDZ: Thidiazuron BA: Benzyladenine IBA: Indolylbutyrique acid Ki: Kinetine vii DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1 Sản lƣợng tiêu của những quốc gia sản xuất tiêu từ 1991-1996 (đơn vị: tấn) 6 Bảng 2.2 Tình hình sản xuất hồ tiêu các tỉnh trọng điểm (1997 - 1999) 8 Bảng 2.3 Tình hình sản xuất - xuất khẩu hạt tiêu của Việt Nam và thƣơng mại quốc tế9 Bảng 2.4 Thị trƣờng và số lƣợng hạt tiêu xuất khẩu từ 1996 – 6 tháng đầu năm 200010 Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1a 19 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b 19 Bảng 3.3 Mô tả thí nghiệm 2 22 Bảng 3.4 Mô tả thí nghiệm 3 23 Bảng 4.1 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Tetracylin 25 Bảng 4.2 Kết quả xử lí mẫu với kháng sinh Streptomycin . 26 Bảng 4.3 Tỉ lệ mẫu sống và mẫu sạch xử lí kháng sinh Tetracylin và Streptomycin trong thời gian 6 giờ . 26 Bảng 4.4 Thời gian xuất hiện mô sẹo của cây tiêu nuôi cấy từ mô lá 27 Bảng 4.5 Bảng trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo và hệ số tăng trƣởng của mô sẹo vào ngày thứ 45 sau cấy . 28 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng của chất kích thích sinh trƣởng đến khả năng hình thành chồi của cây tiêu nuôi cấy từ lá sau 60 ngày . 29 DANH MỤC CÁC HÌNH viii Tên hình Trang Hình 4.1 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 8) sau 7 ngày nuôi cấy. 31 Hình 4.2 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 2mgIBA/L (nghiệm thức thứ 9) sau 16 ngày nuôi cấy. 31 Hình 4.3 Mô sẹo mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 10g Đƣờng saccharose + 1mgBA/L + 1mgIBA/L (nghiệm thức thứ 5) sau 17 ngày nuôi cấy. 32 Hình 4.4 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.3mgTDZ/L (nghiệm thức 2) sau 60 ngày nuôi cấy. 32 Hình 4.5 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.1mgTDZ/L (nghiệm thức1) sau 60 ngày nuôi cấy. 33 Hình 4.6 Chồi mọc trên môi trƣờng Khoáng MS + 8,5g Agar + 30g Đƣờng saccharose + 3mgBA/L + 0.5mgTDZ/L (nghiệm thức 3) sau 60 ngày nuôi cấy. 33 [...]... thể ẩn tích trong thân của cây tiêu Bởi vậy, bằng phƣơng pháp nhân giống thông thƣờng nhƣ: Chiết, ghép, giâm cành hoặc trồng bằng hạt thì hệ số nhân giống sẽ thấp mà cây giống khi đem trồng sẽ vẫn mang theo mầm bệnh thông qua các thao tác nhân giống này và sẽ gây hại cho cây giống Vì vậy, hiện nay việc nhân giống vô tính cây tiêu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô thực sự cần thiết vì cho hệ số nhân giống. .. lƣợng cho cây tiêu; đồng thời nhằm từng bƣớc đƣa nƣớc ta lên vị trí cao nhất trong các nƣớc sản xuất và xuất khẩu tiêu trên thế giới, đƣợc sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học chúng tôi đã tiến hành đề tài “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ” 1.2 Mục ích: 2 Tìm ra công thức khử trùng mẫu cấy ban đầu đạt hiệu quả cao Khảo sát khả năng tạo mô sẹo từ... hoạt tính (1,0mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu, không cần sử dụng Auxin cho mục ích ra rễ (Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du và Đỗ Văn Giáp, 2003) 2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài: Phƣơng pháp vi nhân giống tạo dòng cây hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy nhƣ: đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trƣởng thành (Mathews và Rao, 1984; Agarwal,... 110.656,67 Nguồn: Kiểm dịch - Cục BVTV, năm 2000 2.3 Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu 2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nƣớc: Nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu sạch virus do Đoàn Thị Ái Thuyền, TS.Thái Xuân Du và Đỗ Đăng Giáp; Viện Sinh học Nhiệt Đới thực hiện Mẫu chồi sau khi lấy đƣợc rửa sạch và sát trùng bằng cồn 700 rồi dung nƣớc tẩy Javel pha loãng 1/3 khử trùng... tác nhân gây hại cho cây giống và đã đem lại hiệu quả rất thiết thực trong việc nâng cao chất lƣợng giống cây con Hiện nay đã có một số công trình nghiên cứu nhân giống in vitro hồ tiêu để kháng nấm bệnh Phytophthora Đặc biệt, công tác nhân giống in vitro còn là tiền đề thuận lợi cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng hay xử lí nhiệt để tạo các giống tiêu sạch bệnh để nâng cao năng suất, phẩm chất cho cây. .. nuôi cấy Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu LadaBelangtoeng 3.4 Phƣơng pháp thí nghiệm Trong giới hạn của đề tài chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu các nội dung: 19 Hiệu quả khử trùng của hai loại kháng sinh Tetracylin, Streptomycin Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo từ các mẫu lá trên môi trƣờng nuôi cấy khác nhau về tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ các mô sẹo... chất kháng sinh trong môi trƣờng nuôi cấy đã kiểm soát đƣợc vi sinh vật nội sinh trong cây tiêu nuôi cấy theo Kelkar và Krishnamurthy (1996) Tái sinh cây tiêu từ nuôi cấy mô sẹo đã đƣợc hệ thống hóa mô sẹo phát triển thành lá và chồi để tái sinh cây tiêu mới (Nirmal Babu và ctv 1993, Nazeem và ctv 1993, Bhat và ctv 1995) Cây mới đƣợc tái sinh trực tiếp từ mô lá thông qua giai đoạn mô sẹo (Nirmal Babu... Trong phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu bị gây trở ngại do sự nhiễm của vi sinh vật (Kelkar và Krishnamurthy, 1996) Trong đó việc nuôi cấy hạt tiêu là ít bị nhiễm nhất Tốc độ nhân chồi của tiêu khoảng 6 chồi / 90 ngày nuôi cấy Các cây con in vitro phải đƣợc để trong phòng ẩm mát khoảng 20-30 ngày để cây con có điều kiện phát triển cứng cáp và thích nghi dần với điều kiện sống bên ngoài Cây tiêu in vitro... trƣởng hay xử lí nhiệt để tạo các giống tiêu sạch bệnh để nâng cao năng suất, phẩm chất cho cây tiêu Ngoài ra, công tác nhân giống in vitro cây tiêu có thể nhân giống đƣợc hàng loạt các cây con giống có năng suất và phẩm chất tốt nhƣ các cây bố mẹ đã chọn lọc cũng nhƣ có thể cung cấp nhiều giống tiêu thích hợp cho năng suất theo từng vùng để phục vụ cho nhu cầu sản xuất của nông dân Trƣớc thực trạng... 12 Những báo cáo về phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu đã đóng góp quan trọng cho nền kinh tế và mối liên hệ giữa các giống tiêu: Piper viz, P longum, P chaba, P betle, P colubrinum, P attenuatum và P barberi Các Protocol của P longum có tốc độ nhân dòng nhanh bắt đầu từ các đầu rễ (Sarasan và ctv 1993, Nirmal Babu và ctv 1993, Rema và ctv 1995) Phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu P chaba đã đƣợc (Nirmal . Tình hình nuôi cấy mô cây tiêu 2.3.1 Công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở trong nƣớc: Nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu sạch virus. đề tài “NGHIÊN CỨU NHÂN GIÔNG VÔ TÍNH CÂY TIÊU (Piper nigrum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ”. 1.2 Mục ích: 2 Tìm ra công thức khử trùng mẫu cấy ban
