Đang tải... (xem toàn văn)
Thực tập vi sinh vật chuyên ngành
http://www.ebook.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI *** NGUYỄN XUÂN THÀNH (Chủ biên) VŨ THỊ HỒN NGUYỄN THẾ BÌNH - ĐINH HỒNG DUN Chủ biên & hiệu đính PGS.TS NGUYỄN XUÂN THÀNH THỰC TẬP VI SINH VẬT Chuyªn ngμnh Hà Nội - 2007 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………1 http://www.ebook.edu.vn MỤC LỤC Nội dung Trang Bài số 1: Trang thiết bị cần thiết nghiên cứu vi sinh vật Bài số 2: Phương pháp cố định tiêu nhuộm tế bào vi sinh vật 12 Bài số 3: Chuẩn bị dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật 16 Bài số 4: Nuôi cấy vi sinh vật 26 Bài số 5: Phương pháp lấy mẫu để phân tích vi sinh vật 31 Bài số 6: Phương pháp phân tích vi sinh vật 33 Bài số 7: Đánh giá đặc tính sinh học vi sinh vật 37 Bài số 8: Phân lập tuyển chọn Azotobacter từ đất 40 Bài số 9: Phương pháp lấy mẫu phân lập tuyển chọn vi khuẩn 42 Rhizobium Bài số 10: Phương pháp xác định nhanh trao đổi chất vi sinh vật 46 Bài số 11: Vi sinh vật môi trường 50 Bài số 12: Phương pháp xác định nấm men, nấm mốc, tảo 53 nguyên sinh động vật Bài số 13: Q trình chuyển hố nitơ tác dụng vi sinh vật 60 Bài số 14: Chuyển hoá lưu huỳnh tác dụng vi sinh vật 63 Bài số 15: Vi sinh vật phân giải lân (phospho) 65 Bài số 16: Enzym trình trao đổi nitơ, phospho, lưu huỳnh 67 Bài số 17: Xác định sinh khối vi sinh vật đất 75 Bài số 18: Sinh trưởng vi sinh vật 83 Bài số 19: Thăm quan kiến tập vi sinh vật 86 Phụ lục 88 Tài liệu tham khảo 91 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………2 Bài số TRANG THIẾT BỊ CẦN THIẾT TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT Mục đích yêu cầu: + Nắm máy móc, trang thiết bị cần thiết nghiên cứu vi sinh vật + Biết sử dụng thành thạo số máy móc thơng dụng phịng nghiên cứu + Hiểu tầm quan trọng công tác tiêu độc, khử trùng + Sử dụng thành thạo kính hiển vi + Phân biệt dạng hình thái vi sinh vật Nội dung : + Giới thiệu trang thiết bị cần thiết phòng nghiên cứu vi sinh vật + Giới thiệu dụng cụ nguyên liệu cần thiết để nghiên cứu vi sinh vật: dụng cụ lọc, khử trùng, dụng cụ quang học, dụng cụ đo lường, môi trường nuôi cấy + Thao tác vận hành sử dụng trang thiết bị phòng nghiên cứu vi sinh vật + Cấu tạo sử dụng, bảo quản kính hiển vi + Quan sát hình thái vi sinh vật I MÁY MĨC Tủ ni cấy vi sinh vật (Incubator) Tủ ni cấy hay cịn gọi tủ định ôn thiết bị quan trọng dùng cơng tác nghiên cứu vi sinh vật, nhiệt độ tủ thay đổi từ 00 – 900 C tuỳ theo ý muốn người nghiên cứu nhiệt độ tủ sau xác định ln ln trạng thái ổn định suốt thời gian nuôi cấy 1.1 Cấu tạo Cấu tạo vỏ tủ ni cấy có lớp: lớp kim loại dẫn nhiệt để giữ nhiệt độ bên tủ, lớp kim loại dày bọc phía chất cách nhiệt (amiant) Giữa lớp lớp khoảng trống để giữ cho nhiệt độ tủ bị biến đổi Trong tủ có phận cảm nhiệt để báo nhiệt độ lên xuống cho rơ-le hoạt động quạt gió lắp phần thân để điều hoà nhiệt độ bên Phần ngồi tủ ni có hệ thống bảng điện tử để điều chỉnh nhiệt độ theo yêu cầu nghiên cứu Phía tủ lắp van an toàn, nhiệt độ tủ vượt dao động biên độ, van an toàn tự ngắt 1.2 Cách sử dụng Đóng mạch điện, bấm nút mở cơng tắc tủ (có thể giữ vài giây đến xuất đèn báo bảng điện tử) Sau bấm nút đặt nhiệt độ thời gian (set up) theo yêu cầu nuôi cấy, điều chỉnh nhiệt độ thời gian ấn nút tương Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………1 ứng mũi tên lên xuống Nhiệt độ tủ ấm tăng dần đạt tới nhiệt độ xác định Nhiệt độ trì suốt thời gian nuôi cấy định sẵn Trên bảng điện tử xuất số báo nhiệt độ thực tế tủ Khi đủ thời gian nuôi cấy, tủ phát tiếng báo hiệu rơ le tự ngắt để tự động tắt chế độ làm việc Nếu muốn ni cấy liên tục lâu dài không cần đặt chế độ thời gian, đặt nhiệt độ Khi muốn kết thúc bấm nút tắt công tắc nguồn 1.3 Khi sử dụng máy cần ý điểm sau + Hiệu chỉnh thiết bị trước sử dụng + Phải nối tủ với dây đất kiểm tra điện máy với điện nơi đặt máy xem có giống khơng, trường hợp không giống phải dùng biến + Khi sử dụng tủ ấm lần đầu, phải kiểm tra phận điều chỉnh nhiệt độ xem có xác khơng, nhiệt độ tủ có khơng + Cửa tủ ln ln phải đóng kín, trừ lấy cho nguyên liệu vào nuôi cấy không mở cửa tủ rộng lâu + Luôn phải đảm bảo cho tủ ấm khô ráo, sẽ, phải cho tủ hoạt động thường xuyên hôm trời ẩm Khi làm đổ chất dịch nuôi cấy làm bẩn tủ, phải lau chùi sát trùng + Nên đặt tủ cốc nước vơ trùng q trình ni cấy để giúp cho quạt gió hoạt động tốt + Khi khơng dùng, tắt cơng tắc điện rút phích cắm điện Tủ sấy khô (Drying oven) 2.1 Tác dụng Dùng tủ sấy khô để khử trùng dụng cụ thủy tinh, đồ sứ ống nghiệm, xi lanh, hộp lồng, cốc, phễu, cối chầy sứ , đồ kim khí dao, kéo, panh dụng cụ khác nước khác bơng, băng, vải Trừ vật liệu làm từ cao su môi trường nuôi cấy không khử trùng tủ sấy khô Nguyên lý cấu tạo tủ sấy khô gần giống tủ ấm, khác tiệt trùng nhiệt độ 175 - 200o C 2.2 Cách sử dụng tủ sấy khô Các dụng cụ phải rửa sạch, để khơ, bao gói cẩn thận trước cho vào tủ, sau xếp thứ vào tủ đóng kín cửa đóng lỗ thơng khí Bật công tắc điện, đặt chế độ làm việc cho tủ (điều chỉnh nhiệt độ thời gian giống với tủ định ôn) Thông thường dụng cụ nuôi cấy phân tích vi sinh vật khử trùng 160-180oC Với dụng cụ, như: pipét, xi lanh,… khơng sấy q 60oC nhiệt độ cao làm giãn nở thuỷ tinh dẫn đến độ xác dụng cụ Lưu ý sấy không nên đặt dụng cụ sát thành tủ nhiệt độ thường cao Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………2 nhiều dễ làm cháy giấy gói nút bơng, khơng nên xếp dụng cụ q khít để khơng khí lưu thơng làm nóng vật cần khử trùng Sau ngắt mạch điện, chờ nhiệt độ hạ dần xuống nhiệt độ phịng đuợc mở cửa tủ để lấy dụng cụ sấy Dụng cụ lấy phải để giá gỗ, giấy vải, không để gạch men, sàn gạch sàn xi măng dụng cụ nóng gặp lạnh dễ vỡ làm ảnh hưởng đến tính vơ trùng dụng cụ Nồi hấp nước cao áp (Autoclave) 3.1 Nguyên lý Nồi hấp nước cao áp (hình 1) làm kim loại chịu nhiệt độ cao (ít 135o C) dùng điện, dùng củi dùng than đun cho nước sôi, nước nén dần lại nồi tiếp tục nước sơi áp lực nồi tăng dần, áp lực tăng nhiệt độ nước nồi cao, nhiệt độ t0 nước áp lực P có liên quan với nhau, khơng phải theo tỷ lệ đường thẳng (xem đồ thị) Khi áp lực kế số có nghĩa là: áp lực P nồi hấp = áp lực P không khí Cho nên áp lực kế 1kg/cm2 hiệu số áp lực bên với áp lực khơng khí tồn nồi 1kg/cm2 = P (trong nồi) - P (khơng khí nồi) Do áp lực P nồi khơng phù hợp với P áp lực kế hay nói cách khác, nhiệt độ nồi không tương ứng với nhiệt độ áp lực kế Vì muốn cho nhiệt độ nồi phù hợp với áp lực kế phải loại bỏ hết khơng khí nồi (1kg/cm2 = 1atm = phoud) Bảng So sánh mối liên quan áp suất ghi áp kế nồi hấp biểu thị atmosphere nhiệt độ nồi loại hết khơng khí Áp suất (atm) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 Nhiệt độ (oC) 100,0 102,5 105,0 107,5 110,0 Áp suất (atm) 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 Nhiệt độ (oC) 112,5 114,5 116, 117,0 119,0 Áp suất (atm) 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 Nhiệt độ (oC) 121,0 129,9 124,0 125,0 126,0 Áp suất (atm) 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 Nhiệt độ (oC) 127,0 128,0 129,0 130,0 131,0 132,0 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………3 Hình Sơ đồ nồi hấp áp lực Để loại bỏ hết khơng khí nồi có cách: a) Đóng khóa để tăng áp lực nồi lên đến khoảng 0,3 atm xì cho hết ra, sau khóa lại cho tăng áp lực b) Mở khóa đun nước bắt đầu thoát thành luồng trắng mạnh, đóng lại cho tăng áp lực 3.2 Cách sử dụng nồi hấp cao áp - Đổ nước vào nồi hấp với lượng vừa đủ (xem vạch ngang ghi ống thủy tinh bình chứa lắp bên ngồi nồi hấp) Chú ý nước phải ngập dây may so nồi nồi hấp xách tay - Các dụng cụ đem hấp phải bao gói kỹ, bình ống mơi trường có nút bơng phải bọc giấy dầu giấy nhôm để tránh nước đọng làm ướt nút - Khi xếp dụng cụ vào nồi hấp không nên để sát quá, để vật nặng xuống vật nhẹ lên - Đậy nắp, khóa chặt ốc theo đơi đối xứng để khỏi vênh, khỏi hở, tháo khóa phải làm Đóng van điều áp van xả - Mở mạch điện đốt nhiên liệu để cung cấp nhiệt cho nồi, ấn nút mở công tắc nồi (nút on), đặt chế độ làm việc (nhiệt độ thời gian hấp) cho nồi Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………4 cách điều chỉnh mũi tên lên xuống Chế độ làm việc thể bảng ghi điện tử Sau hấp đủ theo nhiệt độ thời gian định sẵn, rơ le tự ngắt, nồi phát tiếng kêu báo hiệu trình hấp kết thúc Với nồi hấp xách tay phải ln ln có mặt để theo dõi kim áp lực đồng hồ áp lực kế hấp, loại hết khơng khí nồi theo phương pháp nêu Khi đạt tới mức cần thiết điều chỉnh nguồn nhiệt để trì áp lực khơng đổi khoảng thời gian cần thiết Nhiệt độ thời gian hấp khử trùng phụ thuộc vào vật đem khử trùng mục đích nghiên cứu Người ta thường hấp nhiệt độ 121oC khoảng 20 phút nha bào số loại vi khuẩn bị tiêu diệt - Khi đạt tới thời gian cần thiết ngắt điện (ấn nút off) rút hết nhiên liệu đợi cho áp lực hạ dần xuống 0o C, nhiệt độ nồi giảm hẳn mở nắp lấy dụng cụ khử trùng Chú ý tránh hạ áp lực đột ngột cách mở van xì mạnh làm rạn nứt vỡ dụng cụ Cũng không nên để nồi hấp nguội lạnh lấy dụng cụ ra, lúc nắp nồi mút chặt vào miếng đệm cao su khó mở - Các dụng cụ lấy không để gạch men, đá, xi măng (vì dụng cụ nóng gặp lạnh vỡ, nứt) đảm bào tính vơ trùng cho dụng cụ Tủ lạnh (Freezer) Tủ lạnh thiết bị quan trọng dùng để giữ bảo quản giống vi khuẩn, virus bảo quản loại huyết thanh, loại vacxin, môi trường dùng để nuôi cấy Tủ lạnh 0o- 4o C dùng để giữ giống vi khuẩn Tủ lạnh -15o C đến -30o C dùng để giữ giống virus Máy ly tâm (Centrifugal machine) 5.1 Công dụng - Tập trung đáy ống phần tử cần nghiên cứu chứa bệnh phẩm hay chất mang - Tập trung vi khuẩn nuôi cấy môi trường lỏng để tách riêng vi khuẩn - Làm chất lỏng chứa nhiều phần tử đặc vẩn đục - Tách hồng cầu riêng với huyết tương… 5.2 Cách sử dụng Máy ly tâm thông thường có trục quay trịn, phía trục có hình để nhận ống chứa chất lỏng cần ly tâm Các ống móc vào quai Khi quay ống giãn thẳng góc với trục quay đứng hạt lắng xuống theo đường trục ống dồn phía đáy Với kiểu máy này, tốc độ tối đa 4500 - 6000 vòng phút Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………5 Các máy ly tâm gần có phận thăng tự động, có máy để thời gian tự động, có đồng hồ tốc độ v.v , ly tâm cần vặn nút theo ý muốn Những thiết bị cần thiết khác - Máy hút chân không (vacuum gauge) - Máy đếm khuẩn lạc (colony counting) - Máy đo pH (pH meter) hay thang đo pH (pH paper set) - Máy cất nước (Deionizers) - Máy đánh mẫu (Mixers) - Máy đếm tế bào (cell counting) - Máy lắc (shaker) - Phịng buồng vơ trùng (clean bench, laminars) II CÁC DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ PHỊNG THÍ NGHIỆM Thiết bị quang học - Kính hiển vi quang học (Microscopy) - Kính hiển vi chụp ảnh - Đèn soi kính hiển vi - Tụ quang đen - Thước đo vật kính thước đo thị kính - Kính lúp hai mắt đeo trán - Máy projector - Máy Over head - Máy ảnh - Đèn tử ngoại (UV lamp) Thiết bị đo lường - Cân kỹ thuật (technical balance) - Cân tiểu ly có lồng kính - Cân tiểu ly xách tay - Cân bàn - Cân phân tích điện - Nhiệt kế treo tường loại nhiệt kế đo nhiệt độ khác - Đồng hồ điện tử đếm phút, giây Các loại dụng cụ khác - Các loại dụng cụ thủy tinh: Phiến kính, hộp lồng, ống nghiệm, lọ, bình, phễu, cốc ống đong, xi lanh, pipet, que gạt, đèn cồn Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………6 - Các loại dụng cụ kim loại: Dao mổ loại, kéo thẳng, kéo cong, panh, que cấy, đèn xì, hộp tiêu độc, cưa xương - Các loại dụng cụ đồ men, sứ: Khay men, cối chày sứ, xoong nồi để pha chế môi trường - Các loại dụng cụ cao su, vải, bông, băng: Găng tay để mổ để rửa dụng cụ, ủng, thấm nước, không thấm nước, vải gạc, vải lọc, vải - Các loại hóa chất để chế mơi trường, rửa dụng cụ thủy tinh sát trùng tiêu độc - Các loại thuốc nhuộm thuốc thử phản ứng sinh hóa - Các loại giống vi khuẩn virus, loại kháng huyết để chẩn đoán, loại khuẩn tố để chẩn đốn III KÍNH HIỂN VI Kính hiển vi dụng cụ quang học cần thiết để nghiên cứu hình thái vi sinh vật nghiên cứu vật nhỏ mà mắt thường khơng thể nhìn thấy được, có nhiều loại kính hiển vi khác * Cấu tạo kính hiển vi quang học Kính hiển vi quang học gồm có phận: Bộ phận học 1.1 Chân kính hay đế kính Dùng để đỡ kính hiển vi trạng thái cân bằng, cấu tạo từ kim khí đặc biệt 1.2 Thân kính Nối liền với chân kính, tạo từ loại kim khí đặc biệt Thân kính để gắn tồn phận kính hiển vi 1.3 Ống kính Là ống kim khí rỗng hình trụ lắp trụ kính, đầu ống kính lắp thị kính, phía ống kính bàn xoay dùng để lắp vật kính Tác dụng ống kính vật ảnh phóng đại lần thứ vật kính, đưa vật ảnh qua ống kính tới thị kính để phóng vật ảnh lần thứ Như vật ảnh ta quan sát thấy ảnh ảo 1.4 Khay kính hay đĩa kính Có thể hình vng hay hình trịn nơi đặt tiêu để quan sát, có lỗ thấu quang để đưa ánh sáng từ tụ quang kính lên tiêu Trên khay kính có phận kẹp tiêu cho vững phận gọi xa để di chuyển tiêu theo hai chiều khác nhau, từ trái sang phải, từ trước sau ngược lại để tìm vật ảnh Ngồi ra, khay kính cịn di chuyển theo chiều cách vặn hai ốc hai bên khay kính 1.5 Ốc điều chỉnh Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………7 Gồm có ốc điều chỉnh lớn (ốc sơ cấp) ốc điều chỉnh nhỏ (ốc vi cấp) ốc sơ cấp dùng để điều chỉnh tiêu điểm, ốc vi cấp dùng để điều chỉnh cho ảnh vật rõ nét Bộ phận quang học: 2.1 Gương phản chiếu Đặt phía khay kính gồm có hai mặt, mặt phẳng mặt lõm, dùng để lấy ánh sáng 2.2 Tụ quang kính Được lắp vào phía khay kính ốc cố định, dùng để tập trung ánh sáng vào tiêu 2.3 Bộ phận chắn sáng Có hình giống đặt phía tụ quang kính mở rộng hay hẹp dùng để điều hòa ánh sáng vào tiêu 2.4 Vật kính Là hệ thống quang học quan trọng phức tạp, gồm số thấu kính, trực tiếp phóng đại ảnh thật vật xem, khả phóng đại vật kính phụ thuộc vào tiêu cự tức phụ thuộc vào bán kính cong thấu kính; thấu kính cong, tiêu cự ngắn khả phóng đại lớn Vật kính dùng lắp vào bàn xoay phía ống kính Có hai loại vật kính: + Vật kính khơ: vật kính có độ phóng đại thấp x8; x20; x40; dùng để xem tươi, xem vi khuẩn di động, xem khuẩn lạc, hay xem ký sinh trùng xem tiêu tổ chức + Vật kính dầu: vật kính có độ phóng đại cao x 90; x100; x 120…, có vịng khác màu đầu vật kính để phân biệt với vật kính khơ Vật kính khơ vật kính dầu khác chất mà ánh sáng phải qua tiêu (phiến kính) vật kính vật kính khơ chất qua khơng khí mà số khúc xạ (chiết xuất) khơng khí n = khác với số khúc xạ thủy tinh n = 1,52; tia sáng khỏi tiêu bị phản xạ phần chùm ánh sáng khơng lọt vào vật kính Ở vật kính có độ phóng đại lớn người ta dùng dầu bạch hương (huile de cèdre) có số khúc xạ n =1,51 xấp xỉ với số khúc xạ thủy tinh n = 1,52 đặt vào tiêu vật kính Lúc thủy tinh dầu bạch hương môi trường gần đồng nhất, nên ánh sáng qua thủy tinh khơng bị khúc xạ mà chiếu thẳng vào vật kính Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………8 Cho ba mẫu đối chứng ẩm không xông (50g khối lượng khô) vào chai nhựa PE dùng 200ml dung dịch kalisunphat để chiết * Chiết: Để chiết tách cacbon hữu cơ, chuyển mẫu đất vào chai nhựa PE thật cẩn thận, cho thêm 200ml dung dịch kalisunphat, lắc chai máy lắc nằm ngang tốc độ 200 vòng/phút 30 phút máy lắc đứng tốc độ 60 vịng/phút 45 phút lọc dung mơi qua giấy lọc Chiết đối chứng không xông lọc dung môi chiết Nếu không phân tích ngay, bảo quản dịch chiết mẫu đất xơng không xông tủ đá giữ nhiệt độ từ -15oC đến -20oC Trước sử dụng làm tan dịch chiết đến nhiệt độ phòng đồng chúng * Chú thích: Trong bảo quản dung môi chiết thường xuất kết tủa trắng (đặc biệt giữ nhiệt độ đông lạnh) chúng thường bão hồ với canxisunphat (CaSO4) Khơng cần hồ tan lượng canxisunphat dư khơng tác dụng với hoá chất trình tiến hành theo phương pháp Các màng tế bào rễ non, sống bị ảnh hưởng qua q trình xơng cloroform Nếu đất có chứa nhiều rễ sống cần phải tiến hành thêm qui trình xử lý trước chiết theo phụ lục * Xác định cacbon dịch chiết Hàm lượng cacbon vi sinh vật mẫu đất xác định cách phân tích hàm lượng sử dụng để so sánh mẫu đất khác Nếu cần số liệu sinh khối vi sinh vật tại, lúc phân tích nhân với hệ số chuyển đổi rút từ thực nghiệm, tương quan khối lượng tế bào biết với lượng cacbon sau xông chiết tách Tất hệ số chuyển đổi sử dụng tưong quan theo hệ số ban đầu Xác định hàm lượng cacbon dịch chiết phương pháp oxy hoá dicromat phương pháp phân tích máy 2.2.2 Xác định cacbon sinh khối vi sinh vật phương pháp oxy hố dicromat Trong mơi trường axit mạnh chất hữu bị oxy hoá Cr (VI) bị khử thành Cr(III) Lượng dicromat lại chuẩn độ ngược - Thuốc thử bổ sung: + Kalidicromat K2Cr2O7 0.0667 M (19.6125g kalidicromat khô/lit nước) Do chất nguy hại kalidicromat, phải cẩn thận sử dụng thải bỏ + Axit photphoric H3PO4 (p = 1.71 g/ml) + Axit sunfuric H2SO4 (p = 1.84 g/ml) Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………87 + Sắt (II) amoni sunphat, dung dịch chuẩn độ [(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O] = 0.04M: Sắt (II) amoni sunphat (15.69g)hoà tan nước cất, thêm 20 ml axit sunfuric, sau cho tiếp nước cất đến mức 1000ml + Dung dịch phức sunphat 1.10 – phenanthrolin 0.025 mol/l + Hỗn hợp axit: Hai thể tích axit sunfuric trộn với thể tích axit photphoric - Thiết bị bổ sung: + Sinh hàn Liebig (Làm lạnh nước) + Bình đáy tròn 250ml, Buret 10ml, chia độ 0.05ml, Pipet 2ml - Cách tiến hành: Dùng pipet lấy 2ml dung dịch kali dicromat (PD) 15 ml hỗn hợp axit cho vào 8ml dịch chiết lọc (PS) bình đáy trịn 250 ml Đun hồi lưu nhẹ tồn hỗn hợp vịng 30 phút, sau làm lạnh pha loãng với khoảng 20 ml đến 25ml nước qua đường sinh hàn để tráng Cũng tiến hành tương tự với mẫu trắng, có chứa ml dung dịch K2SO4 Xác định lượng dicromat thừa cách chuẩn độ ngược với muối kép sunphat sắt (II) amoni dùng vài giọt dung dịch phức 1, 10-phenanthrolinsunphat sắt (II) làm thị 2.2.3 Tính tốn kết Tính lượng cacbon hữu chiết công thức (1) (2) C(g/ml) = [(VH-VS)/VC]x MPD x E x 1000/Ps …(1) Trong đó: VS: Thể tích dung dịch chuẩn độ dùng để chuẩn mẫu (ml) VH: Thể tích dung dịch chuẩn độ dùng để chuẩn mẫu trắng hồi lưu (ml) VC: Thể tích dung dịch chuẩn độ dùng để chuẩn mẫu trắng không hồi lưu (ml) M : K2Cr2O7 (mol /lit) Po: Thể tích dung dịch K2CR2O7 bổ sung (ml) Ps: Thể tích dung dịch mẫu bổ sung (ml) E: (chuyển đổi từ cacbon hữu C[C]thành CO2[C (+ IV)]) C(g/ g đất khô) = C(g/ml) x (PK/ Dw + Sw) Trong đó: PK : Dw: …(2) Khối lượng dung môi chiết (g) Khối lượng đất khô (g) Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………88 Sw: Nước đất (g nước/ g đất khô) Tính lượng cacbon sinh khối Bc,, theo cơng thức (3): …(3) Bc = Ec/ kEC Trong đó: Ec= (khối lượng cacbon hữu chiết từ đất xông hơi) – (khối lượng cacbon hữu chiết từ đất khơng xơng hơi) KEC= 0.38 Hệ số kEC tính toán từ mối liên quan kết phương pháp ủ - xông phương pháp chiết-xông (12 loại đất) 2.2.4 Xác định cacbon sinh khối vi sinh vật phân tích cacbon theo phương pháp quang phổ * Nguyên tắc Với có mặt kali persunphat (K2S2O8), cacbon hữu chiết đất bị oxy hoá thành cacbon dioxit lượng cacbon dioxit đo phổ (IR) (UV) - Thuốc thử bổ sung + Kali persunphat (K2S2O8.) + Axit photphoric + Natri polyphosphat [(NaPO3)m], tinh khiết - Thuốc thử Kali persunphat: Hoà tan 20 g kali sunphat 90 ml nước cất, dùng axit phosphoric điều chỉnh pH dung dịch sau cho nước cất vừa đủ đến 1000ml - Thuốc thử natri polyphosphat: Hoà tan 50 g natri polyphosphat 90 ml nước cất, dùng axit phosphoric điều chỉnh pH dung dịch đến sau thêm nước cất đến 1000ml - Thiết bị bổ sung + Máy phân tích cacbon tự động với phát hồng ngoại với hệ thống dòng liên tục với đầu đo so màu Trong tiêu chuẩn việc xác định cacbon sinh khối vi sinh vật dựa sở oxy hoá cacbon hữu persunphat hoạt hố tia cực tím - Cách tiến hành Đối với phương pháp oxy hoá tự động persunphat – tia cực tím, trộn 5ml phần chiết từ đất dung dịch kali sunphat với ml thuỗc thử natri polyphosphat Bất kỳ kết tủa CaSO4 hồ tan q trình Thuốc thử kali persunphat đưa cách tự động vào buồng oxy hoá UV, oxy hoá thành CO2 thực tia cực tím CO2 tạo thành đo hấp thụ hồng ngoại hay quang phổ UV Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………89 2.2.5 Tính tốn kết - Tính lượng cacbon hữu chiết (C) theo công thức (4): …(4) C (g/g đất khô) = [(V x DV) – (B x DV)] x (Pk/ Dw + Sw) Trong đó: V: C(g/ ml) mẫu B: C(g/ ml) mẫu trắng DV: Độ pha loãng mẫu natri phosphat (ml) DB: Độ pha loãng mẫu trắng natri phosphat (ml) PK : Khối lượng dung môi chiết (g) DW: Khối lượng đất khô (g) SW : Nước đất (g nước/ g đất khơ) - Tính lượng sinh khối BC sử dụng công thức: (5) BC = Ec/kEC Trong đó: EC = (cácbon hữu chiết từ đất xông hơi) – (cácbon hữu chiết từ đất không xông hơi) KEC = 0,35 Hệ số KEC tính từ mối liên quan kết phương pháp ủ xông kết phương pháp chiết – xơng (23 loại đất) Có thể sử dụng phương pháp chiết - xông kết hợp với phương pháp nghiên cứu phân huỷ chất hữu đánh dấu 14C * Qui trình chiết sơ với đất có chứa nhiều rễ sống Cho đất ẩm (25 đến 50 g khối lượng khô) vào bình thuỷ tinh 250 ml có chứa 100 ml dung dịch kali sunphat để chiết vòng 20 phút máy lắc sàng (đối với đất canh tác kích thước lỗ 2mm, đất đồng cỏ 3mm) Rửa thật rễ (và hạt đá nhỏ) sàng 75 ml dung dịch kali sunphat bổ sung thêm sấy khô, cân chúng Ly tâm khoảng 500 g huyền phù gồm đất dung dịch kali sunphat bình thuỷ tinh 15 phút Sau chắt nước lọc phía Cho thêm giọt cloroform vào đất để xơng Qui trình Nếu có rễ sống đất thiết phải sử dụng qui trình Hơn nữa, qui trình tạo cho việc đo nitơ sinh khối vi sinh vật dễ dàng việc giảm nitơ vô có đất Nó cịn giảm khó khăn đo sinh khối vi sinh vật đất khơ tiện lợi cho việc đo dao động cacbon sinh khối vi sinh vật đất nitơ năm Sinh khối vi sinh vật đo không bị chiết tách khỏi đất qui trình chiết sơ Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………90 Xác định sinh khối nitơ vi sinh vật đất Sau xông cloroform, mẫu đất chiết dung dịch kali sunphat Nitơ tổng số dịch lọc xác định biến đổi sang nitơ sinh khối (Brookes cs, 1985) Nitơ tổng số xác định theo phương pháp Kjeldahl 3.1 Vật liệu, hoá chất thuốc thử Các vật liệu, hoá chất, dụng cụ thuốc thử chuẩn bị xác định cacbon sinh khối vi sinh vật 3.2 Thủ tục tiến hành 3.2.1 Chiết - xông Xông 150-200g mẫu đất ẩm cloroform 24h giống phân tích cacbon sinh khối Sau (ngược với kỹ thuật chiết-xơng trên, cloroform không tách khỏi mẫu), trộn đất xông với dung dịch kali sunphat theo tỉ lệ 1:4, lắc 30 phút lọc làm mẫu phân tích (3 lần lặp lại) Tiến hành tương tự với mẫu đối chứng không xông (3 lần lặp lại) Tiến hành phân tích lượng nitơ tổng số dịch lọc theo phương pháp Kjeldahl Có thể cất giữ dịch lọc 4oC phân tích 3.2.2 Phân tích nitơ theo phương pháp kjeldahl - Dụng cụ, hoá chất bổ sung: + Bình Kjeldahl (250ml), cất đạm Kjeldahl + Axit sunfuric H2SO4 (p = 1.84 g/ml) + H2SO4 0,05M + Hỗn hợp xúc tác: 100g K2SO4 + 10g CuSO4 + 1g Se, nghiền nhỏ + NaOH 32% (w/v) + Axit boric 2% (w/v) + Dung dịch thị (ví dụ xanh bromcresol, đỏ metyl) - Tiến hành: Cho 0,5g hỗn hợp xúc tác 20ml H2SO4 đặc vào bình dịch lọc, công phá thu dung dịch trong, để nguội nhiệt độ phòng Cho 10ml axit boric vài giọt thị vào bình hứng dịch chưng cất Sau thêm xút dư tiến hành chưng cất 3-20 phút để chuyển hoàn toàn NH3 vào bình chứa axit boric thị Xác định N-NH4 chuẩn độ với H2SO4 0,05M (điểm chuẩn độ dung dịch chuyển từ xanh sang hồng Lượng nitơ mẫu tính theo cơng thức sau: (S-C).1,4.100.100 = %N A SW.1000 Trong đó: S: Lượng axit H2SO4 0,05M dùng cho mẫu (ml) Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………91 C: Lượng axit H2SO4 0,05M dùng cho đối chứng (ml) 1,4: Hệ số chuyển đổi (1ml H2SO4 0,05M tương ứng với 1,4 mgN) 100: Lượng dịch tiêu thụ (ml) A: ước số dịch tiêu thụ (ml) SW: Lượng đất ban đầu -1 100.1000 : Hệ số chuyển đổi (%, w/w) 3.3 Tính kết Nitơ sinh khối vi sinh vật tính theo phương trình: (S-C) = μg N.g-1 dm 0,54 Trong đó: S: Giá trị mẫu (μg N-NH4.g-1dm) C: Giá trị đối chứng (μg N-NH4.g-1dm) 0,54: Hệ số KEN (mối quan hệ nitơ sinh khối VSV nitơ tổng số đất) * Câu hỏi ôn tập: Bài số 17 Sinh khối VSV có mơi quan hệ mật thiết với sản phẩm nuôi cấy môi trường lên men? Các phương pháp thử loại thuốc thử, cơng thức tính cho nhóm VSV? Tính tốn kết thí nghiệm loại sinh khối cho nhóm VSV chun tính? Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………92 Bài số 18 SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT Mục đích yêu cầu: + Xác định điều kiện nuôi cấy cho loại VSV: hảo khí, yếm khí bắt buộc, yếm khí khơng bắt buộc + Hiểu rõ phương pháp ni cấy vi khuẩn yếm khí + Xác định pha đường cong sinh trưởng vi khuẩn điển hình Nội dung kiến tập: + Ni cấy vi khuẩn yếm khí + Đo độ đục sinh trưởng vi khuẩn Giải thích số liệu sinh trưởng vi khuẩn đồ thị + Xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng VSV Nguyên lý chung Vi sinh vật có yêu cầu dinh dưỡng, lý học, hố học mơi trường phải đáp ứng để sinh trưởng phát triển Kiến thức điều kiện cần thiết cho sinh trưởng VSV giúp dễ dàng ni cấy VSV điều khiển VSV không mong muốn Năm 1861, Jean Baptiste Dumas trình bày báo cáo tới viện hàn lâm Pasteur Trong báo này, ông bắt đầu: “ Sự tồn lớp trùng mao có đặc trưng men đáng ý, đặc trưng cần quan tâm nhiều động vật nhỏ trùng mao sống nhân lên vô hạn vắng mặt lượng khơng khí nhỏ oxy tự do…” Khi nói khơng khí u cầu sinh trưởng, cần xem xét lượng oxy không khí Hơn nữa, nhắc đến oxy, thường muốn nói đến oxy phân tử (O2) đóng vai trị nguồn cung cấp điện tử hơ hấp hảo khí Các điều kiện vật lý môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng VSV nhiệt độ, áp suất thẩm thấu pH Oxy sinh trưởng vi sinh vật Sự có mặt hay vắng mặt phân tử oxy (O2) vơ quan trọng sinh trưởng VSV Một số VSV gọi VSV hảo khí địi hỏi có oxy, VSV khác gọi VSV yếm khí lại khơng sử dụng oxy Một lý khiến VSV yếm khí bắt buộc khơng thể chịu có mặt oxy chúng thiếu catalaza kết tích luỹ hydro peroxyt gây chết tế bào Các lồi hảo khí chịu khí khơng sử dụng oxy chịu kha tốt, sinh trưởng chúng tăng cường điều kiện vi hảo khí hầu hết VSV trao đổi chất theo kiểu lên men Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………93 Một số loại vi khuẩn chịu phần sinh trưởng tốt khí có nồng độ CO2 tăng (7-10%) nồng độ O2 thấp Chúng sinh trưởng môi trường đặc độ sâu mà lượng nhỏ oxy tản mạn vào Để ni cấy VSV chịu khí phần đĩa petri môi trường không nghèo đi, bình nến sử dụng Các đĩa ống nghiệm xử lý đặt bình lớn với nến sáng Sau đậy nút, tắt nến nồng độ oxy giảm Các VSV có khả sống điều kiện có khơng có oxy gọi VSV m khí khơng bắt buộc giống vi khuẩn thiếu catalaza Streptococcus, Leucconostoc, Lactobacillus Clostridium Trong Clostridium yếm khí bắt buộc, cịn giống yếm khí chịu khí lồi khơng có hệ thống xytocrom để sản sinh hydro peroxyt, khơng cần catalaza Việc xác định có hay khơng có mặt catalaza hữu ích định loại vi khuẩn Khi vài giọt hydro peroxyt 3% cho vào khuẩn lạc catalaza diện, phân tử oxy giải phóng dạng bọt khí Trong phịng thí nghiệm, ni cấy vi khuẩn yếm khí bắt buộc khơng bắt buộc cách loại trừ oxy tự từ môi trường sử dụng môi trường biến đổi Nhiều phương pháp ni cấy VSV yếm khí giải q trình Tất phương pháp ni cấy VSV yếm khí hiệu mẫu hay VSV nuôi cấy thu thập chuyển theo cách làm giảm thiểu biểu lộ oxy 2.1 Vật liệu Đĩa petri chứa môi trường dinh dưỡng ống nghiệm chứa mơi trường Thioglycolat có thị Bình ủ yếm khí Hydro peroxyt 3% 2.2 Dịch ni cấy Alcaligenes Clostridium Enterococus Escherichia coli 2.3 Thủ tục tiến hành - Không lắc ống Thioglycolat - Dán nhãn ống canh thang nhiễm ống vòng que cấy loại vi khuẩn điều kiện vô trùng - Nuôi 35oC - Ghi lại xuất sinh trưởng ống - Dùng bút đánh dấu đáy chia đĩa thạch thành phần Dán nhãn đĩa hào khí đĩa yếm khí Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………94 - Ria cấy đường đơn vi khuẩn phần đĩa - Đặt ngược đĩa hảo khí ni 35oC Đĩa yếm khí đặt ngược bình ủ - Người hướng dẫn chứng minh làm để bình trở thành yếm khí 10 ml nước thêm vào túi điều chỉnh khí Gas-Pak (xúc tác hydro kết hợp oxy tạo thành nước, phản ứng dừng lại thêm nước vào) đặt bình với thị xanh methylen Khi có mặt oxy thị có màu xanh, chuyển thành trắng oxy giảm - Nuôi bình 35oC - Sau ni cấy, ghi lại sinh trưởng vi khuẩn đĩa - Thực kiểm tra thử catalaza cách cho thêm vài giọt H2O2 3% vào khuẩn lạc khác đĩa thạch Test catalaza dương tính sinh bọt bong bóng trắng Có thể dùng kính hiển vi để xác định rõ bọt bóng Test thử catalaza thực lam kính Vi khuẩn sinh trưởng mơi trường thạch máu sử dụng phương pháp Xác định đường cong sinh trưởng vi khuẩn: ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ Các pha sinh trưởng VSV xác định cách độ đục dich nuôi cấy Độ đục đơn vị đo lường trực tiếp số lượng VSV, độ đục tăng sinh trưởng VSV Từ diện triệu tế bào/ml phân biệt độ đục mắt, máy đo quang phổ sử dụng để đo xác định độ đục với lượng VSV nhỏ Đa số VSV sinh trưởng khoảng nhiệt độ định Nhiệt độ sinh trưởng tối thiểu nhiệt độ thấp mà lồi VSV phát triển Các loài VSV sinh trưởng nhanh nhiệt độ sinh trưởng tối ưu chúng Và nhiệt độ cao mà chúng sinh trưởng nhiệt độ sinh trưởng tối đa Vi sinh vật chia thành nhóm dựa theo nhiệt độ sinh trưởng chúng Nhiệt độ tối ưu VSV ưa lạnh 15oC, VSV ưa ấm 25oC 40oC Nhiệt độ tối thích nhiều loại ưa nhiệt 45-65oC, vài lồi có khả sinh trưởng 90oC Khoảng nhiệt độ ưa thích VSV di truyền định Trong tập này, vẽ biểu đồ đường cong sinh trưởng loại vi khuẩn nhiệt độ khác để đưa khoảng nhiệt độ thích hợp lồi 3.1 Vật liệu Bình nón chứa dịch dinh dưỡng + NaCl 1,5% ống nghiệm đo quang phổ Pipet ml, 10ml vô trùng Máy đo quang phổ 3.2 Dịch nuôi cấy Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………95 Vibrio natriegenes 3.3 Thủ tục tiến hành - Cho ml dịch dinh dưỡng vô trùng vào ống đo quang phổ ống đối chứng để chuẩn hoá máy đo - Nhiễm 10ml vi khuẩn Vibrio vào bình nón chứa dịch dinh dưỡng - Xoay bình để trộn lẫn dung dịch Chuyển ml từ bình vào ống đo quang phổ thứ 2, đo hấp phụ (Abs.) máy quang phổ - Ghi lại kết đo - Để bình nón nhiệt độ mong muốn - Ghi lại hấp phụ sau 10 phút 60 90 phút Lấy bình khỏi chậu nước cho thời gian tối thiểu để lấy mẫu Khi lấy mẫu, dùng pipet vô trùng hút ml cho vào ống đo quang phổ thứ - Vẽ đồ thị từ số liệu thu để có đường cong sinh trưởng VSV theo nhiệt độ * Câu hỏi ôn tập: Bài số 18 Trình bày thuyết sinh trưởng phát triển VSV? Tính tốn kết thí nghiệm theo sinh khối VSV điều kiện cần đủ thí nghiệm? Bài số 19 THĂM QUAN KIẾN TẬP MƠN HỌC Mục đích u cầu: + Nhằm trang thiết bị kiến thức thực tế cho sinh viên ứng dụng công nghệ VSV nông nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường + Yêu cầu sinh viên tham gia đầy đủ buổi học ngoại khóa theo chương trình mơn học + Sau học xong sinh viên phải viết tiểu luận học ngoại khóa Địa điểm học ngoại khóa: + Các phịng thí nghiệm VSV đại chun phục vụ giảng dạy & nghiên cứu lĩnh vực nông nghiệp + Các loại chế phẩm, phân VSV sản xuất áp dụng nông nghiệp + Trung tâm VSV ứng dụng Trường Đại học Khoa học tự nhiên + Phịng nghiên cứu VSV nơng nghiệp Trường Đại học Nông nghiệp I Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………96 + Viện Sinh học Viện khoa học Việt Nam + Nhà máy (phân xưởng) phân hữu vi sinh vật (Sông Gianh tỉnh Nghệ An, Tiến Nông tỉnh Thanh Hóa, Văn Điển Hà Nội, Việt Trì tỉnh Phú Thọ …và tỉnh toàn quốc) + Viện chăn nuôi thú y, xưởng sản xuất thức ăn gia súc, gia cầm, thuốc thú y tỉnh + Các trang trại, công ty nuôi trồng thuỷ, hải sản tồn quốc + Xí nghiệp xử lý phế thải đô thị thành phố tỉnh Nội dung: + Xem cách thiết kế phòng nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật + Quan sát tìm hiểu quy trình sản xuất xử lý nhiễm môi trường sở ứng dụng công nghệ vi sinh vật + Tiến hành lấy mẫu để kiểm tra chất lượng sản phẩm chế phẩm VSV Bài số 19 THĂM QUAN KIẾN TẬP MÔN HỌC * Câu hỏi ôn tập: Viết thu hoạch đợt kiến tập sở thăm quan, kiến tập? Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………97 PHỤ LỤC BẢNG 1: PHA DUNG DỊCH ĐỆM SORENSEN I VÀ DUNG DỊCH Na2HPO4 1/15M VÀ KH2PO4 1/15M - SỐ LƯỢNG DUNG DỊCH (Ml) pH KH2PO4 1/15 M 4,53 Na2HPO4 1/15 M 0,00 4,48 0,10 9,90 5,29 0,25 9,75 5,59 0,50 9,50 5,91 1,00 9,00 6,24 2,00 8,00 6,47 3,00 7,00 6,64 4,00 6,00 6,81 5,00 5,00 6,98 6,00 4,00 7,17 7,00 3,00 7,38 8,00 2,00 7,73 9,00 1,00 8,04 8,34 9,50 0,50 9,75 0,25 8,67 9,90 0,10 9,18 10,00 0,00 10,00 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………98 BẢNG 2: TÍNH SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT THEO MAC.CRADY Chỉ số 000 001 002 003 010 011 012 013 020 021 022 030 031 040 041 100 101 102 103 110 111 112 113 120 121 122 123 130 131 Số lượng VSV có xác suất lớn cấy lặp lại ống nghiệm 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 0,3 0,2 0,2 0,5 0,4 0,7 0,5 0,3 0,2 0,2 0,9 0,6 0,5 0,4 0,7 0,6 0,9 0,9 0,6 0,5 0,4 0,7 0,6 0,9 0,7 0,6 0,9 0,9 1,2 0,6 0,4 0,3 0,2 1,2 0,7 0,5 0,4 1,1 0,8 0,6 1,0 0,8 1,3 0,7 0,5 0,4 2,0 1,1 0,8 0,8 1,0 0,8 0,5 2,0 1,1 0,8 0,6 3,0 1,5 1,1 0,3 1,3 1,1 1,6 1,6 1,1 0,8 1,4 1,0 Số lượng VSV có xác suất lớn cấy lặp lại Chỉ số ống nghiệm 132 1,6 140 1,4 1,1 141 1,7 200 2,5 0,9 0,6 0,5 201 5,0 1,4 0,9 0,7 202 2,0 1,2 0,9 203 1,6 1,2 210 6,0 1,5 0,9 0,7 211 13,0 2,0 1,3 0,9 212 20,0 3,0 1,6 1,2 213 2,0 220 25,0 2,0 1,3 0,9 221 17,0 3,0 1,6 1,2 222 110,0 3,5 2,0 1,4 223 4,5 230 3,0 1,7 1,2 231 3,5 2,0 1,4 232 4,0 240 2,0 1,4 241 3,0 300 2,5 1,1 0,8 301 4,0 1,6 1,1 302 6,5 2,0 1,4 303 2,5 310 4,5 1,6 1,1 311 7,5 2,0 1,4 312 11,5 3,0 1,7 313 16,0 3,5 2,0 320 9,5 2,0 1,4 Trường Đại học Nơng nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………99 BẢNG 2B: TÍNH SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT THEO MAC.CRADY Chỉ số 321 322 330 331 332 333 340 341 350 400 401 402 403 410 411 412 413 414 420 421 422 423 424 430 431 432 433 434 440 441 450 Số lượng VSV có xác suất lớn cấy lặp lại ống nghiệm 15,0 3,0 1,7 20,0 3,5 2,0 25,0 3,0 1,7 45,0 3,5 2,0 110,0 4,0 140,0 5,0 3,5 2,0 4,5 2,5 2,5 2,5 1,3 3,5 1,7 5,0 2,0 7,0 2,5 3,5 1,7 5,5 2,0 8,0 2,5 11,0 11,0 6,0 2,0 9,5 2,5 13,0 3,0 17,0 20,0 11,5 2,5 16,5 3,0 20,0 4,0 30,0 35,0 25,0 3,5 40,0 4,0 1,4 Chỉ số 451 500 501 502 503 504 510 511 512 513 520 521 522 523 524 525 530 531 532 533 534 535 540 541 542 543 544 545 550 551 555 Số lượng VSV có xác suất lớn cấy lặp lại ống nghiệm 5,0 2,5 3,0 4,0 6,0 7,5 3,5 4,5 6,0 8,5 5,0 7,0 9,5 12,0 15,0 17,5 8,0 11,0 14,0 17,0 20,0 25,0 13,0 17,0 25,0 30,0 35,0 45,0 25,0 35,0 180,0 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………100 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng cộng Sổ tay nghiên cứu vi sinh vật, tập I,II,II NXB GD 1978.1979 Nguyễn Lân Dũng cộng Thực hành vi sinh vật NXB GD 1992 Nguyễn Lân Dũng Thực tập vi sinh vật (dịch giả từ tiếng Nga) NXB GD 1983 Nguyễn Đường cộng Thực tập vi sinh vật trồng trọt NXB.NN 1982 Nguyễn Đường cộng Thực tập vi sinh vật NXB.NN 1989 Nguyễn Xuân Thành cộng Thực tập vi sinh vật đại cương NXB.NN 1994 Nguyễn Xuân Thành cộng Giáo trình vi sinh vật học nông nghiệp NXB GD 2004 Nguyễn Xuân Thành cộng Thực tập vi sinh vật đại cương NXB.NN 2006 101 ... trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………2 Bài số TRANG THIẾT BỊ CẦN THIẾT TRONG NGHIÊN CỨU VI SINH VẬT Mục đích yêu cầu: + Nắm máy móc, trang thiết bị cần thiết nghiên cứu vi sinh vật +... Giáo trình thực tập vi sinh vật chuyên ngành ……………40 Bài số ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI SINH VẬT Mục đích: - Giúp cho học vi? ?n hiểu rõ tầm quan trọng phải đánh giá đặc tính sinh học VSV... thiết nghiên cứu vi sinh vật Bài số 2: Phương pháp cố định tiêu nhuộm tế bào vi sinh vật 12 Bài số 3: Chuẩn bị dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật 16 Bài số 4: Nuôi cấy vi sinh vật 26 Bài số
