Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn DươngĐề tài: Đề tài: “
Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây
nhiễm nhân tạo “
Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây
nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen”kiểm
chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen”BÁO CÁOHỘI NGHỊ KHOA HỌC SINH VIÊNKS. Tống Văn Hải:Người hướng dẫnPhan Thị HươngNguyễn Thị Vân AnhBùi Văn CôngHoàng Văn Dương:Nhóm SV thực hiện HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn DươngNỘI
DUNG CHÍNH2. Đặt vấn đề3. Vật liệu
và phương pháp nghiên cứu4. Kết quả
và thảo luận5. Kết luận
và đề nghị HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương1.Đặt vấn đề Hiện nay
bệnh bạc lá là một trong những
bệnh hại nghiêm trọng nhất đối với cây lúa.
Chúng không những gây hại trong vụ mùa mà gây hại ngay cả trong vụ xuân làm thiệt hại rất lớn đến năng suất
và chất lượng lúa. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương1.Đặt vấn đề Để chọn
tạo giống
kháng bệnh bạc lá thành công thì cần phải biết
gen nào kháng được các chủng bệnh bạc lá Việt Nam, kháng được bao nhiêu chủng
và thành phần
chủng bệnh bạc lá đang tồn
ở những vùng trồng lúa. Muốn xác định được thành phần
chủng bệnh bạc lá thì
chúng ta phải đi thu thập mẫu bệnh, phân lập
và sau đó
lây nhiễm trên
dòng đẳng gen để phân thành
các chủng. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương
Dòng đẳng gen là dòng có nền
gen cơ bản giống nhau nhưng chỉ khác nhau
gen kháng.
Dòng đẳng gen đóng vai trò rất quan trọng trong việc xác định thành phần
chủng bệnh bạc lá. Việc kết luận chính xác thành phần
chủng bệnh bạc lá và
gen nào kháng được các chủng đó giúp
các nhà chọn
tạo giống có định hướng hiện tại, tương lai trong chương trình chọn
tạo giống lúa
kháng bệnh của mình.1.Đặt vấn đề HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương1.Đặt vấn đề
Các gen kháng bệnh bạc lá đã được
các nhà khoa học định vị trên từng
nhiễm sắc thể
và các primer đi kèm. Như vậy chỉ cần
dùng kỹ thuật PCR chúng ta có thể phát hiện được
các gen có mặt trong
các dòng đẳng gen. Mặt khác theo kết quả nghiên cứu của PGS.TS. Phan Hữu Tôn
và cộng sự, đã xác định được phổ
kháng nhiễm của từng
gen đối với
các chủng vi khuẩn Miền
Bắc Việt Nam, dựa vào đó
chúng ta cũng có thể phát hiện sự có mặt của
các gen trong
các dòng đẳng gen bằng phương pháp
lây nhiễm nhân tạo. HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương1.Đặt vấn đề Trong chương trình hợp tác với Viện nghiên cứu lúa Quốc tế (IRRI), Bộ môn Công nghệ sinh học đã tiếp
nhận 11
dòng đẳng gen từ những năm 2000. Trải qua quá trình bảo quản, lưu giữ trên
đồng ruộng
và trồng cạnh nhau dẫn đến sự lẫn tạp hoặc phân ly
các gen kháng với nhau. Sự lẫn tạp đó dẫn đến những kết quả sai lệch trong nghiên cứu cơ bản
và hậu quả sẽ rất nguy hiểm khi có những kết luận không chính xác. Chính vì vậy chúng em tiến hành đề tài “
Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây
nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen” HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương Mục đích:Kiểm chứng lại các
gen kháng bệnh bạc lá trong các dòng đẳng gen. Yêu cầu: • Trồng
và chiết tách DNA của các dòng đẳng gen, dùng chỉ thị phân tử DNA để xác định sự hiện diện của các
gen kháng.•
Lây nhiễm
nhân tạo các chủng
bệnh bạc lá đặc trưng trên dòng đẳng gen.1.Đặt vấn đề HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương2. Vật liệu
và phương pháp nghiên cứu2.1. Vât liệu nghiên cứu 11 dòng đẳng
gen có nguồn gốc từ IRRI chứa các
gen kháng bệnh khác nhauXa7IRRBB76NoneIR24 11Xa5IRRBB55Xa21IRRBB2110Xa4IRRBB44Xa14IRRBB149Xa3IRRBB33Xa11IRRBB118Xa2IRRBB22Xa10IRRBB107Xa1IRRBB11Chứa genTên dòngTTChứa genTên dòngTT HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương 12 chủng vi khuẩn bạc lá dùng trong
lây nhiễm
nhân tạo đã được xác địnhTT Isolate Phân lập từ giống Địa điểm thu thập mẫu
Chủng 1 HAU01043 TN13-1 Hà Nội 1 2 HAU02036-1 Nếp tân Thuận châu- Sơn
la 2B 3 HAU02008-3 Nhị ưu-838 Quỳnh giang, Quỳnh lưu, Nghệ an 3A 4 HAU01008-1 Tẻ đỏ Hải Dương 4 5 HAU02013-1
Khang dân Diễn kỳ, Diễn châu, Nghệ An 5A 6 HAU02034-6 Nhị ưu-838 Cường thịnh, Yên bình, Yên Bái 6 7 HAU02019-1 Q5 Vinh Hồng, Bình Giang, Hải Dương 7 8 HAU02020-1 Nếp thơm Vinh Hồng, Bình Giang, Hải Dương 8 9 HAU02037-1 IR64 Thuận Châu, Sơn
La 9 10 HAU02032-1 Hybrid rice Thịnh Hưng, Yên Bình, Yên Bái 10 11 HAU02008-1 Nhị ưu-838 Quỳnh Giang, Quỳnh Lưu, Nghệ An 3A' 12 NEW
Bắc thơm-7 Cổ Loa, Hà Nội 11 [...]... cây được cắt sâu 3-5cm bằng kéo nhúng
dung dịch vi khuẩn Mỗi một cây tương
ứng với 1 hoặc 2 chủng đặc thù • Đánh giá khả năng
kháng bệnh của từng giống bằng cách đo chiều dài vết
bệnh sau 18 ngày
lây nhiễm - Chiều dài vết
bệnh < 8 cm:
kháng bệnh (R) - Chiều dài vết
bệnh 8-12cm:
nhiễm vừa (M) - Chiều dài vết
bệnh > 12 cm:
nhiễm nặng (S) Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng... HỌC NĂM 2010
Lây nhiễm
nhân tạo xác định
gen kháng bạc lá PP
lây bệnh nhân tạo Đo VB sau 18 ngày Đo VB sau 18 ngày Buộc thẻ Buộc thẻ Nuôi cấy/Wakimoto Nuôi cấy/Wakimoto
Lây bệnh Lây bệnh 1088CFU/ml 10 CFU/ml Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 • Toàn bộ đầu
lá xanh trên của 1 cây được cắt sâu 3-5cm bằng... KHOA HỌC NĂM 2010 +
PCR của
gen Xa4
và Xa 7
và Xa21 được thực hiện theo chu kì nhiệt: 94ºC trong 4 phút, 30 chu kỳ, 94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72º trong 2 phút,
và 72 º C trong 8 phút +
PCR của
gen xa5 được thực hiện theo chu kì nhiệt: 94ºC trong 4 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72º trong 1 phút 50 giây,
và 72 º C trong 7 phút Sau đó, sản phẩm
PCR được cắt bằng enzyme... NĂM 2010 IV Kết luận
và đề nghị 4.1 Kết luận Xác định
gen kháng bằng chỉ thị phân tử
và lây nhiễm
nhân tạo đã xác định được 2/4 dòng nghiên cứu bị lẫn, đó là dòng IRBB5
và IRBB21 Nguyên
nhân gây lẫn giống là do cơ giới chứ không phải lẫn sinh học do giao phấn 4.2 Đề nghị Thu hoạch những các thể đã được xác định chính xác là chứa
gen kháng làm giống... 2010 3.4 Xác định
gen kháng Xa7 trong dòng IRBB7 Hình 3: Điện di sản phẩm
PCR gen Xa7 sử
dụng cặp mồi P3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 500 bp 300 bp 1 Marker; 2: DNA chuẩn của
gen xa7, 3: IR24 không chứa gen; 4-13: các cây nghiên cứu Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Bảng 2: Kết quả
lây nhiễm các cá... KHOA HỌC NĂM 2010 Chỉ thị phân tử xác định
gen kháng bạc lá • Chiết tách DNA theo phương pháp của Zheng
và cộng sự (1995) có cải tiến + Thành phần
dung dịch
dùng tách chiết DNA gồm có: Tris-HCl 50mM (pH=8), EDTA 25mM (pH=8), NaCl 300mM, SDS 1%, nước cất vô trùng + Cách tiến hành: • Phản ứng PCR: thành phần 20 μl
dung dịch phản
ứng PCR gồm có: 12.24 μl nước cất, 0.1 μl Taq DNA Polymerase,... KHOA HỌC NĂM 2010 3.5 Xác định
gen kháng Xa21 trong dòng IRBB21 Hình 5: Điện di sản phẩm
PCR gen Xa21 sử
dụng cặp mồi pTA818 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 500 bp 1 Marker; 2: DNA
gen Xa21 chuẩn, 3-12 các cá thể nghiên cứu Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 Bảng 4: Kết quả
lây nhiễm các cá thể dòng IRBB21... 15μl phản
ứng gồm có 10μl sản phẩm PCR, 0,3μl enzyme DraI 10unit/ μl, 1,5μl buffer B, 3,2μl nước Hỗn hợp được ủ
ở 37ºC trong ít nhất 6 tiếng + Sản phẩm
PCR được điện di trên gel agarose 1,5% Bản gel được nhuộm bằng Ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010
Lây nhiễm
nhân tạo xác... quả
lây nhiễm các cá thể dòng IRBB4 với chủng vi khuẩn 2A
và 3A Cây 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2A R R R R R R R R R R 3A S S S S S S S S S S
Chủng R: Resistance (Kháng); S: Succeptable (Nhiễm) Phan Thị Hương, Nguyễn Thị Vân Anh, Bùi Văn Công, Hoàng Văn Dương HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM 2010 3.3 Xác định
gen kháng xa5 trong dòng IRBB5 Hình 3: Điện di sản phẩm
PCR gen xa5... Có 2 nguyên
nhân gây lẫn tạp: - lẫn cơ giới
và lẫn sinh học Trong nghiên cứu này 4 dòng được tiến hành xác định
gen bằng chỉ thị phân tử thì có 2 dòng bị lẫn Các vệt băng của cây lẫn đều là các vệt băng đồng hợp Mặt khác theo kết quả
lây nhiễm thì những cây bị lẫn lại có phổ kháng nhiễm tương tự như các dòng trong tập đoàn dòng đẳng
gen Điều này . Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây nhiễm nhân tạo Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen kiểm chứng. đề tài Ứng dụng kỹ thuật PCR và lây nhiễm nhân tạo kiểm chứng gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng đẳng gen HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU