Đang tải... (xem toàn văn)
Quy trình xác định hoạt tính sinh học của interferon alpha gà (ChIFN-α) được xây dựng dựa trên quy trình xác định hiệu giá của interferon alpha 2. Các thông số chính sử dụng trong quy trình bao gồm: mật độ tế bào UMNSAH/ DF1 (dòng nguyên bào sợi phôi gà) là 4 ˟ 105 tế bào/ml (4 ˟ 104 tế bào/giếng/100 µl); virus sử dụng để đánh giá là NDV (Newcastle disease virus) liều 100 TCID50/0,1 ml. Kết quả thử nghiệm cho thấy, quy trình xác định hoạt tính sinh học của ChIFN-α có tính ổn định cao khi áp dụng hai loại virus khác nhau (NDV và VSV - Vesicular stomatitis virus). Kết quả đạt được có sai số nằm trong khoảng cho phép của Bộ Y tế (hiệu giá sai số cho phép nằm trong khoảng 70 - 150%).
Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 2(111)/2020 XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA INTERFERON ALPHA GÀ (ChIFN-α) Nguyễn hị hanh Giang1, Nguyễn Đăng Quân1, Hồ Quảng Đồ2 TÓM TẮT Quy trình xác định hoạt tính sinh học interferon alpha gà (ChIFN-α) xây dựng dựa quy trình xác định hiệu giá interferon alpha Các thông số sử dụng quy trình bao gồm: mật độ tế bào UMNSAH/ DF1 (dịng ngun bào sợi phơi gà) 105 tế bào/ml (4 104 tế bào/giếng/100 µl); virus sử dụng để đánh giá NDV (Newcastle disease virus) liều 100 TCID50/0,1 ml Kết thử nghiệm cho thấy, quy trình xác định hoạt tính sinh học ChIFN-α ć tính ổn định cao áp dụng hai loại virus khác (NDV VSV - Vesicular stomatitis virus) Kết đạt ć sai số nằm khoảng cho phép Bộ Y tế (hiệu giá sai số cho phép nằm khoảng 70 - 150%) Từ khóa: Interferon alpha gà, hoạt tính sinh học, bệnh tích tế bào, liều gây nhiễm 50% tế bào thử nghiệm I ĐẶT VẤN ĐỀ Interferon alpha gà (ChIFN-α) đ̃ ch́ng minh ć khả ́c chế virus gây bệnh Newcastle (Hou et al., 2011), Gumboro (Mo et al., 2001), cúm H1N1, H5N9 (Jiang et al., 2011), bạch cầu sarcoma gia cầm (Dai et al., 2016), virus gây bệnh mụn giộp (VSV, Vesicular stomatitis virus) (Hou et al., 2011) Hơn ña, interferon (IFN) cịn kích thích miễn dịch đặc hiệu đ́ thường sử dụng tác nhân hỗ trợ, nhằm tăng cường hiệu phòng ngừa điều trị bệnh virus người, gia cầm kèm với vaccine liều thấp nhằm tăng cường hiệu vaccine (González-Navajas et al., 2012) Trước nhu cầu thực tế, việc phòng ngừa điều trị bệnh virus gây gia cầm Việt Nam, Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh đ̃ tạo chế phẩm interferon alpha gà (ChIFN-α) tái tổ hợp biểu từ nấm men Pichia pastoris Tuy nhiên, để ć thể thương mại, yêu cầu thiết yếu quy trình sản xuất chế phẩm cần phải xác định hoạt tính chế phẩm Tuy nhiên, q trình xác định hoạt tính ChIFN-α cịn gặp nhiều kh́ khăn nước chưa ć đơn vị kiểm định mẫu ChIFN-α, mà số đơn vị nhận mẫu kiểm định interferon người (hIFN) Do vậy, nghiên ću tiến hành nhằm ć quy trình thường quy xác định hoạt tính sinh học (IU/mg) ChIFN-α áp dụng phịng thí nghiệm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên ću Nguồn mẫu: Dòng tế bào UMNSAH/DF1 (ATCC), virus Newcastle độc lực cao (bộ môn hú y, Khoa Nông nghiệp, Đại học Cần hơ), virus VSV (Viện Vaccine Sinh phẩm y tế Nha Trang) H́a chất: dịch ChIFN-α (Trung tâm Công nghệ Sinh học hành phố Hồ Chí Minh); ChIFN-α chuẩn (Biorad); trypsin (Sigma); MTT (Sigma); DMEM (Sigma); FBS (Sigma); PBS (Gibco); Trypan blue (Sigma) 2.2 Phương pháp nghiên ću 2.2.1 Xác định mật độ tế bào thích hợp đưa lên giếng Tế bào đơn UMNSAH/DF1 xác định mật độ thích hợp, đưa lên đĩa ni cấy tế bào 96 giếng chuẩn bị cho thử nghiệm Môi trường nuôi tế bào DMEM 2% FBS, nhằm giúp tế bào trì sống khơng tăng sinh thời gian dài nuôi cấy Tế bào UMNSAH/DF1 đưa lên đĩa 96 giếng, với thể giếng 0,1 ml/giếng, mật độ tế bào khảo sát: 105 tế bào/ml, 105 tế bào/ml, 105 tế bào/ml 105 tế bào/ml (mỗi nồng độ tế bào thực 32 giếng) Quan sát hình thái tế bào giếng sau 24 nuôi cấy 2.2.2 Chuẩn độ virus xác định liều gây nhiễm 50% tế bào ni cấy (TCID50/ml, Tissue Culture Infectious Dose 50%/ml) Quy trình chuẩn độ virus tiến hành theo phương pháp Hussain Rasool (2005) số TCID50/0,1 ml tính tốn theo cơng th́c Reed Muench (1938) dựa biểu bệnh tích tế bào (CPE, cytopathic efect) Tế bào UMNSAH/DF1 đĩa 96 giếng với mật độ tế bào ban đầu 104 tế bào/giếng nuôi cấy 24 37oC, 5% CO2 Lớp đơn tế bào UMNSAH/DF1 cho tiếp xúc (lây nhiễm) với 100 μl dịch huyền phù ć ch́a virus nồng độ pha lõng bậc 10 Trung tâm Cơng nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh; Khoa Nơng Nghiệp, Đại học Cần hơ 103 Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(111)/2020 khác Sau lây nhiễm 37oC, môi trường ć ch́a virus rửa bỏ thay môi trường Tế bào tiếp tục nuôi cấy 37oC, 5% CO2 bệnh tích tế bào khơng thay đổi Quan sát CPE kính hiển vi tính liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50) Với độ pha lõng cho tỉ lệ 50% 50% giếng ć CPE, số TCID50/0,1 ml xác định sau: TCID50 = 1/độ pha lõng cho CPE 50% Độ pha lõng cho CPE 50% =10 [log (độ pha lõng cho CPE > 50%) - PD] PD = [(%CPE > 50%) - 50%] / [(%CPE > 50%) (%CPE < 50%)] 2.2.3 Quy trình thực Quy trình thực dựa theo ć cải tiến từ quy trình xác định hiệu giá interferon alpha công bố Dược điển Việt Nam V, áp dụng từ đầu năm 2018 (Bộ Y tế, 2017) phương pháp xác định hoạt tính sinh học interferon tác giả Meager (2002) Quy trình xác định hoạt tính mẫu ChIFN-α thực đồng thời với virus NDV VSV nghiệm thực đĩa 96 giếng * Ngày th́ nhất: - Chuẩn bị dịch ChIFN-α chuẩn hàm lượng (100 IU/ml 1000 IU/ml) - Chuẩn bị dịch ChIFN-α tái tổ hợp cần xác định đơn vị hoạt tính (IU/mg) nồng độ pha lõng 103, 104, 105 - Nhỏ 100 µl mơi trường DMEM, 2% FBS vào tất giếng - Nhỏ 100 µl dịch ChIFN-α chuẩn đ̃ pha lõng vào giếng B1 (nồng độ 1000 IU/ml) C1 (nồng độ 100 IU/ml) - Nhỏ 100 µl dịch ChIFN-α thử nghiệm đ̃ pha lõng nồng độ vào giếng D1 & E1 (mẫu pha lõng 103 lần); giếng F1 & G1(mẫu pha lõng 104 lần); H1 (mẫu pha lõng 105 lần) - Sau trộn mẫu pha lõng bậc hai liên tiếp: chuyển 100 µl từ giếng cột sang giếng cột 2, tiếp tục pha lõng cột th́ 12, hút bỏ 100 µl cột 12 - Cho 100 µl hỗn dịch tế bào UMNSAH/DF1 ch́a mật độ tế bào đ̃ xác định trước đ́ (mật độ tế bào xác định thực theo phương pháp 2.2.1) vào tất giếng - Sau bước trên, đĩa 96 giếng ć ch́a tế bào UMNSAH/DF1 nuôi cấy 24 37oC, 5% CO2 104 * Ngày th́ hai: - Kiểm tra phát triển tế bào giếng đối ch́ng (A1- A6), tế bào phải hợp dòng thành lớp đơn - Loại bỏ dịch môi trường tất giếng - Cho 100 µl dịch virus NDV virus VSV liều 100 TCID50/ml (vào tất giếng trừ giếng đối ch́ng tế bào Virus pha lõng môi trường trì (DMEM 2% FBS) - Cho 100 µl mơi trường trì vào giếng đối ch́ng tế bào Sau đ́, nuôi ủ 24 37oC, 5% CO2 * Ngày th́ 3: - Kiểm tra hủy hoại virus giếng ch́ng virus (giếng A7- A12) Nếu kết 90% tế bào giếng ch́ng virus bị hủy hoại nhuộm giếng để đánh giá kết - Hoạt tính kháng virus dịch ChIFN-α đánh giá dựa vào biểu ́c chế bệnh tích tế bào thơng qua số lượng tế bào sống (giá trị OD595 đo sau xử lí tế bào với dung dịch MTT (Sigma) Phân tích kết dựa cơng th́c trình bày dược điển Việt Nam V trang 996 phương pháp xác định hiệu giá interferon alpha (Bộ Y tế, 2017) 2.2.4 Phương pháp xử lí số liệu Tất số liệu thơ xử lý phần mềm Stagraphic XV.I 2.3 hời gian địa điểm nghiên ću Nghiên ću thực từ tháng 10/2018 đến tháng 8/2019 Phịng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Y dược, Trung tâm Công nghệ Sinh học hành phố Hồ Chí Minh III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Mật độ tế bào UMNSAH/DF-1 phù ḥp đưa lên đĩa Sau 24 nuôi cấy, tất nồng độ khảo sát, hầu hết tế bào bám trải dài bề mặt đĩa ni, tế bào ć dạng hình sợi - hình thái phổ biến dịng UMNSAH/DF-1 (dịng ngun bào sợi phơi gà), không quan sát thấy tượng tế bào bất thường Diện tích tế bào bao phủ bề mặt đĩa ni phù thuộc lượng tế bào đưa vào giếng (Hình 1), cụ thể: giếng ć mật độ tế bào - 105 tế bào/ml (Hình 1a, b) tế bào thưa thớt; giếng ć mật độ tế bào 105 tế bào/ml (Hình 1c) 104 tế bào/ml (Hình 1d) tế bào bám trải tạo thành lớp đơn tế bào bề mặt, đ̃ phủ 50% bề mặt ni cấy Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(111)/2020 Sau 48 nuôi cấy, hầu hết tế bào giếng ć mật độ khác tăng sinh so với thời điểm 24 giờ, giếng ć mật độ 105 tế bào/ml, tế bào phát triển dày đặc chồng lên nhau, khơng cịn dạng lớp đơn tế bào Với kết thu trên, giếng ć mật độ tế bào ban đầu 105 tế bào/ml 105 tế bào/ml ć thể tạo thành lớp đơn tế bào, phủ 80 - 90% bề mặt đĩa tùy theo thời gian nuôi Các tế bào tiếp tục tăng sinh, phát triển nuôi cấy thêm - ngày tham gia vào quy trình xác định hoạt tính sinh học ChIFN-α Do đ́, để tránh tượng tế bào phát triển mọc chồng lên tạo thành nhiều lớp, ảnh hưởng đến kết nghiệm mật độ tế bào đưa vào ban đầu phù hợp 105 tế bào/ml (4 104 tế bào/giếng/100 µl) Kết phù hợp với mật độ tế bào sử dụng quy trình thực trình bày nghiên ću Xia cộng tác viên (2004) (a) (b) (c) (d) Hình Hình thái tế bào sau 24 đưa lên đĩa với mật độ 105 tế bào/ml (a), 105 tế bào/ml (b), 105 tế bào/ml (c) 105 tế bào/ml (d) 3.2 Xác định liều TCID50 virus NDV VSV Virus VSV (Vesicular stomatitis virus) NDV (Newcastle disease virus) đ̃ thích nghi tế bào UMNSAH/DF-1 sử dụng để làm nguồn virus cho thử nghiệm xác định đơn vị hoạt tính Sau 24 - 48 lây nhiễm virus VSV hay NDV, tế bào bắt đầu xuất bệnh tích (CPE, cytopathic efect) Tế bào nhiễm virus ć dạng co tròn kết cụm tế bào, hình thành vệt tan bong khỏi đĩa nuôi (Lam, 1995) Sau 72 lây nhiễm virus, số lượng giếng tế bào xuất bệnh tích tế bào đ̃ ổn định độ pha lõng khác virus Ở độ pha lõng virus cao, lượng tế bào sống nhiều Số lượng giếng tế bào ć biểu CPE ghi nhận trình bày bảng Bảng Tần xuất biểu CPE NDV VSV gây tế bào VSV Số giếng Tỉ lệ có CPE/ giếng tổng số có CPE giếng (%) 10 16/16 100 102 16/16 100 10 16/16 100 10 14/16 87,50 105 11/16 68,75 106 10/16 62,50 10 5/16 31,35 10 0/16 0,0 109 0/16 0,0 Đối ch́ng 0/16 0,0 Độ pha lõng virus NDV Số giếng Tỉ lệ có CPE/ giếng tổng số có CPE giếng (%) 16/16 100 16/16 100 15/16 93,75 13/16 81,25 6/16 37,50 2/16 12,50 0/16 0,00 0/16 0,00 0/16 0,00 0/16 0,00 105 Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 2(111)/2020 Kết cho thấy, dịch VSV pha lõng đến 103 lần gây bệnh tích tất giếng thí nghiệm, pha lõng đến 108 lần khơng cịn gây bệnh tích tế bào Các giếng đối ch́ng - tế bào không nhiễm virus, không xuất CPE Độ pha lõng VSV cho tỉ lệ xuất CPE 50% tương ́ng 106 107 (62,5% 31,25%) (Bảng1) Đối với dịch NDV, tất giếng nhiễm virus xuất CPE pha lõng 102 lần (100%) Dịch NDV pha lõng 107 lần không ć khả tạo nên CPE cho tế bào, tương đương với đối ch́ng Độ pha lõng NDV cho tỉ lệ xuất CPE 50% tương ́ng 104 105 (81,25% 37,50%) (Bảng 2) Dựa vào kết bảng 1, liều gây nhiễm 50% tế bào ni cấy (TCID50) VSV NDV tính theo công th́c Reed-Muench, kết thể bảng Bảng Bảng tính TCID50 dịch virus VSV NDV Dịch virus VSV NDV Độ pha lõng CPE 50% 106 107 104 105 Khoảng cách tỉ lệ (PD) 0,4 0,71 Độ pha lõng cho CPE 50% 10-6,4 10-4,71 TCID50/0,1 ml 106,4 104,71 Ý nghĩa số TCID50/0,1 ml ml dịch virus ml dịch virus VSV ch́a 107,4 NDV ch́a 105,71 TCID50 TCID50 Liều sử dụng quy trình xác định hoạt tính 100 TCID50/0,1 ml nên mẫu virus pha lõng để đạt nồng độ 3.3 Xác định đơn vị hoạt tính (IU/µg) ChIFN-α sử dụng NDV VSV Quy trình xác định hoạt tính (IU/µg) ChIFN-α thực dựa quy trình xác định hiệu giá của Interferon alpha Dược điển Việt Nam V (Bộ Y tế, 2017) Dựa giá trị OD595, đơn vị hoạt tính thơng số liên quan mẫu ChIFN-α thử nghiệm theo quy trình ́ng với loại virus NDV VSV trình bày bảng 3, mẫu thử nghiệm ć hàm lượng 160 μg/ml, 120 μg/ml 104 μg/ml, pha lõng 100 lần trước sử dụng cho thử nghiệm 106 Bảng Kết tính đơn vị hoạt tính giá trị liên quan mẫu ChIFN-α thử nghiệm quy trình sử dụng NDV VSV ChIFN-α hông số Nr Ns Mẫu Hiệu giá (160 μg/ml) Hoạt tính (IU/ml) Hoạt tính (IU/mg) Nr Ns Mẫu Hiệu giá (120 μg/ml) Hoạt tính (IU/ml) Hoạt tính (IU/mg) Nr Ns Mẫu Hiệu giá (104 μg/ml) Hoạt tính (IU/ml) Hoạt tính (IU/mg) Quy trình với NDV 4,320 6,658 505,601 106 3,1 107 3,845 6,807 779,203 7,8 106 6,5 107 3,949 7,070 869,991 8,7 106 8,4 107 Quy trình với VSV 4,139 6,297 446,296 4,5 106 2,8 107 3,953 6,859 749,537 7,5 106 6,3 107 3,932 6,952 811,168 8,1 106 7,8 107 Hiệu giá (%) = 100 2^(Ns - Nr) Hoạt tính mẫu (IU/ml) = Pr (D s 2^Ns) / (D r 2^Nr) Trong đó: Nr: độ hấp phụ giếng chứa mẫu chuẩn tế bào bảo vệ 50% Ns: độ hấp phụ giếng chứa mẫu thử tế bào bảo vệ 50% Pr: hoạt tính chuẩn (IU/ml) (106 IU/ml) Ds: độ pha loãng ban đầu mẫu thử (102) Dr: độ pha loãng ban đầu mẫu chuẩn (102) Kết xác định hoạt tính cho thấy quy trình thực hiện, sử dụng chủng virus khác NDV VSV kết tương đồng, lấy kết sử dụng NDV làm chuẩn độ chêch lệch kết dao động - 10%, độ sai lệch thấp giới hạn cho phép Bộ Y tế (hoạt tính mẫu thử phải đạt 70 - 150% so với công bố) Mặt khác, VSV chủng virus ć khả gây bệnh người, địi hỏi phải thao tác tủ cấy an tồn sinh học cấp phịng thí nghiệm đạt độ an toàn cấp Điều gây kh́ khăn cho phịng thí nghiệm muốn sử dụng chủng virus hêm ña NDV virus gây bệnh gia cầm, đ́ NDV hoàn toàn ć thể thay cho VSV thực xác định hoạt tính ChIFN-α điều kiện phịng thí nghiệm Tạp chí Khoa học Công nghệ Nông nghiệp Việt Nam - Số 2(111)/2020 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Quy trình xác định hoạt tính sinh học ChIFN-α đ̃ xây dựng với thông số cụ thể: mật độ tế bào UMNSAH/DF phù hợp tiến hành thí nghiệm 105 tế bào/ml (4 104 tế bào/ giếng/100 µl); virus NDV với liều 100 TCID50/0,1 ml hoạt tính sinh học (IU/mg) mẫu lần thí nghiệm lặp lại ć sai số thấp, dao động - 10%, giới hạn sai số cho phép Bộ Y tế sản phẩm interferon alpha interferons. Nature Reviews Immunology, 12 (2): 125-135 Hou, F., Liu, K., Shen, T., Zhou, B., Cao, R., Li, P., & Chen, P., 2011 Antiviral activity of rChIFN-α against vesicular stomatitis virus and Newcastle disease virus: a novel recombinant chicken interferon-α showed high antiviral activity. Research in veterinary science, 91 (3): e73-e79 Hussain, I., and Rasool, H., 2005 Adaptation of an indigenous very virulent infectious bursal disease virus on Vero cell line. Pakistan Veterinary Journal, 25 (3): 103-106 4.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên ću, khảo sát thích ́ng virus NDV dòng tế bào vật chủ khác để ć thể làm chủ quy trình xác định hoạt tính sinh học interferon alpha loài khác nhau, giúp chủ động việc đánh giá sản phẩm interferon Jiang, H., Yang, H., & Kapczynski, D R., 2011 Chicken interferon alpha pretreatment reduces virus replication of pandemic H1N1 and H5N9 avian inluenza viruses in lung cell cultures from diferent avian species. Virology journal, 8 (1): 447 TÀI LIỆU THAM KHẢO Meager, A., 2002 Biological assays for interferons Journal of immunological methods, 261 (1): 21-36 Bộ Y tế, 2017 Dược điển Việt Nam IV tập Nhà xuất Y Học, trang 994-998 Dai, M., Wu, S., Feng, M., Feng, S., Sun, C., Bai, D., Gu, M., Liao, M., & Cao, W., 2016 Recombinant chicken interferon-alpha inhibits the replication of exogenous avian leukosis virus (ALV) in DF-1 cells. Molecular immunology, 76: 62-69 González-Navajas, J M., Lee, J., David, M., & Raz, E., 2012 Immunomodulatory functions of type I Lam, K M., 1995 Apoptosis in chicken embryo fibroblasts caused by Newcastle disease virus Veterinary microbiology, 47 (3-4): 357-363 Mo, C W., Cao, Y C., & Lim, B L., 2001 he in vivo and in vitro efects of chicken interferon α on infectious bursal disease virus and Newcastle disease virus infection. Avian diseases, 389-399 Xia, C., Liu, J., Wu, Z G., Lin, C Y., and Wang, M., 2004 he interferon-α genes from three chicken lines and its efects on H9N2 inluenza viruses. Animal Biotechnology, 15 (1): 77-88 Building of a new procedure for determining the bioactivity of chicken interferon alpha (ChIFN-α) Nguyen hi hanh Giang, Nguyen Dang Quan, Ho Quang Do Abstract he procedure for determining bioactivity of chicken interferon-alpha (ChIFN-α) is based on the identiication of 2-interferon-alpha2 titres Main parameters deined in this process included: UMNSAH/DF1 cell density (chicken embryonic ibroblast line) was 105 cells/ml (4 104 cells/well/100 µl); Newcastle disease virus (NDV) was used at a dose of 100 TCID50 /0,1ml he results showed that the procedure of bioactive test had high stability when applied on two diferent viruses (NDV and VSV - Vesicular stomatitis virus) he results were within the permitted error range of the Ministry of Health (the allowable diference of the error is within 70 - 150%) Keywords: Chicken interferon alpha, cytopathic efect, tissue culture infectious dose Ngày nhận bài: 9/02/2020 Ngày phản biện: 18/02/2020 Người phản biện: TS Đoàn hị hanh Hương Ngày duyệt đăng: 27/02/2020 107 ... Liều sử dụng quy trình xác định hoạt tính 100 TCID50/0,1 ml nên mẫu virus pha lõng để đạt nồng độ 3.3 Xác định đơn vị hoạt tính (IU/µg) ChIFN-α sử dụng NDV VSV Quy trình xác định hoạt tính (IU/µg)... Quy trình thực Quy trình thực dựa theo ć cải tiến từ quy trình xác định hiệu giá interferon alpha công bố Dược điển Việt Nam V, áp dụng từ đầu năm 2018 (Bộ Y tế, 2017) phương pháp xác định hoạt. .. xác định hoạt tính ChIFN-α điều kiện phịng thí nghiệm Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nơng nghiệp Việt Nam - Số 2(111)/2020 IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Quy trình xác định hoạt tính sinh học