Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên nhằm xây dựng quy trình nhân giống cây hồ tiêu sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Kết quả nghiên cứu cho thấy: Sau 60 ngày vào mẫu, tỷ lệ tạo mẫu sạch từ đỉnh sinh trưởng đạt cao nhất (68,40%) khi có sự kết hợp giữa chất khử trùng HgCl2 (0,2%) với Nano bạc (0,3%). Mời các bạn tham khảo!
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY HỒ TIÊU SẠCH BỆNH BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Nguyễn Thị Mai1, Nguyễn Thị Thúy Ngọc1, Trần Thị Hoàng Anh1, Trương Văn Tân1, Chu Thị Phương Loan1, Nguyễn Thị Thu Thủy1 TÓM TẮT Nghiên cứu thực Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên nhằm xây dựng quy trình nhân giống hồ tiêu bệnh kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Kết nghiên cứu cho thấy: Sau 60 ngày vào mẫu, tỷ lệ tạo mẫu từ đỉnh sinh trưởng đạt cao (68,40%) có kết hợp chất khử trùng HgCl2 (0,2%) với Nano bạc (0,3%) Các chất điều hòa sinh trưởng BA, IBA, IAA nước dừa non với nồng độ khác bổ sung vào môi trường nuôi cấy MS kích thích khả bật chồi, nhân chồi rễ hồ tiêu in vitro Tỷ lệ mẫu bật chồi cao (86,67%) môi trường MS bổ sung BA (2 mg/l) kết hợp với IBA (0,2 mg/l) Sau tháng nuôi cấy môi trường MS bổ sung BA (0,5 mg/l) kết hợp với nước dừa non (150 ml/l) làm gia tăng số lượng chồi/mẫu (6 - chồi/mẫu) Việc kết hợp IAA (0,4 mg/l) với than hoạt tính (1 g/l) giúp hồ tiêu in vitro hình thành rễ tốt sau 60 ngày ni cấy Từ khóa: Cây hồ tiêu, ni cấy mơ tế bào, quy trình nhân giống I ĐẶT VẤN ĐỀ Công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào bốn thập niên qua đạt nhiều thành tựu bật lĩnh vực như: nuôi cấy tế bào mơi trường lỏng, sản xuất hóa thực phẩm ống nghiệm, đặc biệt lĩnh vực tái sinh từ ni cấy tế bào góp phần to lớn việc cải thiện chất lượng số lượng giống loại trồng nói chung, có hồ tiêu Hiện nay, hồ tiêu nhân giống chủ yếu phương pháp giâm hom từ cành thân cành lươn Tuy nhiên, thực tế sản xuất cho thấy, việc nhân giống hồ tiêu phương pháp truyền thống bộc lộ nhiều hạn chế, có dịch bệnh bùng phát khả khống chế nguồn bệnh từ mẹ khó, ảnh hưởng đến chất lượng giống Do đó, để góp phần sản xuất hồ tiêu bền vững, năm 2018 - 2020, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên tiến hành nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào nhân giống hồ tiêu nhằm xây dựng quy trình nhân giống hồ tiêu bệnh đáp ứng yêu cầu sản xuất II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu - Giống hồ tiêu Vĩnh Linh Trung tâm Nghiên cứu Phát triển hồ tiêu thuộc Viện khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên cung cấp - Môi trường MS, chất điều hòa sinh trưởng (BA, IBA, IAA), nước dừa non, than hoạt tính 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Ảnh hưởng Clorua thủy ngân Nano bạc đến khả tạo mẫu Chồi giống tiêu Vĩnh Linh khử trùng dung dịch thủy ngân clorua (HgCl2) nanao bạc với nồng độ khác Thời gian khử trùng: 10 phút HgCl2 30 phút Nano bạc Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (CRD), yếu tố, yếu tố clorua thủy ngân (0,1%; 0,2%) yếu tố nano bạc (0%; 0,1%; 0,3%; 0,5%); gồm nghiệm thức, nghiệm thức lần lặp lại, lần lặp 15 bình, bình cấy mẫu Mẫu chồi sau khử trùng rửa lại nước cất vô trùng, dùng dao mổ tách lấy đỉnh sinh trưởng cấy lên môi trường MS (MuraShige and Skoog, 1962), agar 10 g/l, đường sacharose 30 g/l Thời gian theo dõi: 60 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm (nhiễm nấm nhiễm khuẩn) (%); Tỷ lệ mẫu (%); Tỷ lệ mẫu sống (%) 2.2.2 Ảnh hưởng BA IBA đến khả bật chồi phát sinh hình thái chồi đỉnh sinh trưởng Các đỉnh sinh trưởng sống (không bị nhiễm nấm khuẩn, mẫu xanh) cấy lên môi trường MS, bổ sung BA IBA với nồng độ khác Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (CRD), yếu tố, yếu tố BA (1 mg/l; mg/l) yếu tố IBA (0 mg/l; 0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l); gồm nghiệm thức, nghiệm thức 15 bình, lần lặp lại, bình cấy mẫu Thời gian theo dõi: 90 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian đỉnh sinh rưởng bật chồi (ngày); Tỷ lệ mẫu bật chồi (%); Chiều dài chồi (cm) Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Ngun Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 2.2.3 Ảnh hưởng BA nước dừa non đến khả nhân chồi hồ tiêu điều kiện in vitro Đốt thân đốt hồ tiêu in vitro cấy lên môi trường MS bổ sung BA nước dừa non với nồng độ khác Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (CRD), yếu tố, yếu tố BA (0,5 mg/l; 1,0 mg/l) yếu tố nước dừa non (0 ml/l; 100 ml/l; 150 ml/l; 200 ml/l); gồm nghiệm thức, nghiệm thức bình, lần lặp lại, bình cấy mẫu Thời gian theo dõi: 90 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Số chồi/mẫu (chồi); chiều dài chồi (cm); Số đốt/ chồi (đốt) 2.2.4 Ảnh hưởng IAA than hoạt tính đến khả rễ hồ tiêu điều kiện in vitro Chồi có - đốt tương đương với - hồ tiêu in vitro cấy lên môi trường MS bổ sung IAA với nồng độ khác kết hợp không kết hợp với than hoạt tính.Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên (CRD), yếu tố, yếu tố IAA có nồng độ (0,2 mg/l; 0,4 mg/l; 0,6 mg/l) yếu tố than hoạt tính có nồng độ (0 g/l; g/l); gồm nghiệm thức, nghiệm thức bình, lần lặp lại, bình cấy mẫu Thời gian theo dõi: 60 ngày Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi rễ (%); Số rễ/chồi (rễ); Chiều dài rễ (cm) 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực từ tháng năm 2018 đến tháng 12 năm 2019 Viện Khoa học Kỹ thuật Nông Lâm nghiệp Tây Nguyên III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hưởng Clorua thủy ngân Nano bạc đến khả tạo mẫu Đối với hồ tiêu, việc khử trùng mẫu để tạo nguồn vật liệu ban đầu cho q trình ni cấy in vitro gặp nhiều khó khăn Theo Choi cộng tác viên (2009), Nano bạc thuộc nhóm vật liệu với đặc tính vật lý sinh học đáng ý hoạt tính kháng vi sinh vật Dung dich nano bạc có hiệu kháng khuẩn, kháng nấm kháng virus (Nomiya et al., 2004) Mặt khác, Nano bạc không gây độc khơng gây kích ứng người Do đó, thí nghiệm này, chúng tơi sử dụng Nano bạc để khử trùng mẫu chồi giống hồ tiêu Vĩnh Linh 10 Bảng Ảnh hưởng chất khử trùng đến khả tạo mẫu Nghiệm thức Chất khử trùng Thủy Nano ngân bạc Clorua 0,1 0,0 0,1 0,1 0,1 0,3 0,1 0,5 0,2 0,0 0,2 0,1 0,2 0,3 0,2 0,5 ANOVA Yếu tố Thủy ngân Clorua Yếu tố Nano bạc Yếu tố Thủy ngân Clorua ˟ Yếu tố Nano bạc CV (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu (%) Tỷ lệ mẫu sống (%) 92,59 a 70,37 c 52,10 d 43,95 e 81,23 b 45,43 e 23,45 f 12,35 g 7,41 g 29,63 e 47,90 d 56,05 c 18,77 f 54,57 c 76,55 b 87,65 a 6,17 g 25,18 e 40,25 d 45,18 c 14,07 f 50,12 b 68,40 a 42,96 cd ** ** ** ** ** ** ** ** ** 1,72 1,92 3,19 Ghi chú: ** : Khác biệt có ý nghĩa mức p < 0,01 khơng có khác biệt Các chữ số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD Kết bảng cho thấy, có ảnh hưởng tương tác thủy ngân clorua (HgCl2) nano bạc đến tỷ lệ mẫu tỷ lệ mẫu sống Trong đó, nghiệm thức cho tỷ lệ mẫu sống đạt cao (68,40%), khác biệt có ý nghĩa thống kê so với cơng thức cịn lại Nghiệm thức có tỷ lệ mẫu đạt cao, nhiên xử lý mẫu với chất khử trùng có nồng độ cao mẫu bị chết nhiều, làm giảm tỷ lệ mẫu sống xuống cịn 42,96% Có khác biệt thống kê rõ việc sử dụng HgCl2 đơn lẻ với việc kết hợp HgCl2 nano bạc khử trùng mẫu hồ tiêu Điều cho thấy, có tác động tích cực việc kết hợp HgCl2 nano bạc lên khả tạo mẫu chồi hồ tiêu 3.2 Ảnh hưởng BA IBA đến khả bật chồi phát sinh hình thái chồi đỉnh sinh trưởng Cytokinin kết hợp với auxin giúp tăng trưởng chồi non khởi phát tạo mô phân sinh chồi từ nhu mô (Gaspar et al., 2003) Kết khảo sát bảng cho thấy, thời gian mẫu bật chồi dao động từ 45 - 60 ngày tất nghiệm thức thí nghiệm Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình Đỉnh sinh trưởng bật chồi môi trường nuôi cấy khác Ghi chú: (a): MS + BA (1 mg/l); (b): MS + BA (1 mg/l) + IBA (0,2 mg/l); (c): MS +BA (1 mg/l) + IBA (0.4 – 0,6 mg/l); (d): MS + BA (2 mg/l); (e): MS + BA (2 mg/l) + IBA (0,2 mg/l); (f): MS + BA (2 mg/l) + IBA (0,4 - 0,6 mg/l) Bảng Khả phát sinh hình thái chồi đỉnh sinh trưởng môi trường bổ sung BA IBA Nghiệm thức Nồng độ chất ĐHST (mg/l) Thời gian mẫu bật chồi (ngày) BA IBA 1,00 0,00 45 - 60 1,00 0,20 45 - 60 1,00 0,40 45 - 60 1,00 0,60 45 - 60 2,00 0,00 45 - 60 2,00 0,20 45 - 60 Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) Chiều dài chồi (cm) Đặc điểm chồi 52,35 e 68,15 bc 65,19 c 58,77 d 66,91 bc 86,67 a 5,24 bc 5,94 ab 4,66 cd 3,55 de 6,41 ab 7,16 a +++ +++ ++ ++ +++ +++ 2,00 0,40 45 - 60 72,34 b 3,89 d ++ 2,00 0,60 45 - 60 55,56 de 2,63 e + ** ** ** 3,3 ** ** ** 9,7 ANOVA Yếu tố BA Yếu tố IBA Yếu tố BA ˟ Yếu tố IBA CV (%) Ghi chú: ** : Khác biệt có ý nghĩa thống kê mức p < 0,01 khơng có khác biệt Các chữ số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD (+) : Chồi ngắn, phát triển kém, phát sinh nhiều mô sẹo gốc; (++): Chồi phát triển trung bình, phát sinh mơ sẹo gốc; (+++): Chồi phát triển tốt Kết bảng cho thấy: Có ảnh hưởng tương tác BA IBA đến khả bật chồi phát sinh hình thái chồi nuôi cấy in vitro hồ tiêu Sau 12 tuần nuôi cấy, môi trường bổ sung BA, nồng độ mg/l IBA nồng độ 0,2 mg/l (CT6), tỷ lệ mẫu bật chồi (86,67%) chiều dài chồi (7,16 cm) đạt cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với công thức khác Môi trường nuôi cấy bổ sung mg/l BA, tỷ lệ mẫu bật chồi 52,35%, tăng nồng độ BA lên mg/l tỷ lệ mẫu bật chồi tăng 11 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 3(112)/2020 lên 66,91%; Kết khác với kết nghiên cứu Thái Xuân Du cộng tác viên (2013), bổ sung mg/l BA vào môi trường nuôi cấy, tỷ lệ mẫu bật chồi đạt 67,50%, nhiên tăng nồng độ BA lên mg/l tỷ lệ mẫu bật chồi giảm cịn 25,85% Như vậy, tùy vào điều kiện ni cấy nguồn mẫu nuôi cấy mà cho kết khác Trên môi trường bổ sung 0,4 - 0,6 mg/l IBA, chồi có xu hướng tạo nhiều mơ sẹo gốc, ảnh hưởng đến khả phát triển chồi 3.3 Ảnh hưởng BA nước dừa non đến khả nhân chồi hồ tiêu điều kiện in vitro Các chồi in vitro tái sinh từ đỉnh sinh trưởng cắt thành đốt cấy lên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA nước dừa non với nồng độ khác Kết bảng cho thấy, có ảnh hưởng tương tác BA nước dừa non đến khả nhân chồi hồ tiêu in vitro, môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA 150 ml nước dừa non (CT 3) có số chồi hình thành/mẫu đạt cao (trung bình 7,73 chồi), tiếp đến CT (6,49 chồi/mẫu), nhiên, chiều dài chồi số đốt/chồi CT thấp so với CT 6, khác biệt có ý ngĩa thống kê so với cơng thức lại Bảng Ảnh hưởng BA nước dừa non đến khả nhân chồi hồ tiêu in vitro Công BA thức (mg/l) Số đốt/ chồi Đặc điểm chồi 3,24 f 5,40 c 7,73 a 4,70 d 5,23 c 6,49 b 5,29 c 3,78 e Chiều dài chồi (cm) 3,55 f 5,39 c 6,09 c 4,44 e 4,63 d 7,27 a 5,49 c 2,72g 2,85 f 4,04 c 5,55 b 3,85 d 3,53 e 6,58 a 4,05 c 2,31 g ++ ++ +++ ++ ++ +++ ++ + ** ** ** ** ** ** ** ** ** 1,36 1,59 1,28 Nước Số dừa chồi/ (ml/l) mẫu 0,5 0,0 0,5 100 0,5 150 0,5 200 1,0 0,0 1,0 100 1,0 150 1,0 200 ANOVA Yếu tố BA Yếu tố nước dừa Yếu tố BA ˟ Yếu tố nước dừa CV (%) Ghi chú: **: Khác biệt có ý nghĩa thống kê mức p