BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH Chuyên ngành : Vi sinh vật Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS TRẦN THANH THỦY TS VÕ THỊ HẠNH Thành phố Hồ Chí Minh – 2007 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thanh Thủy, TS Võ Thị Hạnh- Người hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tất Thầy Cô Bộ môn Vi sinh đặc biệt cô Tuyến Ths Phương phụ trách phịng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, q Thầy Cơ khoa Sinh học, tồn thể q Thầy Cơ tận tình giảng dạy suốt khóa học Tơi xin gởi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục đào tạo tỉnh An Giang, Trường THPT Vĩnh Trạch – An Giang, người thân gia đình, bạn bè, giúp đỡ, động viên tơi suốt thời gian học Tác giả luận văn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP : Adenozin mono photphat CAP : Cataleolite gene Activator Protein CMCase : Carbomexymethyl cellulase CMC : Carboxymethyl cellulose CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBHI : Exoglucanase I CBH II : Exoglucanase II DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic Enzym : Enzyme EG : Endoglucanase EGI : Endoglucanase I EGII : Endoglucanase II IU : Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ) KHV : Kính hiển vi KL : Khuẩn lạc MT : Mơi trường PTN : Phịng thí nghiệm PGA : Potato glucose agar RNM : Rừng ngập mặn VSV : Vi sinh vật MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Sự hữu rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ kết 25 năm phục hồi phát triển nổ lực to lớn quyền nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh Vào ngày 21 tháng năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO công nhận RNM Cần Giờ khu dự trữ sinh Việt Nam [55] RNM Cần Giờ nơi lưu trữ nguồn gen sinh vật q bền vững, có khả chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt Là nơi có hệ VSV vơ phong phú đa dạng nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., nấm sợi chiếm số lượng lớn Nấm sợi đóng vai trị quan trọng vịng tuần hoàn vật chất lượng hệ sinh thái RNM, nhờ có khả sinh loại enzym ngoại bào cellulase, protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu… Đặc biệt, enzym cellulase nấm sợi sống RNM sinh lớn Do thảm thực vật dày đặc RNM Cần Giờ nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi cho chủng nấm sợi có khả sinh enzym Enzym cellulase hệ enzym bao gồm loại enzym: C1, Cx, βglucosidase, có khả hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose Enzym cellulase ứng dụng nông nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, q trình li trích chất từ thực vật, việc phân hủy phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% số tỷ USD thu từ lượng enzym công nghiệp bán giới gồm enzym cellulase, hemicellulase pectinase Đến năm 2005, thị trường enzym công nghiệp giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại lượng lớn nguồn enzym cellulase để giải vấn đề sản xuất xử lý ô nhiễm MT Việt Nam nước nhiệt đới có nơng nghiệp phong phú, đa dạng đà phát triển Vì vậy, lượng phế thải nông nghiệp dồi dào, với công nghiệp hóa, đại hóa đất nước, nhiễm MT trở thành nguy thật Thành phần phế thải rắn sinh hoạt công, nông, lâm nghiệp cellulose Trong đó, RNM Cần Giờ kho dự trữ chủng VSV có hoạt tính enzym cao chưa khai thác Các cơng trình khoa học nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ bỏ ngõ Từ sở khoa học thực tiễn gợi ý cho chọn đề tài: “Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Lịch sử vấn đề nghiên cứu  Các công trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase Khả sinh enzym cellulase chủ yếu tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma Aspergillus Ở Mỹ, năm 1983 PTN Quân đội Mỹ Natik trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase Sau đó, gây biến chủng chọn lọc biến chủng QM9414 có khả sinh cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74] Năm 1998, YU nuôi cấy T reesei Rut 30 MT chứa 5% bột cellulose 1% cám mì, thu hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68] Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả sinh tổng hợp enzym polygalacturonase, cellulase, xylanase protease từ A niger 3T5B8 nguồn phụ phế liệu nông nghiệp khác phương pháp lên men bán rắn ứng dụng enzym việc tách chiết dầu thực vật [61] Năm 2002, theo báo cáo gần CORAL, dịch nuôi cấy A niger MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát có hai vạch có hoạt tính CMCase trọng lượng phân tử 83.000 50.000 Dalton [67] Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu sinh tổng hợp số đặc tính cellulase (typ CMCase) A niger VS-1 MT lên men bán rắn [40] Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu nấm sợi T reesei sinh tổng hợp enzym cellulase MT lỏng với nguồn cacbon CMC [40] Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22] Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh nghiên cứu khả sinh tổng hợp đặc điểm cellulase A niger Rnnl 363 Châu Hoàng Vũ nghiên cứu thu nhận tinh enzym cellulase từ nấm mốc T reesei phương pháp lên men bán rắn [24], [57] Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả sinh tổng hợp enzym cellulase từ T reesei A niger MT lên men bán rắn [40] Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sinh tổng hợp cảm ứng pectinase cellulase số chủng nấm mốc [27]  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM Cho đến nay, giới có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu phân lập phân loại nấm sợi hệ sinh thái RNM Nhưng kết nghiên cứu sơ sài, chưa đáp ứng nhu cầu hiểu biết đa dạng nấm sợi vai trò chúng hệ sinh thái RNM [64] Trước đây, người ta cho điều kiện MT RNM khắc nghiệt, khơng thích hợp cho sinh trưởng phát triển nấm sợi Tuy nhiên, nghiên cứu gần cho thấy điều kiện sống đặc biệt vậy, đường trao đổi chất nấm sợi khác đường trao đổi chất VSV đất liền Vì vậy, có sản phẩm trao đổi chất có tính chất đặc biệt hơn, khác lạ có enzym, chất kháng sinh …[18] Nhưng đến chưa có cơng trình sâu nghiên cứu hoạt tính sinh học chủng nấm sợi từ RNM Ở Việt Nam, năm 2000 có thơng báo Mai Thị Hằng cs nấm sợi RNM Năm 2002, tác giả tiếp tục nghiên cứu đa dạng, nghiên cứu khả diệt côn trùng khả phân giải cacbua hydro nấm sợi từ RNM hai tỉnh Nam Định, Thái Bình Riêng RNM Cần Giờ có số nghiên cứu phân lập Cho đến nay, chưa có nghiên cứu khả sinh enzym cellulase chủng nấm sợi RNM Cần Giờ [19], [20], [21] Mục đích nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ Đề xuất hướng ứng dụng chủng nấm sợi phân lập Đối tượng nghiên cứu - Hệ sinh thái RNM Cần Giờ - Nấm sợi có khả sinh enzym cellulase RNM Cần Giờ - Enzym cellulase sinh từ nấm sợi Phạm vi nghiên cứu Do hạn chế thời gian nên đề tài nghiên cứu phân lập chủng nấm sợi xã huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đông, xã Tam Thôn Hiệp, xã Long Hịa, xã Thạnh An, xã Lý Nhơn Sau đó, nghiên cứu số chủng nấm sợi có khả sinh loại enzym cellulase hệ enzym Đề tài thực PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ - Tuyển chọn số chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase cao - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa phân loại chủng nấm sợi tuyển chọn - Nghiên cứu yếu tố MT ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển sinh tổng hợp enzym cellulase chủng chọn - Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy chất phế thải, góp phần hạn chế nhiễm MT Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ - Phương pháp vi sinh - Phương pháp hóa sinh - Phương pháp thực nghiệm - Phương pháp thống kê toán học Dự kiến cấu trúc Luận văn gồm phần mở đầu, chương phần kết luận kiến nghị trình bày sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết bàn luận Kết luận kiến nghị Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ RNM chiếm phần đáng kể kiểu rừng ngập nước, thường tồn vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Trên giới khoảng 15 triệu RNM phân bố vùng bờ biển có bùn, cửa sơng lớn, vịnh cạn đầm mặn giáp với biển RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, “lá phổi xanh” thành phố Có tác dụng giảm tốc độ gió, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xói lở bảo vệ bờ biển, bờ sơng, điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi tạo MT phát triển ngành thủy sản Bên cạnh đó, RNM Cần Giờ nơi cung cấp thức ăn, nơi cư trú, sinh sản loài thủy sinh vật động vật có xương sống cạn Hiện nay, Cần Giờ địa điểm du lịch hấp dẫn với 3.000 - 5.000 du khách đến tham quan tuần [83] RNM Cần Giờ có diện tích khoảng 29,380 chiếm 41,18 % đất huyện Cần Giờ [87] Khí hậu nóng ẩm chịu chi phối quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng đến tháng 10, mùa khô từ tháng 11 đến tháng Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm Nhiệt độ trung bình 25,80C, biên độ nhiệt dao động ngày từ 5-70C Chế độ bán nhật triều không Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1] Một nghiên cứu cho biết RNM Cần Giờ có 157 loài thực vật; 63 loài phiêu sinh vật; 130 loài Tảo thuộc ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 lồi động vật đáy khơng xương sống tơm, cua, sị ốc Ngồi ra, cịn có 120 lồi cá, có lồi có giá trị kinh tế cao cá Ngát, cá Dứa, cá Chẽm; 31 lồi bị sát cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 loài hữu nhũ khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng 145 loài chim [83] Đây nguồn thức ăn tốt cho hệ nấm sợi sống RNM Nấm sợi có khả tiết hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có cây, thân RNM thành glucose để sử dụng Ngồi ra, nấm sợi cịn sinh loại enzym khác protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tơm, cua, ốc, xác chết lồi động vật khác thành chất dinh dưỡng chúng hấp thu [1] Hình 1.1 Bản đồ RNM Cần Giờ [83] Vậy, hệ nấm sợi mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn, nhân tố thiếu chu trình chuyển hóa vật chất RNM Cần Giờ Chúng sử dụng chất hữu từ thảm thực vật hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời có tác dụng làm giảm nhiễm MT RNM Cần Giờ 1.2 Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase Rất VSV có khả sinh tất loại enzym cần thiết để phân giải cellulose dạng tinh thể Chúng phải tiết hệ enzym phức tạp, có khả phân hủy cellulose theo phương thức khác thủy phân, oxy hoá [51], [52] Cellulose bị phân rã tác dụng vi khuẩn háo khí kỵ khí Song khả phân hủy cellulose không nấm, vi khuẩn thường tạo enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp 0,1g/l [51] Cellulase sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn cỏ Ruminococcus albus (Berger  Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi chủng A guamensis MT 6C: 4BM, chủng P oxalicum MT 6C: 4MD, chủng A fumigatus MT 6C: 4GL Bổ sung thêm 0,5% NH4NO3, dùng HCl, NaOH điều chỉnh pH độ pH 4, 5, 6, 7, Nuôi thời gian 36- 48 Ly trích enzym xác định hoạt độ CMCase theo phương pháp 2.2.3.1 Kết ghi nhận bảng 3.16, đồ thị 3.9 Bảng 3.16 Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ enzym CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng A guamensis pH4 28,28 pH5 48,85 pH6 56,85 pH7 56,51 pH8 28,26 P oxalicum 28,18 55,99 56,08 56,15 34,89 A fumigatus 28,38 53,45 54,5 55,89 53,26 (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo cơng thức phần 2.2.3.1) - Chủng A guamensis có hoạt độ CMCase cao pH6 (56,86 IU/g) - Chủng P oxalicum có hoạt độ cao 56,15 IU/g A fumigatus có hoạt độ cao 55,89 IU/g pH7 Kết thống với nghiên cứu Hoàng Quốc Khánh (2000) khả sinh enzym cellulase A niger RNNL-363 [24] Ở pH thấp (8) hoạt độ CMCase chủng nấm sợi giảm mạnh Nguyên nhân pH thấp, cao làm bất hoạt số enzym cellulase làm cố định enzym bên khuẩn ty nấm, enzym khơng tiết ngồi sợi nấm nên hoạt độ giảm [29] Kết minh họa lại đồ thị 3.9 mức độ phát triển (mm) 25 20 15 10 pH pH A guamensis pH P oxalicum pH pH A fumigatus pH độ pH Đồ thị 3.9 Ảnh hưởng độ pH đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Riêng chủng A fumigatus MT pH8 tổng hợp enzym cellulase cao, nên thích hợp với điều kiện sống RNM Cần Giờ  Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi: - Chủng A guamensis MT 6C: 4BM, pH6 - Chủng P oxalicum MT 6C: 4MD, pH7 - Chủng A fumigatus MT 6C: 4GL, pH7 Bổ sung thêm 0,5% NH4NO3 Điều chỉnh độ ẩm nước biển vô trùng độ ẩm 50%, 55%, 60%, 70%, 75% Sau 36-48 ni cấy, ly trích enzym xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1 Kết ghi nhận bảng 3.17, đồ thị 3.10 Bảng 3.17 Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng A guamensis 50% 38,84 55% 56,28 60% 56,78 70% 55,48 75% 10,35 P oxalicum 55,9 56,6 56,29 56,15 28,11 A fumigatus 53,69 56,07 56,41 56,52 36,77 (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo công thức phần 2.2.3.1) - Chủng A guamensis có hoạt độ CMCase cao độ ẩm 60% (56,78 IU/g) Kết phù hợp với báo cáo Kim cs (1985) tốc độ sinh trưởng tối ưu Trichoderma reesei độ ẩm 60%, sinh enzym cellulase tối đa độ ẩm khoảng 50% [53] - Chủng P oxalicum có hoạt độ CMCase cao độ ẩm 55% (56,6 IU/g) - Chủng A fumigatus có hoạt độ CMCase cao độ ẩm 70% (56,52 IU/g) C M C a s e (I U /g ) Kết minh họa lần đồ thị 3.10 60 50 40 30 20 10 50% A guamensis 55% P oxalicum 60% A fumigatus 70% 75% độ ẩm Đồ thị 3.10 Ảnh hưởng độ ẩm đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Các tác giả Toyama Ogawa (1997) nhận xét chủng nấm sợi khác cần độ ẩm khác cho trình phát triển chúng Khi tăng độ ẩm thích hợp có tác dụng làm chất phồng lên, tăng độ xốp tạo điều kiện cho nấm sợi tiếp xúc với chất dễ dàng Nếu tăng độ ẩm cao làm chất ẩm, độ xốp giảm ngăn khuếch tán O2 từ bên vào MT, sinh trưởng nấm chậm khả sinh enzym giảm [30]  Ảnh hưởng độ mặn đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi ba chủng nấm theo điều kiện giống ảnh hưởng độ ẩm Điều chỉnh độ ẩm nước muối có nồng độ 0%, 3%, 5%, 10%, 20% Ni thời gian thích hợp, ly trích enzym theo phương pháp 2.2.2.6 xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1 Kết bảng 3.18 Bảng 3.18 Ảnh hưởng độ mặn đến sinh tổng hợp enzym cellulase 0% 51,98 Hoạt độ CMCase (IU/g) 3% 5% 10% 55,32 48,17 28,43 20% 22,41 P oxalicum 53,49 55,56 40,3 28,31 26,8 A fumigatus 53,47 54,60 48,44 14,15 13,96 Tên chủng A guamensis (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo cơng thức phần 2.2.3.1 ) Đối với nấm sợi RNM khả chịu mặn đặc điểm đặc trưng chúng Qua kết bảng 3.18 ta thấy ba chủng có hoạt độ CMCase cao MT khơng có muối, sinh enzym CMCase cao MT có nồng độ muối 3%, sau giảm dần đến 20% C M C a se ( IU /g ) Kết minh họa lại đồ thị 3.11 60 50 40 30 20 10 0% A guamensis 3% 5% P oxalicum A fumigatus 10% 20% Độ mặn Đồ thị 3.11 Ảnh hưởng độ mặn đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi  Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase ba chủng nấm sợi Tiến hành nuôi ba chủng MT giống MT xác định ảnh hưởng độ mặn Ly trích enzym xác định hoạt tính CMCase theo phương pháp 2.2.3.1 Kết ghi nhận bảng 3.19, đồ thị 3.12 Bảng 3.19 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase Hoạt độ CMCase (IU/g) Tên chủng 300C 400C 500C 25 C 26,01 56,81 52,68 36,15 A guamensis 28,24 56,88 56,58 46,07 P oxalicum 28,22 56,49 56,24 47,21 A fumigatus (Ghi chú: Số liệu tính từ phụ lục theo công thức phần 2.2.3.1) Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến khả sinh enzym nấm sợi Kết cho thấy ba chủng có hoạt lực cao 30 - 400C, cao 300C CMCase (IU/g) Kết minh họa lại đồ thị 3.12 60 50 40 30 20 10 25 A guam ensis 30 P oxalicum 40 A fum igatus 50 nhiệt độ Đồ thị 3.12 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt độ CMCase Nhiệt độ sinh trưởng trùng với nhiệt độ sinh CMCase ba chủng nấm nghiên cứu (300C), nhiệt độ phổ biến RNM Cần Giờ Chứng tỏ chủng nấm sợi chúng tơi nghiên cứu có khả đưa vào sản xuất với điều kiện nhiệt độ đất liền Kết phù hợp với kết Norkrans (1967) chủng nấm có hoạt tính phân giải cellulose cao loại nấm ưa ấm, phát triển thích hợp 25-30oC [53] Tóm lại, điều kiện MT thích hợp cho sinh tổng hợp CMCase ba chủng nấm sợi nghiên cứu bảng 3.20 Bảng 3.20 Các điều kiện MT thích hợp cho sinh tổng hợp CMCase ba chủng nấm sợi Chủng nấm A guamensis Điều kiện MT 6C:4BM Nguồn cacbon (56,88 IU/g) NH4NO3 Nguồn nitơ (55,8 IU/g) pH6 pH (56,85 IU/g) 60% Độ ẩm (56,78 IU/g) 3% Độ mặn (55,32 IU/g) 300C Nhiệt độ (56,81 IU/g) 48 Thời gian (56,58 IU/g) P oxalicum 6C:4MD (56,56 IU/g) NH4NO3 (56,56 IU/g) pH7 (56,15 IU/g) 55% (56,6 IU/g) 3% (55,56 IU/g) 300C (56,88 IU/g) 36 (56,87 IU/g) A fumigatus 6C:4GL (60,8 IU/g) NH4NO3 (56,45 IU/g) pH7 (55,89 IU/g) 70% (56,52 IU/g) 3% (54,60%) 300C 56,49 IU/g) 36 (56,49 IU/g) 3.4 Nghiên cứu đặc tính sinh học khác ba chủng nấm sợi  Hoạt tính enzym ngoại bào Chúng tơi tiến hành ni nấm sợi MT xốp sở (MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp mục 2.2.16 Sau đó, kiểm tra khả sinh loại enzym cellulase, protease, amylase, kitinase theo phương pháp phần 2.2.3.2, kiểm tra khả phân giải dầu theo phương pháp 2.2.3.4 Kết bảng 3.20, đồ thị 3.13, hình 3.7-3.10 Bảng 3.21 Khả tạo enzym ngoại bào ba chủng nấm sợi Tên chủng cellulase (D-d), mm A guamensis P oxalicum A fumigatus 29 27 27,5 kitinase amylase protease (D-d), mm (D-d), mm (D-d) mm 15,5 15,5 21 18 14 21 24 17,5 21 Phân giải dầu 0 Kết bảng 3.21 cho thấy ba chủng có hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào mạnh Ngồi khả sinh enzym cellulase cao, ba chủng nấm sinh enzym amylase, protease, kitinase cao Sự kết hợp hoạt động enzym giúp phân giải mạnh biopolymer, nguồn chất phổ biến RNM Cần Giờ Đặc biệt, ba chủng nấm có hoạt tính enzym kitinase cao (D-d= 24mm; 17,5mm; 21mm) Nhờ chúng phân hủy xác động vật biển loài giáp xác, vỏ tôm, cua…hạn chế mùi hôi thối làm ô nhiễm MT RNM Cần Giờ Tuy nhiên ba chủng khơng có khả sinh enzym phân giải dầu Vì RNM Cần Giờ nằm sát biển nên thường bị nhiễm dầu tai nạn chìm tàu dầu Nếu chủng nấm sợi sinh trưởng RNM Cần Giờ có khả phân giải dầu góp phần làm MT Ba chủng nấm khơng có đặc tính quý giá (D-d) mm Kết minh họa lại biểu đồ 3.3 30 25 20 15 10 cellulase protease A guamensis amylase P oxalicum Kitinase Phân giải dầu A fumigatus Biểu đồ 3.3 Khả tạo enzym, phân giải dầu ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.7 Hoạt tính cellulase ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.8 Hoạt tính enzym amylase ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.9 Hoạt tính enzym protease ba chủng nấm sợi (a) (b) (c) Hình 3.10 Hoạt tính enzym kitinase ba chủng nấm (Ghi chú: a A guamensis; b P oxalicum ; c A fumigatus)  Hoạt tính kháng sinh ba chủng nấm sợi Chúng tiến hành nuôi chủng nấm sợi MT xốp sở (MT11), chiết dịch enzym theo phương pháp mục 2.2.2.6 Kiểm tra hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.3 Kết bảng 3.22, hình 3.113.12 Bảng 3.22 Khả sinh kháng sinh ba chủng nấm sợi Tên chủng E.coli Bacillus subtillis (D-d), mm (D-d), mm A guamensis 5,0 1,0 P oxalicum 4,0 5,0 A fumigatus 1,0 2,0 (Ghi : Số liệu kết trung bình lần lặp lại thí nghiệm) (a) (b) (c) Hình 3.11 Hoạt tính kháng E coli ba chủng nấm a A guamensis; (a) b P oxalicum ; (b) c A fumigatus (c) Hình 3.12 Hoạt tính kháng B subtilis ba chủng nấm sợi a A guamensis; b P oxalicum ; c A fumigatus Qua kết ta thấy ba chủng nấm có khả sinh kháng sinh tiêu diệt VSV gây bệnh, mức độ đối kháng yếu Chủng P oxalicum có hoạt tính kháng sinh cao hai chủng cịn lại, điều phù hợp với cơng trình nghiên cứu kháng sinh Penicilin sinh từ nấm Penicillium Như vậy, qua kết khảo sát ta thấy ba chủng nấm sợi tổng hợp lúc nhiều loại enzym thủy phân ngoại bào mạnh cellulase, protease, amylase, kitinase, chất kháng sinh chống lại VSV gây bệnh E.coli, B subtilis 3.5 Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzym cellulase thô từ ba chủng nấm sợi 3.5.1 Thử nghiệm khả đường hóa giấy in, giấy báo cũ Để thấy khả ứng dụng enzym cellulase thu nhận từ chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, tiến hành khảo sát khả đường hóa giấy in, giấy báo cũ Ba chủng nấm sợi ni cấy điều kiện thích hợp để có hoạt tính CMCase cao nghiên cứu Sau ly trích dung dịch đệm Na-acetate 50mM pH5, lọc thu dịch enzym để đường hóa giấy in, giấy báo cũ theo phương pháp 2.2.4.1 Sau đo hàm lượng đường khử thuốc thử DNS dựa vào đường chuẩn glucose phụ lục Kết trình bày qua bảng 3.23 Bảng 3.23 Khả đường hóa enzym cellulase từ ba chủng nấm Dịch chiết enzym cellulase từ chủng nấm sợi Ascotricha guamensis % đường hóa 11,41 Penicillium oxalicum 10,12 Aspergillus fumigatus 14,62 Hổn hợp enzym từ chủng 26,02 Bảng 3.23 cho thấy, enzym cellulase từ Ascotricha guamensis có khả đường hóa khoảng 11,41%, từ Penicillium oxalicum đường hóa khoảng 10,124%, Aspergillus fumigatus có khả đường hóa 14,62% Kết thấp so với nghiên cứu Trần Thạnh Phong (2004) dịch chiết từ Trichoderma Hỗn hợp dịch nuôi cấy chủng theo tỉ lệ 1:1:1 có khả đường hóa cao chủng riêng rẽ (26,02%) Do có số chủng nấm sinh loại enzym cellulase không phân cắt triệt để cellulose Các chủng nấm khác sinh loại enzym endoglucanse hay exoglucase nhiều khác Các enzym phối hợp hoạt động phân cắt cellulose thành glucose mạnh hơn, triệt để Như vậy, q trình sử dụng enzym cần có phối hợp dịch chiết enzym ba chủng nấm sợi 3.5.2 Bước đầu thử nghiệm dịch chiết enzym cellulase thô từ chủng nấm sợi vào việc phân hủy rơm rạ làm phân bón Sau chọn ba chủng, tiến hành ủ đống rơm rạ phương pháp ủ quy mô nhỏ theo phương pháp 2.2.4.2  Theo dõi thay đổi số tiêu đống ủ Sau tháng, tiến hành theo dõi số tiêu so sánh với ủ hộp xốp có bổ sung dịch ni cấy nấm sợi Kết bảng 3.24 Ở lơ thí nghiệm nhiệt độ tăng cao đối chứng tác động dịch chiết enzym phân cắt thành phần cellulose rơm rạ, trình trao đổi chất tăng nhanh nên nhiệt độ tăng cao Đến tuần cuối cùng, trình phân giải rơm rạ hoàn tất, nhiệt độ giảm Trong mẫu đối chứng bắt đầu phân cắt sợi rơm nên nhiệt độ vừa tăng cao thấp so với mẫu thí nghiệm (320C) Kết mẫu thí nghiệm sợi rơm bị phân hủy thành mùn nên màu sẫm lại, nhũn mềm làm phân bón cho trồng Cịn mẫu đối chứng sợi rơm màu nâu nhạt, chưa mềm nhũn Bảng 3.24 Một số tiêu theo dõi mẫu ủ Mẫu ủ Đối chứng Chỉ tiêu - Nhiệt độ đống ủ Thấp (320C) Thí nghiệm Tăng cao (380C) tuần đầu - Nhiệt độ đống ủ Cao (350C) Thấp (320C) tuần cuối - Độ giảm chiều cao 12cm 20 cm đống ủ - Màu sắc rơm rạ Nâu nhạt - Độ dai rơm Sợi mềm, Nâu sẫm không Sợi rơm mềm, nhũn nhũn Ghi chú: Đối chứng: không bổ sung dịch ni cấy Thí nghiệm: Có bổ sung dịch nuôi cấy Từ kết bảng 3.24 ta thấy việc bổ sung VSV vào đống ủ có hiệu ủ nhờ VSV tự nhiên có đống ủ, rút ngắn thời gian ủ, giảm ô nhiễm MT gây thời gian ủ kéo dài Mẫu ủ khơng có bổ sung dịch ni cấy nấm sợi phân hủy thời gian chậm hơn, phải kéo dài đến 65 ngày đạt độ phân hủy giống mẫu ủ có bổ sung dịch enzym  Đánh giá độ chín mẫu ủ Tiến hành trồng đậu theo lơ thí nghiệm đối chứng theo phương pháp 2.2.4.2 (xem kết bảng 3.25) Kết bảng 3.25 cho thấy mẫu bổ sung dịch chiết enzym từ ba chủng cho kết cao mẫu đối chứng Như phân ủ chín có hiệu cao Bảng 3.25 Tỷ lệ hạt nảy mầm, trọng lượng tươi đậu xanh sau ngày trồng phân ủ từ rơm rạ STT Bổ sung dịch chiết Số hạt nảy Tỷ lệ hạt Trọng từ chủng nấm mầm (hạt) nảy mầm lượng tươi (%) thu được(g) Đối chứng 29/57 50,8 55 A guamensis 48/57 84,2 150 P oxalicum 42/57 73,7 120 A fumigatus 36/57 63,2 95 Nhiễm hỗn hợp 50,57 87,7 180 dịch chiết enzym (Đối chứng: Không bổ sung dịch chiết enzym) Mẫu nhiễm dịch chiết từ A guamensis có trọng lượng tươi 150g, tỉ lệ hạt nảy mầm 84,2% cao Do chủng có hoạt độ CMCase cao (55,70 IU/g) nên phân hủy rơm rạ thành mùn cao hai chủng lại Mẫu nhiễm hỗn hợp có lượng tươi 180g, cao mẫu nhiễm A guamensis 30g, cao mẫu nhiễm P oxalicum 50g, cao mẫu nhiễm A fumigatus 85g, đặc biệt cao mẫu không bổ sung dịch nuôi cấy nấm sợi 125g Do hoạt động phối hợp enzym từ chủng khác phân cắt sợi rơm rạ thành mùn tốt Kết đánh giá tốt So với báo cáo Lê Thị Thanh Thủy (2001) kết thấp hơn, so với mức chuẩn để đánh giá độ chín phân ủ trọng lượng tươi 160g chủng A guamensis 150g (93,75%), mẫu nhiễm hỗn hợp dịch chiết cao 180g (112,5%) Như vậy, sử dụng hỗn hợp dịch chiết enzym cho kết cao sử dụng riêng rẽ dịch chiết chủng nấm KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  Kết luận Qua kết thí nghiệm, chúng tơi đưa số kết luận sau: Đã phân lập 312 chủng nấm sợi khác từ RNM Cần Giờ Trong có 114 chủng phân lập từ đất, 96 chủng phân lập từ lá, 102 chủng phân lập từ thân, cành Đã xác định 183/312 chủng chiếm 58,65% Trong đó: + 10/183 chủng sinh enzym mạnh chiếm 5,5% chủ yếu sống đất + /183 chủng sinh enzym mạnh chiếm 3,3% + 20/183 chủng sinh enzym trung bình chiếm 11% + 147/183 chủng sinh enzym yếu chiếm 80,2% Trên sở tuyển chọn ba chủng có hoạt độ cellulase cao là: chủng Đ’0 (55,70 IU/g), chủng Đ’3 (55,01 IU/g) chủng Đ2b (53,10 IU/g) Ba chủng nấm sợi tuyển chọn có nguồn gốc từ đất mặt RNM Cần Giờ định danh sau: - Chủng Đ’0 : Ascotricha guamensis Ames - Chủng Đ’3 : Penicillium oxalicum Currie & Thom - Chủng Đ2b : Aspergillus fumigatus Fresenius Đã xác định điều kiện MT thích hợp cho sinh trưởng sinh tổng hợp cellulase ba chủng nấm sợi là: - Nguồn cacbon tốt chủng A guamensis 6C:4BM (56,88 IU/g), chủng P oxalicum 6C:4MD (56,56 IU/g), chủng A fumigatus 6C:4GL (60,80 IU/g) - Nguồn nitơ tốt NH4NO3 - Độ pH= 6-7 - Độ ẩm MT 55-70% - Độ mặn thích hợp 3% - Nhiệt độ thích hợp 300C - Thời gian thu enzym tốt 36- 48 Kết nghiên cứu đặc tính sinh học ba chủng nấm sợi cho thấy ngồi enzym cellulase, chúng cịn có khả sinh loại enzym protease, amylase, kitinase Mạnh kitinase (24mm) Có khả đối kháng với loại VSV kiểm định (G+, G-) E coli, B subtilis Bước đầu thử nghiệm sử dụng dịch chiết enzym cellulase thô từ ba chủng nấm sợi vào việc đường hóa giấy in, giấy báo cũ cho thấy phối hợp ba chủng với tỉ lệ 1:1:1 cho kết cao nhất; Đồng thời, chúng cịn có khả chuyển hóa nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho trồng, phân ủ đánh giá đạt hiệu cao dịch chiết hỗn hợp (112,5%) Như vậy, sử dụng phối hợp ba chủng nấm sợi cho hiệu cao Tuy nhiên, ba chủng nấm sợi nghiên cứu ta thấy chủng A guamensis phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam có hoạt độ CMCase cao so với hai chủng lại Trong bước đầu thử nghiệm sử dụng chủng cho kết cao Do đó, ta chọn chủng A guamensis nghiên cứu thêm để ứng dụng vào sản xuất  Kiến nghị Nếu có điều kiện nên nghiên cứu thêm số vấn đề để hoàn chỉnh đề tài hơn: - Tách chiết tinh enzym cellulase với hàm lượng hoạt tính cao từ MT ni cấy thích hợp chủng - Tiếp tục thử nghiệm ứng dụng enzym cellulase ba chủng nguồn chất khác để làm tăng hiệu ứng dụng đề tài ... tài: ? ?Nghiên cứu khả sinh enzym cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ? ?? Lịch sử vấn đề nghiên cứu  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase Khả sinh enzym cellulase. .. đích nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ Đề xuất hướng ứng dụng chủng nấm sợi phân lập Đối tượng nghiên cứu - Hệ sinh thái RNM Cần Giờ - Nấm sợi. .. vụ nghiên cứu - Phân lập chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ - Tuyển chọn số chủng nấm sợi có khả sinh enzym cellulase cao - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa phân loại chủng nấm sợi