Phân lập vi sinh vật từ cây rong biển thuộc tỉnh khánh hòa và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của chúng

70 35 0
Phân lập vi sinh vật từ cây rong biển thuộc tỉnh khánh hòa và nghiên cứu một số hoạt tính sinh học của chúng

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Hồng Nhung PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ CÂY RONG BIỂN THUỘC TỈNH KHÁNH HỊA VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Hồng Nhung PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ CÂY RONG BIỂN THUỘC TỈNH KHÁNH HỊA VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Hữu Cường PGS.TS Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Hữu Cường PGS.TS Bùi Thị Việt Hà, người thầy tận tình hướng dẫn bảo em trình hoàn thành đề tài luận văn này, chia sẻ với em nhiều kinh nghiệm quý báu cho đường phát triển nghiệp sau Em xin chân thành cảm ơn tới thầy cô Bộ mơn Vi sinh vật học tồn thể cán Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) giảng dạy, tạo điều kiện giúp đỡ truyền đạt kiến thức cho em suốt năm học tập nghiên cứu trường Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán phịng Sinh học thực nghiệm, Viện Hố học hợp chất thiên nhiên,Viện Hàn lâm Khoa học Công Nghệ Việt Nam ủng hộ giúp đỡ em suốt trình thực luận văn Cuối em muốn gửi lời cảm ơn bố mẹ gia đình, bạn bè ln bên cạnh ủng hộ động viên em suốt thời gian qua Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên Lê Thị Hồng Nhung DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BCS Bovine DPPH 2,2-Dip trinitrop pNPG 4-Nitro LB Luria B MEME Minimu Eagle’s NAA Non-ess PCR Polyme PDA Potato d PSF Penicill fungizo VSV Vi sinh OTU operatio DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hoạt tính ức chế enzyme glucosidase giá trị IC50 mẫu 26 Bảng 3.2 Hoạt tính gây độc tế bào cao chiết nấm 28 Bảng 3.3 Giá trị SC50 bao vây gốc tự DPPH* mẫu lựa chọn 30 Bảng 6.1 Các chủng vi khuẩn phân lập mẫu rong 42 Bảng 6.2 Các chủng nấm phân lập mẫu rong khác 45 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ảnh minh họa đa dạng vi sinh vật bề mặt rong biển [6] Hình 1.2 Ảnh minh họa vi khuẩn, nấm rong biển sản xuất số chất trao đổi thứ cấp [29] 11 Hình 1.3 Bảng phân bố hợp chất từ nấm có nguồn gốc biển khác [32] 12 Hình 3.1 Ảnh phân lập vi khuẩn nội sinh 22 Hình 3.2 Ảnh số nấm sợi nội sinh phân lập rong 23 Hình 3.3 Quá trình lên men thu cao chiết vi sinh vật 25 Hình 3.4 Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase 26 Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc nấm HN37 27 Hình 3.6 Ảnh thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào người HepG2 (trái) LU (phải), ô khoanh chữ nhật, màu trắng có hoạt tính gây độc (lặp lại lần) 29 Hình 3.7 Khuẩn lạc chủng nấm HN22 29 Hình 3.8 Xác định hoạt tính bao vây gốc tự DPPH* mẫu .30 Hình 3.9 Khuẩn lạc nấm HN33 31 Hình 3.10 Tinh sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi EF4f/EF3r nhân gene 18S rRNA nấm HN22, HN37 HN33 32 Hình 3.11 Cây phát sinh chủng nấm HN37 dựa trình tự 18S rDNA, sử dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neibor Joining, giá trị Bootstrap sử dụng 500 33 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng nấm HN22 dựa trình tự 18S rDNA, sử dụng phần mềm MEGA7, phương pháp Neibor Joining, giá trị bootstrap sử dụng 500 34 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Vi sinh vật sống rong biển mối quan hệ chúng 1.1.1 Rong biển 1.1.2 Vi sinh vật sống rong biển 1.2 Vi sinh vật sống nội sinh rong 1.2.1 Đa dạng vi sinh vật sống rong 1.2.2 Sự tương tác vi sinh vật rong biển 1.2 Tình hình nghiên cứu hợp chất tự nhiên hoạt tính sinh học từ vi sinh vật sống rong biển 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 2.1.2 Hóa chất thiết bị 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật 15 2.2.2 Phương pháp lên men thu cao chiết vi sinh vật 18 2.2.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học 18 2.2.4 Phương pháp định danh phân loại 20 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 3.1 Phân lập vi sinh vật sống rong 22 3.1.1 Vi khuẩn 22 3.1.2 Vi nấm 23 3.2 Lên men vi sinh vật thu cao chiết 24 3.3 Hoạt tính sinh học cao chiết vi sinh vật 25 3.3.1 Hoạt tính ức chế enzyme-glucosidase 25 3.3.2 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư người 27 3.3.3 Hoạt tính chống oxi hóa cao chiết nấm 30 3.3.4 Vị trí phân loại chủng vi sinh vật 31 KẾT LUẬN 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 MỞ ĐẦU Với chiều dài 3.260 km bờ biển diện tích bề mặt triệu km , vùng biển nước ta đánh giá 16 trung tâm đa dạng sinh học lớn giới Vì vậy, cơng tác điều tra, nghiên cứu môi trường tài nguyên sinh vật biển vấn đề cần quan tâm nghiên cứu Trong đó, theo ước tính Việt nam có 638 lồi rong biển, 100 lồi số có tiềm sử dụng khoảng 60 lồi sử dụng làm thực phẩm, thuốc nguồn sản xuất keo công nghiệp (agar, carrageenan) hay alginate, fucoidan (một loại polysaccharide dùng điều trị ung thư) [13] Ở Việt Nam giới, nhiều loài rong biển ứng dụng y dược để chữa bệnh với vai trò kháng khuẩn, kháng virus, giảm cholesterol, chống tiểu đường, chống ung thư, lão hóa Bởi chúng chứa hợp chất có giá trị peptide, axit amin, vitamin, chất màu, chất polysaccharide (như fucoidan), chất trao đổi thứ cấp khác [1] Rong biển nơi cư trú nhiều loài sinh vật vi khuẩn, nấm, vi tảo, ấu trùng giáp xác, virus, vi khuẩn chiếm chủ yếu, với mật độ 10 -10 CFU/cm mẫu, so với nấm khoảng 10 Bề mặt rong nơi có tính cạnh tranh cao nguồn thức ăn giới hạn không gian khắc nghiệt vi sinh vật tiết kháng sinh nên vi sinh vật rong có tính đặc thù định Vi sinh vật có chế tổng hợp chất trao đổi thứ cấp, chất kháng sinh tiêu diệt ức chế vi khuẩn cố định vi khuẩn lên rong Theo ước tính, hợp chất phát từ nấm biển sống rong chiếm đa số (21%), tiếp sau bọt biển (19%), đước biển (16%) thấp nước biển (chỉ 1%) Chính vậy, nguồn chất có hoạt tính sinh học từ vi sinh vật có liên quan tới rong biển cho có tiềm [32] Việc phân lập vi sinh vật sống rong nghiên cứu hoạt tính sinh học có liên quan tới lĩnh vực y dược cần thiết Với vi sinh vật, chủ động lên men, sản xuất chất có hoạt tính nhằm tăng suất rút ngắn thời gian sản xuất hoạt chất, đảm bảo tính hiệu quả, ổn định sản suất Hơn nữa, việc tìm kiếm lồi vi sinh vật biển nhiệt đới có ý nghĩa khoa học thực tiễn Chính vậy, chúng tơi đề xuất thực đề tài: “Phân lập vi sinh vật từ rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa nghiên cứu số hoạt tính sinh học chúng’’ với mục tiêu tìm kiếm chủng vi sinh vật sống rong có hoạt tính ứng dụng ngành y dược Mục tiêu đề tài - Tạo sưu tập 100 chủng vi sinh vật từ rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa, Việt Nam - Nghiên cứu hoạt tính sinh học vi sinh vật phân lập Nội dung luận văn gồm: Phân lập 100 chủng vi sinh vật (gồm vi khuẩn nấm) từ loài rong biển - Lên men chủng vi sinh vật 50-100 chủng/0,5 L chủng Từ dịch lên men đó, chiết chất trao đổi thứ cấp để thu cao chiết Đánh giá hoạt tính (i) gây độc tế bào ung thư; (ii) chống oxi hóa (iii) ức chế enzyme -glucosidase 50-100 cao chiết vi sinh vật - Xây dựng phát sinh lồi chủng có hoạt tính (mỗi hoạt tính, chọn chủng) dựa trình tự gene 18S rRNA 34 Villarreal-Gómez L (2010) “Antibacterial and anticancer activity of seaweeds and bacteria associated with their surface,” Rev Biol …, vol 45, pp 267–275 40 35 (2010) Wahl M., ShahnazL., Dobretsov S., Saha M., Symanowski F., et al “Ecology of antifouling resistance in the bladder wrack Fucus vesiculosus: Patterns of microfouling and antimicrobial protection,” Mar Ecol Prog Ser., vol 411, pp 33–48 36 Wiencke C (2012) “Seaweed Biology Novel Insights into Ecophysiology and Utilization Ecological Studies, Vol 219 Analysis and Synthesis,” pp 1–508 37 Zheng L., Han X., Chen H., Lin W., Yan X (2005) “Marine bacteria associated with marine macroorganisms: the potential antimicrobial resources,” Ann Microbiol., vol 55, no 2, pp 119–124 38 Zuccaro A., Schoch C L., Spatafora J W., Kohlmeyer J., Draeger S., et al (2008) “Detection and identification of fungi intimately associated with the brown seaweed Fucus serratus,” Appl Environ Microbiol., vol 74, no 4, pp 931–941 39 Flemming H.-C., Murthy P S., Venkatesan R., Cooksey K., Eds (2009) Marine and Industrial Biofouling, vol Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, 2009 41 VI PHỤ LỤC Bảng 6.1 Các chủng vi khuẩn phân lập mẫu rong STT Mẫu rong VP9 Nho CR-sứ CR03 NT01 NT02 42 VP3rong mơ Sargas sum sp VP sụn VP Lauder (LD) 10 VPG 11 VP 11 12 VP12 13 VP13 14 VP 43 44 15 VP8 16 VP 17 CR9 18 CR8 19 CR7 20 CR6 21 NT10 22 NT11 23 NT12 24 NT13 25 NT14 26 NT08 27 NT07 28 NT06 29 VP9 30 VP8 Bảng 6.2 Các chủng nấm phân lập mẫu rong khác ST T Ký hiệu mẫu rong VP9 Nho CR-sứ 45 CR03 NT01 NT02 46 VP3 VP sụn VP Lauder (LD) 10 VPG 47 11 VP8 12 VP 13 04 14 NT06 48 15 NT05 16 NT04 17 VP8 18 CR04 49 19 VP16 20 Euche ma 21 Sớn lông 22 VP-15 23 Mơ 24 Padilas p 25 VP3X2 50 26 Mix 27 CB-3 28 VP3 29 VP2 30 Pravia 31 Kaxeno va 32 SN 51 33 SX 52 Hình 6.1 Xử lý trình tự 18S rDNA nấm HN37 HN22 phần mềm Bioedit Hình 6.2 Hình ảnh sử dụng Mega7 để so sánh (Alignment)các trình tự HN37 với trình tự 18S rDNA lựa chọn, sử dụng phần mềm ClustalX 53 ... vi sinh vật từ rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa, Vi? ??t Nam - Nghiên cứu hoạt tính sinh học vi sinh vật phân lập Nội dung luận văn gồm: Phân lập 100 chủng vi sinh vật (gồm vi khuẩn nấm) từ loài rong. .. vậy, chúng tơi đề xuất thực đề tài: ? ?Phân lập vi sinh vật từ rong biển thuộc tỉnh Khánh Hòa nghiên cứu số hoạt tính sinh học chúng? ??’ với mục tiêu tìm kiếm chủng vi sinh vật sống rong có hoạt tính. ..ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Lê Thị Hồng Nhung PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ CÂY RONG BIỂN THUỘC TỈNH KHÁNH HỊA VÀ NGHIÊN CỨU MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHÚNG

Ngày đăng: 20/11/2020, 09:34

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan