Đang tải... (xem toàn văn)
Bài viết tiến hành thu thập một số mẫu sữa đã thanh trùng và sữa chưa thanh trùng được thu thập để kiểm tra sự có mặt của một số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm như Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella spp. bằng phương pháp PCR. Đây là một phương pháp kiểm tra nhanh và chính xác do có khả năng nhân bản gene đặc hiệu riêng cho từng vi khuẩn cần nhận biết. Trong 49 mẫu thu thập, có 23 mẫu sữa chưa thanh trùng, 12 mẫu sữa đã thanh trùng và 14 mẫu sữa chua.
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES, STAPHYLOCOCCUS AUREUS VÀ SALMONELLA SPP TRONG CÁC MẪU SỮA THU THẬP TẠI GIA LÂM VÀ BA VÌ, HÀ NỘI ĐẦU NĂM 2019 Nguyễn Thị Minh Huyền1*, Trần Thị Hoa1, Ninh Thị Tuyết Lan1, Trần Thị Hiền2 Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Khoa Sinh học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội (Ngày đến tòa soạn: 30/6/2019; Ngày sửa sau phản biện: 24/11/2019; Ngày chấp nhận đăng: 30/11/2019) Tóm tắt Sữa sản phẩm sữa từ hộ chăn ni bị sữa xung quanh Hà Nội góp phần khơng nhỏ vào sản lượng sữa tiêu thụ Hà Nội Việc sử dụng sữa tươi hay sữa trùng trở nên thường xuyên sinh hoạt hàng ngày người dân Sữa tươi bày bán nhiều số cửa hàng dọc trục đường ven đô đặc biệt vùng Xuân Mai, Ba Vì, Hà Nội hay Phù Đổng, Gia Lâm, Hà Nội Các loại sữa phần lớn trùng đóng chai Hiện chưa có nghiên cứu đánh giá khả nhiễm loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm sữa sản phẩm sữa để đánh giá an toàn tiêu thụ Trong nghiên cứu chúng tôi, số mẫu sữa trùng sữa chưa trùng thu thập để kiểm tra có mặt số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella spp phương pháp PCR Đây phương pháp kiểm tra nhanh xác có khả nhân gene đặc hiệu riêng cho vi khuẩn cần nhận biết Trong 49 mẫu thu thập, có 23 mẫu sữa chưa trùng, 12 mẫu sữa trùng 14 mẫu sữa chua Kết cho thấy có 01 mẫu sữa dê trùng có khả nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus 01 mẫu sữa tươi chưa trùng có khả nhiễm khuẩn Listeria monocytogenes Tất mẫu sữa sữa chua âm tính với Salmonella spp Các mẫu nhiễm khuẩn khẳng định cách đọc trình tự gene Từ khóa: Vi khuẩn, ngộ độc thực phẩm, sữa, nhiễm khuẩn, Hà Nội MỞ ĐẦU Đất nước phát triển kèm theo chất lượng sống người dân nâng cao So với năm cuối kỷ 20 bước sang kỷ 21, việc chăn ni bị sữa sản xuất sữa Việt Nam phát triển mạnh nhiều Sữa Việt Nam khơng cịn hồn tồn sữa bột nhập ngoại chế biến lại mà có nhiều doanh nghiệp hộ nông dân chăn ni bị sữa để cung cấp sữa tươi, tự túc phần nguồn nguyên liệu Chúng ta có hội sử dụng sản phẩm sữa tươi từ bị hay dê ni Việt Nam sản phẩm từ sữa đa dạng Theo thống kê Tổng cục Thống kê ngày 01/10/2018, nước có 294,4 ngàn bị sữa năm 2018, tăng nhiều so với năm 2010 128,6 ngàn Sản lượng sữa năm 2010 đạt 306,7 ngàn tăng lên 936 ngàn vào * Điện thoại: 0947479978 22 Email: ntminhhuyen@ibt.ac.vn Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 4-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC năm 2018 [1] Ngoài doanh nghiệp lớn Vinamilk, TH True Milk, Mộc Châu Milk, sữa nhiều hộ gia đình sản xuất kinh doanh nhỏ lẻ Những hoạt động họ liên quan từ đến 10% sữa tươi địa phương việc bán hàng trực tiếp cho người sử dụng cho người bán lẻ khác, khu vực Hà Nội [2] Sản phẩm họ thường rẻ so với sản phẩm từ công ty lớn họ bớt bước trung gian thường làm tăng thêm giá sản phẩm đến người tiêu dùng [3] Mặc dù họ nhà sản xuất nhỏ, sản phẩm họ ngày nhiều người biết đến Do đó, sản phẩm họ đóng vai trị định thị trường sữa sản phẩm sữa miền bắc Việt Nam Tuy nhiên, với tình hình việc kiểm sốt chất lượng sữa quan trọng sữa sản phẩm dễ nhiễm khuẩn q trình sản xuất, dụng cụ khơng tiệt trùng cẩn thận Sự nhiễm khuẩn sữa sản phẩm sữa không từ sữa thô mà cịn từ q trình chế biến, vận chuyển dự trữ sữa khơng cách [4, 5] Do đó, việc đánh giá chất lượng sữa sản phẩm từ sữa cách kiểm tra khả nhiễm khuẩn để tránh bệnh bùng phát quan trọng Nghiên cứu bước đầu thiết lập phương pháp đánh giá nhanh khả nhiễm số vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella spp PCR Đây phương pháp cho kết xác rút ngắn thời gian nhiều so với phương pháp vi sinh truyền thống VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Chủng chuẩn: chủng Salmonella spp., Vibrio cholerae O1 Công ty Cổ phần Công nghệ vi sinh môi trường, Hà Nội cung cấp; Chủng Staphylococcus aureus chủng Escherichia coli Shigella tặng Bộ môn Vi sinh, Đại học Y Thái Nguyên; Chủng Listeria monocy togenes mua khoa Vi sinh vật, Bệnh viện Quân Y 103, Hà Đông, Hà Nội Các chủng phân lập nơi Kit tinh ADN, thang chuẩn ADN 1kb (Thermo scientific, Đức); hóa chất để chạy PCR (Phusa Biochem, Việt Nam); thang chuẩn Ladder 100 bp (BioFact, Korea) Các hóa chất khác sử dụng nghiên cứu EDTA, TrisHCl, PBS, lysozyme, acetic acid, agarose…được mua từ hãng chuyên sản xuất uy tín giới, theo chuẩn cho sinh học phân tử Sữa sữa chua thu mua chủ yếu hai vùng Gia Lâm Ba Vì, Hà Nội Mẫu Ba Vì thu mua ngẫu nhiên đại lý dọc trục đường Xuân Mai, Ba Vì Mẫu sữa chưa trùng Gia Lâm thu mua hộ chăn nuôi bò hai xã Phù Đổng Dương Hà họ mang đến bán cho đại lý công ty sữa lớn Sau thu, mẫu lưu trữ tủ đông 20oC sử dụng để tách chiết ADN Thiết kế mồi cho PCR: Mồi thiết kế cho phản ứng PCR tham khảo từ số tài liệu nghiên cứu tác giả tối ưu đặc hiệu cho vi khuẩn Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus dựa phần mềm online Primer Plus Trong mồi cho Listeria monocytogenes đặc hiệu cho gene hly A, gene mã hóa cho listeriolysin O (LLO) có liên quan đến thủy phân màng không bào vật chủ Gene tồn tất chủng Listeria monocytogenes cần thiết để tạo đầy đủ độc lực [6] Mồi đặc hiệu cho Salmonella spp thiết kế dựa gene sdiA, gene mã hóa cho thụ thể tín hiệu chất điều hòa họ LuxR Các protein type LuxR điều hòa nhân tố phụ đóng góp cho tồn hình thành tập đồn ruột vi khuẩn Salmonella spp [7] Đối với Staphylococcus aureus, mồi thiết kế đặc hiệu cho gene nuc, gene mã hóa cho nuclease ổn nhiệt Staphylococcus aureus Đây endonuclease, phân hủy ADN ARN hoạt động enzyme chịu 100oC 1h [9] Mồi thiết kế đặc hiệu để Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) 23 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC nhận biết có mặt vi khuẩn trình bày bảng đây: Bảng Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR Gene Tên mͭc primer tiêu Trình t (5’-3’) LL4R CGC CAC ACT TGA GAT AT Ĉ͡ dài ÿo̩n Tm Chͯng vi khu̱n Tài li͏u gene nhân (oC) tham kh̫o nh̵n bi͇t b̫n 50 lyA LL5F AAC CTA TCC AGG TGC TC 52,4 SdiA1 AAT ATC GCT TCG TAC CAC 51,6 SdiA2 GTA GGT AAA CGA GGA GCA G 57,3 Stanucf ATA GGG ATG GCT ATC AGT AA 54,3 sdiA nuc Stanucr TAC CAT TTT TCC ATC AGC ATA A 54,7 Listeria monocytogenes 519 bp [6] Salmonella spp 257 bp [7] Staphylococcus aureus 476 bp Nghiên cӭu [9] 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tách ADN tổng số chủng chuẩn ADN tổng số chủng vi khuẩn Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Staphylococcus aureus số chủng khác Vibrio cholerae O1, Escherichia coli Shigella tách sử dụng Kit Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit; theo protocol nhà sản xuất dành cho vi khuẩn gram âm (Salmonella spp., Escherichia coli Shigella, Vibrio cholerae O1) vi khuẩn gram dương (Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus) Cụ thể phương pháp tách tóm tắt sau: Đối với vi khuẩn Gram âm, thu tế bào ống ly tâm 1,5 ml Hòa lại cặn tế bào 180 µL dung dịch Digestion, thêm 20 µL dung dịch protein K trộn Ủ mẫu 56oC 30 phút Thêm 20 µL dung dịch RNase A, vortex ủ thêm 10 phút nhiệt độ phịng Thêm 200 µL dung dịch lysis vào mẫu trộn Thêm 400 µL 50% cồn tinh khiết trộn Sau chuyển tồn dịch sang cột, ly tâm 6000 g phút Rửa mẫu với 500 µL Wash buffer I Wash buffer II Sau ly tâm thêm phút để loại cồn cịn cột Chuyển cột sang ống mới, thêm 100 200 µL Elution buffer ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm tốc độ 8000 g/phút phút Loại bỏ cột dự trữ ADN 20oC sử dụng Nồng độ ADN xác định cách đo hấp thụ với máy nanodrop Kết thu được phần mềm tự động máy tính nồng độ ADN theo ng/µL Các mẫu ADN lưu trữ tủ âm 20oC đến sử dụng để thực thí nghiệm Đối với vi khuẩn gram dương, bước tách chiết tiến hành tương tự, ngoại trừ bước ly giải tế bào Cụ thể sau: dung dịch ly giải tế bào cho vi khuẩn gram dương: 20 mM TrisHCl, pH 8,0, mM EDTA, 1,2% Triton x100, thêm lysozyme đến nồng độ 20 mg/mL trước dùng Đầu tiên, tế bào sau thu ly tâm ủ với 180 µl dung dịch 30 phút 37oC Sau thêm 200 µL dung dịch lysis, 20 µL proteinase K trộn đều, ủ thêm 56oC 30 phút Các bước tiến hành vi khuẩn gram âm Nồng độ ADN xác định cách đo hấp thụ với máy nanodrop tương tự trên, mẫu ADN lưu trữ tủ âm 20oC đến sử dụng để thực thí nghiệm 2.2.2 Tách ADN tổng số từ sữa sữa chua Do ADN từ sữa có nhiều loại (vi khuẩn có sữa, ADN cịn lại từ vật ni cho sữa…), ngồi sữa cịn nhiều thành phần protein khác nên việc tách ADN phức 24 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC tạp Trong nghiên cứu này, sử dụng kit để tách ADN Tuy nhiên bước chuẩn bị trước tách ADN thực sau: 2ml sữa ly tâm 10 phút 10000 g, phút 12000 g, phút 5000 g Phần lớp chất béo dịch loại bỏ Tùy thuộc vào lượng chất béo lại ống mà bước rửa tiến hành sau: thêm 500 µL dung dịch 5x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M trisodium citrate dihydrate) 75 µL dung dịch 40% trisodium citrate dehydrate, trộn đều, ủ nhiệt độ phòng phút, ly tâm tốc độ tối đa phút loại bỏ dịch Lặp lại bước rửa đến loại phần lớn lớp chất béo sữa Phần cặn sử dụng để tách ADN tổng số sử dụng protocol cho vi khuẩn gram dương kit Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit Nồng độ ADN xác định cách đo hấp thụ với máy nanodrop Với sữa chua, việc tách chiết thực với sữa tươi ngoại trừ bước ban đầu sau: Cân gram sữa chua cho vào ống ml Thêm 100 µL 0,4 M NaOH + 75 µL 40% trisodium citrate dehydrate, vortex, ủ nhiệt độ phòng phút ly tâm tốc độ tối đa phút Loại bỏ dịch tiến hành rửa tách ADN với mẫu sữa Nồng độ ADN xác định cách đo hấp thụ với máy nanodrop Kết thu được phần mềm tự động máy tính nồng độ ADN theo ng/µL Các mẫu ADN lưu trữ tủ âm 20oC đến sử dụng để thực thí nghiệm 2.2.3 Chạy PCR kiểm tra kết Hỗn hợp phản ứng PCR trộn sau: 1x PCR buffer 22,5 µL, 10 pmol primer 0,5 µL loại, ADN khn 0,5 µL, nước vừa đủ 25 µL (EZ PCR mix, Phusa Biochem) Phản ứng PCR nhân gene đặc hiệu để nhận biết vi khuẩn thực máy chu trình nhiệt Applied Bioscience Veriti 96 giếng theo chương trình sau: Tiền biến tính 95oC phút; Biến tính 95oC 30 giây; Gắn mồi 52oC ~ 57oC 30 giây đến 50 giây tùy thuộc vào độ dài đoạn sản phẩm PCR; Kéo dài chuỗi 72oC 40 giây; lặp lại bước đến bước cho 30 đến 35 chu kỳ; bước kéo dài chuỗi cuối 72oC phút Sản phẩm phản ứng PCR kiểm tra phương pháp điện di thạch agarose 1% điện 100V thời gian 30 phút kiểm tra kết cách soi với đèn UV visualizer 2.2.4 Khảo sát xây dựng quy trình phát vi khuẩn phản ứng PCR 2.2.4.1 Khảo sát khả bắt cặp đặc hiệu mồi Khả bắt cặp đặc hiệu mồi thiết kế cho loại vi khuẩn đánh giá cách chạy PCR cặp mồi với khuôn ADN loại vi khuẩn làm đối chứng kiểm định Chẳng hạn như, kiểm tra độ đặc hiệu mồi dùng để phát vi khuẩn Listeria monocytogenes, chạy PCR đồng thời cặp mồi với khuôn ADN chủng vi khuẩn khác Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae O1, E coli, Shigella tương tự mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Salmonella spp., Staphylo coccus aureus nghiên cứu Kết điện di sản phẩm PCR khơng xuất vạch dương tính sử dụng khuôn ADN vi khuẩn đối chứng kiểm định đánh giá mồi đặc hiệu cho vi khuẩn nhận biết thiết kế 2.2.4.2 Khảo sát nồng độ ADN tối thiểu phản ứng PCR phát Salmonella spp., Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes Sau tách chiết, nồng độ ADN ban đầu vi khuẩn Salmonella spp., Staphylococcus aureus Listeria monocytogenes là: 77 ng/µL, 39 ng/µL 68 ng/µL ADN ban đầu pha lỗng giảm dần 10 lần theo thứ tự nồng độ từ 101 đến 109 nồng độ ADN sau pha loãng sử dụng để làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu riêng cho khuôn Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% 100V thời gian 30 phút Nồng độ ADN tối thiểu cho phép phản ứng PCR phát chủng vi Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 4-2019) 25 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC khuẩn đánh giá nồng độ ADN thấp xuất vạch ADN dương tính gel điện di agarose 1% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá khả bắt cặp đặc hiệu cặp mồi Sản phẩm PCR xuất giếng số (hình 1A hình 1C), giếng số (hình 1B) với băng rõ nét có kích thước tương ứng với sản phẩm PCR dự kiến (hình 1A: 476 bp cho Staphylococcus aureus, hình 1B: 257 bp cho Salmonella spp hình 1C: 519 bp cho Listeria monocytogenes) Đối với giếng cịn lại hình 1A, 1B, 1C khuôn ADN sử dụng khuôn không đặc hiệu cho cặp mồi Stanucf Stanucr (hình 1A); SdiA1 SdiA2 (hình 1B); LL4R LL5F (hình 1C) khơng có băng sáng xuất giếng Kết thử nghiệm cho thấy cặp mồi Stanucf/r đặc hiệu nhận biết khuôn ADN vi khuẩn Staphylococcus aureus, cặp mồi SdiA1/2 đặc hiệu cho khuôn DNA vi khuẩn Salmonella spp cặp mồi LL4R/5F đặc hiệu cho khn ADN vi khuẩn Listeria monocytogenes Kích thước sản phẩm PCR dự kiến kích thước thực tế so với thang ADN chuẩn điện di có sai lệch q trình điện di phụ thuộc vào cấu trúc chiều phân tử ADN thành phần gel agarose chưa đồng hồn tồn số vị trí 3.2 Khảo sát nồng độ ADN tối thiểu phản ứng PCR nhận biết vi khuẩn Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus Salmonella spp Nồng độ ADN khuôn phản ứng PCR giảm dần cường độ sáng vạch ADN ảnh điện di giảm dần (hình 2) Đối với Staphylococcus aureus nồng độ ADN giảm đến 39 x 104 ng/µL cịn băng mờ khơng rõ nét, đến 39 x 105 ng/µL khơng cịn thấy xuất băng (giếng số hình 2A) Như vậy, nồng độ ADN khn tối thiểu vi khuẩn Staphylococcus aureus thí nghiệm nhận biết phản ứng PCR 39 x 104 ng/µL (hay 3,9 pg/µL) Dưới nồng độ lượng ADN không đủ để tạo sản phẩm PCR quan sát gel điện di Theo nghiên cứu Gandra et al [13], nồng độ ADN Staphylococcus aureus nhận biết PCR khoảng 1,63 pg/µL Như độ nhạy phản ứng PCR Gandra et al hiệu cao so với nghiên cứu Điều độ tinh khiết ADN trong phản ứng PCR nghiên cứu chưa cao 26 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) Hình Đánh giá khả bắt cặp đặc hiệu cặp mồi thiết kế để nhận biết Staphylococcus aureus, Salmonella spp Listeria mono cytogenes ADN chủng vi khuẩn tách chiết sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi Hình A Kết PCR sử dụng cặp mồi Stanucf Stanucr với mẫu ADN Hình B Kết PCR sử dụng cặp mồi SdiA1 SdiA2 với mẫu ADN Hình C Kết PCR sử dụng cặp mồi LL4R LL5F với mẫu ADN M: 1Kb DNA ladder 100bp (hình bên phải) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Đối với phản ứng PCR ADN khn từ Salmonella spp., nồng độ ADN mà xuất băng nhìn thấy mắt thường qua UV visualizer độ pha loãng 77 x 105 ng/µL (0,77 pg/µL, giếng số hình 2B) Ở nồng độ pha lỗng khơng quan sát xuất băng ADN Do đó, nồng độ pha loãng tối thiểu Salmonella spp phản ứng 25 µL thí nghiệm 0,77 pg/µL (hình 2B) Công bố Moganedi et at [14] với độ nhạy phản ứng PCR nhận biết vi khuẩn Salmonella spp 0,3 pg/µL, với nhóm Radhika pg/µL [15] hay Kumar et al pg/µL [16] Như vậy, trường hợp nhận biết Salmonella spp kết chúng tơi nằm mức trung bình so với cơng bố nhóm nghiên cứu So với hai nhóm sau chí kết tốt [15,16] Trong trường hợp sử dụng cặp mồi LL4R/LL5F dùng để nhận biết vi khuẩn Listeria monocytogenes, nồng độ ADN mà xuất băng quan sát gel agarose 1% 68 x 105 ng/µL (0,68 pg/µL, giếng số hình 2C) Ở nồng độ 68 x 106 ng/µL (giếng số hình 2C) khơng xuất băng quan sát mắt thường Như ngưỡng phát ADN khuôn tối thiểu cặp mồi LL4R/LL5F 0,68 pg/µL phản ứng 25 µL Với cơng bố nhóm Wang et al [12], nồng độ ADN sau PCR mà xuất băng sáng gel agarose 25 pg/phản ứng 20 µL Như thí nghiệm này, độ nhạy phản ứng PCR vượt trội so với cơng bố Hình Khảo sát nồng độ ADN tối thiểu phản ứng PCR nhận biết vi khuẩn Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus Salmonella spp ADN chủng vi khuẩn pha loãng theo loạt giảm dần 10 lần từ 101 đến 109 sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng Hình A Kết PCR sử dụng cặp mồi Stanucf Stanucr với mẫu ADN pha lỗng vi khuẩn Staphylococcus aureus Hình B Kết PCR sử dụng cặp mồi SdiA1 SdiA2 với mẫu ADN pha loãng vi khuẩn Salmonella spp Hình C Kết PCR sử dụng cặp mồi LL4R LL5F với mẫu ADN pha loãng vi khuẩn Listeria monocytogenes M: 1Kb DNA ladder Thứ tự mẫu từ đến 10 theo thứ tự sau: 1, ADN khơng pha lỗng, từ 210, nồng độ pha loãng từ 101 đến 109 3.3 Nhận biết vi khuẩn Listeria monocytogenes sữa sữa chua Listeria monocytogenes vi khuẩn gây tử vong cho người nhiễm phải, đặc biệt trẻ sơ sinh, phụ nữ mang thai, người già, người bị suy giảm miễn dịch Thế giới ghi nhận có trận dịch lớn Mỹ Pháp làm chết nhiều người ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn (8) Sữa chưa tiệt trùng hay sản phẩm làm từ sữa chưa tiệt trùng nguồn có khả nhiễm khuẩn gây bệnh Với kết tối ưu trên, chúng tơi Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) 27 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC sử dụng khuôn ADN ADN tổng số tách từ mẫu sữa sữa chua để chạy PCR với mồi đặc hiệu vi khuẩn Listeria monocytogenes Trong số 49 mẫu sữa sữa chua thu thập được, có 01 mẫu có xuất băng sáng có kích thước giống với kích thước đối chứng dương (ADN vi khuẩn Listeria mono cytogenes dùng làm khn) vị trí thứ 16 hình số Mẫu mẫu sữa tươi chưa trùng thu thập xã Dương Hà, Gia Lâm, Hà Nội Các mẫu sữa cịn lại khơng xuất băng sáng gel agarose (cịn số hình gel khác đây) Mẫu ADN gửi đọc trình tự kết khẳng định vi khuẩn Listeria monocytogenes (Bảng 2) Như vậy, khả bị ngộ độc thực phẩm uống sữa xảy sữa không tiệt trùng trùng trước dùng May mắn phần lớn sữa tươi sản xuất Gia Lâm thu mua công ty sữa lớn Việt Nam xử lý dây chuyền thiết bị có kiểm sốt chất lượng tốt Nguy có khả xảy sữa bán trực tiếp cho người dân cần phổ biến người nên đun nóng lại sữa trước sử dụng Hình Kết PCR mẫu sữa với mồi đặc hiệu cho Listeria monocy togenes Từ đến 24, mẫu sữa thu thập; 25, đối chứng dương (Listeria mono cytogenes) Chỉ mẫu 16 xuất băng tương tự đối chứng dương M: 1Kb DNA ladder Bảng Trình tự ADN mẫu số 16 (hình 3) BLAST NCBI Listeria monocytogenesVWUDLQ1 FKURPRVRPHFRPSOHWHJHQRPH Listeria monocytogenesVWUDLQ1 FKURPRVRPHFRPSOHWHJHQRPH 6HTXHQFH,' &3/HQJWK 1XPEHURI0DWFKHV 6HTXHQFH,' &3/HQJWK 1XPEHURI0DWFKHV 5DQJH WR *HQ%DQN*UDSKLFV1H[W0DWFK3UHYLRXV0DWFK 5DQJH WR *HQ%DQN*UDSKLFV1H[W0DWFK3UHYLRXV0DWFK Alignment statistics for match #1 Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 878 bits(475) 0.0 484/488(99%) 2/488(0%) Plus/Minus Query TGCATTC-CTCCAGGCGCTTGCA-CTGCTCTTTAGTAACAGCTTTGCCGAAAAATCTGGA 59 ||||||| ||||| ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2269523 Query 60 TGCATTCACTCCAAGCGCTTGCAACTGCTCTTTAGTAACAGCTTTGCCGAAAAATCTGGA 2269464 AGGTCTTGTATGTTCATTAACATTCACGTTATAGTAAATTTGTTTAAAACTAATGACTTC 119 |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2269463 AGGTCTTGTAGGTTCATTAACATTCACGTTATAGTAAATTTGTTTAAAACTAATGACTTC 2269404 Query 120 TTCTTGCATTTTCCCTTCACTGATTGCGCCGAAGTTTACATTCAAGCTATTATTTACAGC 179 Sbjct 2269403 TTCTTGCATTTTCCCTTCACTGATTGCGCCGAAGTTTACATTCAAGCTATTATTTACAGC 2269344 Query 180 TTTAAATGCTGTACCAAATTTCGCAATTAATTGTGATTCACTGTAAGCCATTTCGTCATC 239 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 28 2269343 TTTAAATGCTGTACCAAATTTCGCAATTAATTGTGATTCACTGTAAGCCATTTCGTCATC Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) 2269284 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Query 240 ATAATCAATTTTTGCACTTACATTTGGATAAGCTTGAGCATATTTTTCATTCCATCTTTC 299 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2269283 ATAATCAATTTTTGCACTTACATTTGGATAAGCTTGAGCATATTTTTCATTCCATCTTTC 2269224 Query 300 CACTAATGTATTTACTGCGTTGTTAACGTTTGATTTAGTGGCATTTTTTACAACGATTTT 359 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2269223 CACTAATGTATTTACTGCGTTGTTAACGTTTGATTTAGTGGCATTTTTTACAACGATTTT 2269164 Query 360 ATTGTCTTGATTAGTCATACCTGGCAAATCAATGCTGAGTGTTAATGAATCACGTTTTAC 419 Sbjct 2269163 ATTGTCTTGATTAGTCATACCTGGCAAATCAATGCTGAGTGTTAATGAATCACGTTTTAC 2269104 Query 420 AGGGAGAACATCTGGTTGATTTTCTACTAATTCCGAATTCGCTTTTACGAGAGCACCTGG 479 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 2269103 AGGGAGAACATCTGGTTGATTTTCTACTAATTCCGAATTCGCTTTTACGAGAGCACCTGG Query 480 ATAGGTTA 2269044 487 |||||||| Sbjct 2269043 ATAGGTTA 2269036 3.4 Nhận biết vi khuẩn Staphylococcus aureus sữa sữa chua Staphylococcus aureus hay tụ cầu vàng gây nhiễm khuẩn tụ cầu Nhiễm khuẩn tụ cầu gây nguy hiểm đến tính mạng vi khuẩn tụ cầu lưu thông máu Khi ăn phải thức ăn nhiễm khuẩn này, người bệnh bị nôn mửa dội bị sốt Khả gây bệnh vi khuẩn sinh độc tố enterotoxin, protein bền nhiệt Sữa sản phẩm từ sữa chứa nguy gây bệnh động vật cho sữa nhiễm bệnh q trình chế biến sữa khơng an tồn Trong nghiên cứu này, Staphylococcus aureus đối tượng để kiểm tra khả nhiễm mẫu sữa sữa chua thu thập Hình Kết PCR với mồi đặc hiệu cho Staphylococcus aureus Từ đến 21, mẫu sữa thu thập; V cholerae O1; E.coli; Shigella; Listeria monocytogenes; Salmonella spp.; Staphylococcus aureus; M: 1Kb DNA ladder Thermo Scientific Trong mẫu sữa sữa chua thu thập, phát 01 mẫu có khả nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus (giếng 20 hình 4) Mẫu mẫu sữa dê trùng trang trại nhỏ vùng Ba Vì, Hà Nội Mẫu ADN khẳng định ADN vi khuẩn Staphylococcus aureus cách đọc trình tự (Bảng 3) Việc nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus q trình chế biến đóng chai sữa khơng hồn tồn đảm bảo vô trùng Như vậy, nguy bị ngộ độc thực phẩm tiêu thụ sữa hồn tồn xảy Trong năm gần đây, tình hình ngộ độc uống sữa xảy nhiều Trong nguyên nhân ngộ độc tìm có sữa nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus như: vụ ngộ độc sữa hai Trường Tiểu học Hậu Giang vào năm 2017 (10) Ngoài ra, riêng đến Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) 29 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC hết tháng 10/2018, tụ cầu vàng coi “thủ phạm số 1” gây nên vụ ngộ độc tập thể nước (11) Tóm lại, sữa trùng có khả nhiễm lại loại vi khuẩn gây bệnh q trình sau trùng khơng đảm bảo; cần phải có biện pháp kiểm sốt nhằm đảm bảo an toàn cho người sử dụng sữa sản phẩm sữa từ hộ chế biến kinh doanh nhỏ lẻ Bảng Trình tự ADN mẫu số 20 (hình 4) BLAST NCBI Staphylococcus aureus strain GD1696 chromosome, complete genome Sequence ID: CP040233.2 Length: 2801264Number of Matches: Range 1: 514573 to 515018 GenBankGraphics Next MatchPrevious Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities 797 bits(431) 0.0 442/447(99%) 2/447(0%) Plus/Minus Query Gaps Strand GCCCCGATCCATATTTATCAGTTCTTTGACCTTTGTCAA-CTCGACTTCAATTTTCTTTG 59 ||| || |||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||| Sbjct 515018 GCCACG-TCCATATTTATCAGTTCTTTGACCTTTGTCAAACTCGACTTCAATTTTCTTTG 514960 Query 60 CATTTTCTACCAtttttttCGTAAATGCACTTGCTTCAGGACCATATTTCTCTACACCTT 119 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 514959 CATTTTCTACCATTTTTTTCGTAAATGCACTTGCTTCAGGACCATATTTCTCTACACCTT 514900 Query 120 TTTTAGGATGCTTTGTTTCAGGTGTATCAACCAATAATAGTCTGAATGTCATTGGTTGAC 179 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 514899 TTTTAGGATGCTTTGTTTCAGGTGTATCAACCAATAATAGTCTGAATGTCATTGGTTGAC 514840 Query 180 CTTTGTACATTAATTTAACAGTATCACCATCAATCGCTTTAATTAATGTCGCAGGTTCTT 239 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 514839 CTTTGTACATTAATTTAACAGTATCACCATCAATCGCTTTAATTAATGTCGCAGGTTCTT 514780 Query 240 TATGTAATTTTTTAGTTGAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCTTCTGAACCACTTCTAT 299 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 514779 TATGTAATTTTTTAGTTGAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCTTCTGAACCACTTCTAT 514720 Query 300 TTACGCCATTATCTGTTTGTGATGCATTTGCTGAGCTACTTAGACTTGAAGCTACAACTA 359 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 514719 TTACGCCATTATCTGTTTGTGATGCATTTGCTGAGCTACTTAGACTTGAAGCTACAACTA 514660 Query 360 AAGTTAACACTAAGCAACTAGTAGCGAAAAAGAAAAAGCTCTTTGCGTATTGTTCTTTCG 419 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| Sbjct 514659 AAGTTAACACTAAGCAACTAGTAGCGAAAAAGAAAAACCTCTTTGCGTATTGTTCTTTCG Query 420 AAACATTACTGATAGCCATCCCGATAA Sbjct 514599 AAACATTACTGATAGCCATCCCTATAA 514600 446 |||||||||||||||||||||| |||| 514573 3.5 Nhận biết vi khuẩn Salmonella spp sữa sữa chua Ngoài bệnh thương hàn phó thương hàn gây nhiễm trùng máu, Salmonella spp loại vi khuẩn thường gây ngộ độc thực phẩm Các triệu chứng Salmonella spp gây thường tiêu chảy, nôn mửa kéo dài từ đến ngày Sữa chưa tiệt trùng nguồn nhiễm khuẩn Tất mẫu sữa sữa chua nghiên cứu kiểm tra 30 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TOÀN THỰC PHẨM (Số 4-2019) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC PCR để phát khả nhiễm khuẩn Salmonella spp May mắn tất mẫu sữa sữa chua thu thập, không phát trường hợp dương tính với vi khuẩn Salmonella spp ngoại trừ đối chứng dương DNA khn từ vi khuẩn Salmonella spp (dữ liệu khơng thể bài) Thí nghiệm lặp lại 03 lần kết đồng Như vậy, mẫu sữa sữa chua thí nghiệm không chứa vi khuẩn Salmonella spp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong nghiên cứu này, thiết lập phương pháp phát nhanh vi khuẩn Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes Salmonella spp kỹ thuật PCR Kết cho thấy cặp mồi thiết kế riêng cho vi khuẩn có độ đặc hiệu cao với vi khuẩn Nồng độ DNA tối thiểu phản ứng phát vi khuẩn Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes Salmonella spp 3,9 pg/µl, 0,68 pg/µl 0,77 pg/µl Kết tương đồng với nhiều nghiên cứu công bố áp dụng để khảo sát có mặt vi khuẩn mẫu sữa sữa chua thu thập Trong 49 mẫu thu thập vùng gần Hà Nội đầu năm 2019, có 23 mẫu sữa chưa trùng, 12 mẫu sữa trùng 14 mẫu sữa chua Kết cho thấy có 01 mẫu sữa dê trùng lấy Ba Vì, Hà Nội có khả nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus 01 mẫu sữa tươi chưa trùng lấy Gia Lâm, Hà Nội có khả nhiễm khuẩn Listeria mono cytogenes Tất mẫu sữa sữa chua âm tính với Salmonella spp Các mẫu nhiễm khuẩn khẳng định cách đọc kết giải trình tự gene Từ kết ta thấy trình xử lý sau trùng sữa quan trọng để tránh nhiễm ngược lại vào sữa nhận thấy khơng nên sử dụng sữa chưa trùng hay chưa tiệt trùng để đảm bảo sức khỏe người tiêu dùng Như vậy, nhà quản lý cần đưa biện pháp phải lưu ý để lấy mẫu kiểm tra giám sát thường xuyên mẫu sữa sản phẩm sữa để phịng, tránh việc xảy vụ ngộ độc tập thể từ sữa sản phẩm sữa khơng an tồn TÀI LIỆU THAM KHẢO Năm 2018 Những nỗ lực ngành Sữa Việt Nam (15/1/2019) Hiệp hội Sữa Việt Nam Otto Garcia et al (2006), “The Economics of Milk Production in Hanoi, Vietnam with Particular Emphasis on Smallscale Producers”, FAO, PPLPI Working Paper No.33 Nguyen Anh Phong, (2015), “Small holder involvement in Vinamilk supply chain, Vietnam”, FAO Mahendra Pal et al (2016), “Bacterial Contamination of Dairy Products”, Beverage & Food World, (43), 40 43 Edward M Fox et al (2017), “Editorial: Microbial Food Safety along the Dairy Chain”, Frontiers in Microbiology, (8), 1612 JinQiang Chen et al (2017), “PCRbased methodologies for detection and characterization of Listeria monocytogenes and Listeria ivanovii in foods and environmental sources”, Food Science and Human Wellness, (6), 39 59 Konstantia Halatsi et Al, “PCR detection of Salmonella spp using primers targeting the quorum sensing gene sdiA”, FEMS Microbiol Lett 259 (2006), 201 207 Joseph Odumeru (2002), “Current Microbial Concerns in the Dairy Industry”, Food Safety magazine Odd G Brakstad et al (1992), “Detection of Staphylococcus aureus by Polymerase Chain Reaction Amplification of the nuc Gene”, Journal of Clinical Microbiology, (30), 1654 1660 10 Thúy An (2017) Hậu Giang: Trẻ ngộ độc uống sữa có vi khuẩn Staphylococcus aureus Quân đội Nhân dân online 06/11/2017 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) 31 NGHIÊN CỨU KHOA HỌC 11 Minh Nhật (2018) Cảnh báo “thủ phạm” gây vụ ngộ độc tập thể daibieunhan dan.vn online 16/12/2018 12 Yi Wang et al (2014), “Rapid and sensitive detection of Listeria monocytogenes by crosspriming amplification of lmo0733 gene”, FEMS Microbiol Lett, 361, 43 51 13 Eliezer Avila Gandra et al (2016), “Detection by multiplex PCR of Staphylococcus aureus, S intermedius and S hyicus in artifcially contaminated milk”, Ciência Rural, Santa Maria, v.46, n.8, 14181423 14 KLM Moganedi et al (2007), “Optimisation of the PCRinvA primers for the detection of Salmonella in drinking and surface waters following a precultivation step”, Water SA, Vol 33 No 15 M Radhika et al., “A novel multiplex PCR for the simultaneous detection of Salmonella enterica and Shigella species”, Journal of Microbiology Online, ISSN 1678 4405 16 Kumar S., Balakrishna K & Batra H (2006), “Detection of Salmonella enterica serovar Typhi (S Typhi) by selective amplification of invA, viaB, fliC- d and prt genes by poly merase chain reaction in mutiplex format”, Letters in Applied Microbiology, (42), 149 154 LỜI CẢM ƠN Đề tài tài trợ từ quỹ học bổng cho cựu nghiên cứu viên tổ chức JICA KIRIN, Nhật Bản Cơng ty Kirin, Nhật Bản Nhóm tác giả xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến Tiến sĩ, Bác sĩ Vũ Thu Hằng, Đại học Y Thái Nguyên tặng chủng chuẩn Staphylococcus aureus E coli shigella; Bác sĩ Nguyễn Thái Sơn, Bệnh viện Quân Y 103 để lại cho chủng chuẩn Listeria monocytogenes; Thạc sĩ Lê Đình Duẩn, Cơng ty CP Cơng nghệ vi sinh môi trường tặng chủng chuẩn Salmonella spp Vibrio cholera O1 cho nghiên cứu; Tiến sĩ Nguyễn Phương Nhuệ, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp việc thu thập mẫu sữa tươi hộ cá thể hai xã Dương Hà Phù Đổng, Gia Lâm, Hà Nội Summary ASSESSMENT OF LISTERIA MONOCYTOGENES, STAPHYLOCOCCUS AUREUS AND SALMONELLA SPP CONTAMINATION IN DAIRY SAMPLES COLLECTED IN GIA LAM AND BA VI, HANOI EARLY 2019 Nguyen Thi Minh Huyen1, Tran Thi Hoa1, Ninh Thi Tuyet Lan1, Tran Thi Hien2 Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology Falcuty of Biology, VNU University of Science, National University, Hanoi Vietnam Milk and dairy products from dairy farms around Hanoi greatly contribute to the consumed milk quantity in Hanoi The use of fresh milk or pasteurized milk becomes more and more popular in the daily life of local people Milk and dairy products were widely sold in numerous stores, particularly in Xuan Mai, Ba Vi, Phu Dong and Gia Lam However, there have not yet been any studies to assess the pathogenic bacterial contamination of these products In our study, 49 samples including 23 raw milk samples, 12 pasteurized milk samples, and 14 yogurt samples were collected in order to examine the presence of foodborn pathogenic bacteria such as Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella spp using PCR method This fast and accurate method works based on the specific amplification of tested bacterial DNA The results showed that one of the samples may contain Staphylococcus aureus while another may be contaminated with Listeria monocytogenes None of the samples was contaminated with Salmonella spp The results were confirmed by gene sequencing Keywords: Bacteria, foodpoisoning, milk, bacterial contamination, Hanoi 32 Tạp chí KIỂM NGHIỆM VÀ AN TỒN THỰC PHẨM (Số 4-2019) ... Hà Nội đầu năm 2019, có 23 mẫu sữa chưa trùng, 12 mẫu sữa trùng 14 mẫu sữa chua Kết cho thấy có 01 mẫu sữa dê trùng lấy Ba Vì, Hà Nội có khả nhiễm vi khuẩn Staphylococcus aureus 01 mẫu sữa tươi... tơi phát 01 mẫu có khả nhiễm khuẩn Staphylococcus aureus (giếng 20 hình 4) Mẫu mẫu sữa dê trùng trang trại nhỏ vùng Ba Vì, Hà Nội Mẫu ADN khẳng định ADN vi khuẩn Staphylococcus aureus cách đọc trình... chủ yếu hai vùng Gia Lâm Ba Vì, Hà Nội Mẫu Ba Vì thu mua ngẫu nhiên đại lý dọc trục đường Xuân Mai, Ba Vì Mẫu sữa chưa trùng Gia Lâm thu mua hộ chăn ni bị hai xã Phù Đổng Dương Hà họ mang đến bán