Đang tải... (xem toàn văn)
Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ******* PHẠM MINH NHỰT BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***** BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM MINH NHỰT ThS NGƠ XN TUYẾN KHĨA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***** STANDARD CHALLENGE TEST MODEL AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY PRIMARILY INVESTIGATING PATHOGENESIS OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD NGUYEN VAN HAO PHAM MINH NHUT MSc NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: BGH Trƣờng Đại học Nông Lâm TP.HCM thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học tạo điều kiện để chúng em học tập tốt, tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập chúng em suốt năm qua tạo điều kiện thuận lợi để chúng em hồn thành khóa luận tốt nghiệp TS Nguyễn Văn Hảo, ThS Ngơ Xn Tuyến, CN Đồn Văn Cƣờng tận tình bảo, giải đáp vƣớng mắc, khó khăn mà tơi gặp phải suốt q trình thực tập, giúp tơi hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp KS Phạm Thị Tuyết Anh tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài TS Lý Thị Thanh Loan tạo điều kiện thuận lợi trình thực tập Viện Các anh chị phịng Mơ học Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Mơi Trƣờng Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Các anh chị phòng Sinh Học Thực Nghiệm Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ Đức tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành q trình bố trí thí nghiệm Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt bạn thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học 28 chia sẻ cảm xúc vui buồn thời gian học tập giúp đỡ, động viên tơi để tơi hồn thành khóa luận Và vô biết ơn cha mẹ ngƣời thân gia đình ln động viên, giúp đỡ để hồn thành khóa luận Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2006 Sinh viên thực Phạm Minh Nhựt iv TÓM TẮT PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006 “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT Q TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH” Giáo viên hƣớng dẫn: TS NGUYỄN VĂN HẢO ThS NGÔ XUÂN TUYẾN Bệnh đốm trắng virus đốm trắng (WSSV) gây nguyên nhân gây chết hàng loạt tôm sú nuôi lẫn tôm tự nhiên Việt Nam giới Các nghiên cứu trình phát sinh bệnh virus đốm trắng tôm Do việc hiểu rõ q trình phát sinh bệnh virus đốm trắng giúp cho việc tạo phƣơng thức kiểm soát bệnh Kết hợp mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch tơm sú khơng mang virus thơng thƣờng nhằm xác định vị trí xâm nhập virus đốm trắng, phân tích xâm nhiễm tìm nguyên nhân gây chết tơm Tiến trình thí nghiệm đƣợc thực nhƣ sau: tôm không mang virus thông thƣờng đƣợc gây nhiễm cách tiêm vào phần với liều thấp (10 1,5 SID50/ml) liều cao (104,0 SID50/ml) Ở liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo thời điểm sau gây nhiễm Sử dụng phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch để khảo sát mẫu theo thời điểm nhằm khảo sát trình phát sinh bệnh virus đốm trắng tôm sú Các kết thu đƣợc: Các biểu lâm sàng tơm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất đốm trắng, hấp hối chết, đƣợc phát vào thời điểm 36 liều thấp 24 liều cao Vị trí xâm nhập virus đốm trắng tôm sú liều thấp xảy vào thời điểm 12 sau gây nhiễm với tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng thời điểm 33,3 % quan xâm nhiễm chúng tế bào tim với cƣờng độ nhiễm (+) v Ở liều cao, quan phát dƣơng tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 sau tiêm sau nhuộm hóa mơ miễn dịch Tỷ lệ tôm bị nhiễm đốm trắng thời điểm 50 % Và quan xâm nhiễm virus đốm trắng liều cao tế bào tim, mô tạo máu, mang, tuyến anten tế bào màng bao bên gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+) Ở thời điểm 36 sau gây nhiễm liều gây nhiễm tất quan bị nhiễm virus đốm trắng Cƣờng độ nhiễm virus đốm trắng quan gây nhiễm với liều cao liều thấp có khác biệt quan lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dày, biểu mô dƣới vỏ mô liên kết màng bao gan tụy vi MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ iv TÓM TẮT v MỤC LỤC vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi DANH SÁCH CÁC BẢNG xii PHẦN I: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học hệ miễn dịch tôm sú 2.1.1 Miễn dịch không đặc hiệu giáp xác 2.1.2 Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch giáp xác 2.1.3 Hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase 2.1.4 Hệ thống đông máu 2.1.5 Các chất ức chế proteinase 2.1.6 Hệ thống nhận diện không chuyên biệt 2.1.7 Các peptide kháng khuẩn 2.1.8 Peroxynectin 2.2 Bệnh đốm trắng virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1 Bệnh đốm trắng 2.2.1.1 Lịch sử phân bố 10 2.2.1.2 Triệu chứng, bệnh tích 11 2.2.2 Virus đốm trắng 11 2.2.2.1 Phân loại tên gọi 11 2.2.2.2 Hình thái 12 2.2.2.3 Cấu trúc 13 2.3 Quá trình phát sinh bệnh virus đốm trắng 15 vii 2.3.1 Vật liệu gây bệnh 15 2.3.2 Cơ chế gây bệnh 16 2.3.3 Cơ chế lây lan 17 2.4 Mơ hình cảm nhiễm chuẩn virus tơm 18 2.5 Phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch 19 2.5.1 Nguyên lý 19 2.5.2 Kháng nguyên 20 2.5.3 Kháng thể 20 2.5.4 Phƣơng pháp nhuộm 21 2.5.4.1 Phƣơng pháp trực tiếp 21 2.5.4.2 Phƣơng pháp gián tiếp 22 2.5.4.3 Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) 23 2.5.4.4 Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) 23 2.5.4.5 Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) 24 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP 25 3.1 Thời gian địa điểm 25 3.1.1 Thời gian 25 3.1.2 Địa điểm 25 3.2 Vật liệu 25 3.2.1 Vật liệu dụng cụ sử dụng trình gây nhiễm thực nghiệm 25 3.2.1.1 Vật liệu 25 3.2.1.2 Dụng cụ 25 3.2.2 Các hóa chất dụng cụ sử dụng IHC 26 3.2.2.1 Hóa chất 26 3.2.2.2 Vật tƣ 26 3.2.2.3 Thiết bị 26 3.3 Bố trí thí nghiệm 27 3.3.1 Tơm điều kiện thí nghiệm 27 3.3.2 Virus đốm trắng dòng Việt Nam (WSSV-VN) 27 3.3.3 Gây nhiễm virus đốm trắng tôm sú 27 3.3.4 Thời gian theo dõi thu mẫu để khảo sát trình phát sinh bệnh 28 viii 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 28 3.4.1 Phƣơng pháp pha loãng dịch virus 28 3.4.2 Phƣơng pháp thu mẫu tôm 29 3.4.3 Phƣơng pháp nhuộm IHC 30 3.4.4 Xử lý thống kê 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Độc lực virus gốc dòng Việt Nam (WSSV-VN) 35 4.1.1 Các dấu hiệu lâm sàng tỷ lệ gây chết 35 4.1.2 Tỷ lệ nhiễm tôm thí nghiệm theo thời điểm 36 4.2 Khảo sát trình phát sinh bệnh virus đốm trắng dịng Việt Nam tơm sú 37 4.2.1 Quá trình phát sinh bệnh WSSV-VN tôm sú liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) 38 4.2.2 Quá trình phát sinh bệnh WSSV-VN tôm sú liều cao (104,0 SID50/ml) 42 4.2.3 So sánh hai liều gây nhiễm trình phát sinh bệnh 46 4.3 Thảo luận 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 5.1 Kết luận 50 5.2 Đề nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 57 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSSV White Spot Syndrome Virus WSSV-VN White Spot Syndrome Virus – Việt Nam WSSV-TL White Spot Syndrome Virus – Thailand WSD White Spot Disease MBV Monodon Baculovirus YHV Yellow Head Virus proPO Prophenoloxidase PO Phenoloxidase AMPs Antimicrobial Peptides LPS Lipopolysaccharide PG Peptidoglycan PPAE Prophenoloxidase Activating Enzyme CP Clotting Protein TGase Transglutaminase PAMPS Pathogen-associated Molecular Patterns PRR (PRP) Pattern Recognition Receptor (protein) GBP Beta Glucan Binding Protein LPBP Lipopolysaccharide binding protein ICTV International Committee on Taxonomy for Virus SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SID Shrimp Infectious Dose LD Lethal Dose IHC Immunohistochemistry ctv cộng tác viên x ... Sản II, thực đề tài ? ?Bước đầu khảo sát trình phát sinh bệnh (pathogenesis) virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) tôm sú (Penaeus mondon) sử dụng mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn. .. (immunohistochemistry)” 1.2 Mục đích Thực gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus tôm sú sử dụng liều virus SID50/ml đƣợc chuẩn độ xác định nhằm khảo sát trình phát sinh bệnh virus đốm trắng tôm phƣơng pháp hóa mơ... CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***** BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA
