Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesteron
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ---------------------------- NGUYỄN HẢI ðĂNG NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ðƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERON LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : CHĂN NUÔI Mã số : 60.62.40 Người hướng dẫn khoa học : TS. ðỖ THỊ THẢO HÀ NỘI - 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan các kết quả nghiên cứu của tôi trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, do tôi thực hiện và chưa sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Các trích dẫn trong luận văn ñược ghi rõ tên tài liệu trích dẫn, tác giả và nguồn gốc tài liệu ñó. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Tác giả Nguyễn Hải ðăng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………ii LỜI CẢM ƠN! Trong quá trình thực hiện ñề tài của luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của các thầy, cô giáo trong khoa Chăn nuôi- Thuỷ sản cùng toàn thể bạn bè, sự giúp ñỡ tận tình của tập thể cán bộ công nhân viên Phòng công nghệ tế bào ñộng vật - Viện công nghệ sinh học. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. ðỗ Thị Thảo và PGS. TS. ðỗ Khắc Hiếu, phòng Công nghệ tế bào ñộng vật - viện Công nghệ sinh học ñã tạo ñiều kiện, hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài này. Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS -TS Nguyễn Bá Mùi, cán bộ giảng dạy bộ môn sinh hoá - sinh lí ñộng vật - Khoa Chăn nuôi - Thuỷ sản - Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã hướng dẫn và giúp ñỡ tôi tận tình ñể hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với gia ñình, bạn bè và những người thân ñã luôn thường xuyên chia sẻ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2008 Tác giả Nguyễn Hải ðăng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iii MỤC LỤC Lời cam ñoan .i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ vết tắt v Danh mục các bảng .vi Danh mục các hình . vii Danh mục các sơ ñồ viii 1. MỞ ðẦU . 1 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài .1 1.2. Mục ñích của ñề tài là 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 4 2.1. Miễn dịch và ñáp ứng miễn dịch 4 2.2. Hiểu biết về hormon sinh dục- Progesteron .28 2.3. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực ñề tài 33 3. ðÔI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 36 3.1. ðỐI TƯỢNG .36 3.2. NỘI DUNG .37 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 43 4.1. ðánh giá kết quả gây ñáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA .43 4.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng P3 - Al .48 4.3. Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron .51 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………iv 4.4. Gây báng cho chuột .59 4.5. Kiểm tra hiệu giá kháng thể .59 5. KẾT LUẬN . 63 5.1. KẾT LUẬN .63 5.2. ðỀ NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………v DANH MỤC CÁC TƯ VIẾT TẮT P3- Al (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim)- Albumin. P3- BSA (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim) - BSA BSA (Bovine Serum Albumin) ATCC (American Type Culture Collection) DMEM (Dulbeco s Modified Eagles Medium) DMSO (Dimethyl Sulphoxide) EIA (Enzyme Immuno Assay) ELISA (Enzyme Linking Immuno Sorbent) FBS (Fetal Bovine Serum) FSH (Follicle Stimulating Hormone) FDA (Food and Drug Adminitration) GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone) HPRT (Hypoxanthin - Phospho - Ribosyl- Transferase) HAT (Hypoxanthin - aminopterin- thimidine) medium LH (Luteinizing Hormone) PBS (Photphate Buffered Saline) PEG (Polyethylen glycol) FCA (Freund complex Adjuvant) RIA (Radio immuno assay) CNSH (Công nghệ sinh học) ðƯMD (ðáp ứng miễn dịch) KN (Kháng nguyên) KTðD (Kháng thể ñơn dòng) PTL (Phân tử lượng) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vi DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 1. Kết quả ñáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm 44 2. Sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu Progesteron trong các mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây ñáp ứng miễn dịch với P3 – Al (n=5) 47 3. Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp 50 4. Tỷ lệ giếng có kháng thể kháng progesteron trên tổng số giếng có tế bào lai 53 5. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng Progesteron trên 2 dòng tế bào . 54 6. Hiệu quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn . 55 7: Giá trị OD của dịch nổi của các giếng dương tính kháng progesteron có 1 dòng tế bào . 56 8. Tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng do 5 dòng tế bào tạo ra 58 9. So sánh hiệu giá kháng thể của dịch nổi và dịch báng 60 10. Kết quả tinh sạch kháng thể ñơn dòng bằng (SAS) và Propur Kit . 61 11. Kết quả kiểm tra huyết thanh thỏ thí nghiệm . 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………vii DANH MỤC CÁC HÌNH Số hình Tên hình Trang 1. Cấu trỳc ñiển hỡnh của khỏng thể 11 2. Bề mặt của khỏng thể IgG 12 3. Sơ ñồ cỏc chuỗi của một khỏng thể. .12 4. Cỏc ñộc tố của vi khuẩn bờn cạnh một tế bào cơ thể. .14 5. Cỏc ñộc tố trờn bị trung hoà bởi khỏng thể .15 6. Khỏng thể ñơn dũng liờn kết với một epitope ñặc hiệu .19 6. Cụng thức cấu tạo của progesteron .30 7. (A) Tế bào Sp2/0 ở ñộ phúng ñại 10ì20; (B) Tế bàoP3X ở ñộ phúng ñại 10ì20 .49 8. (A) Tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder. (B) Tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder; .51 9. (A) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá trình tách dòng; (B) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá trình tách dòng .53 10. Kiểm tra hiệu giá kháng thể ñơn dòng ở các ñộ pha loãng khác nhau; (A) Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần 60 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………viii DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ Số sơ ñồ Tên sơ ñồ Trang 1. Quy trình sản xuất kháng thể ñơn dòng .21 2a. Quá trình hình thành progesteron 30 2b. Quá trình thái biến của progesteron 30 11. MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết của ñề tài Công nghệ sinh học là một bước tiến quan trọng trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên ñể nâng cao ñiều kiện sống của con người. Thế giới cùng nhau chia sẻ những kiến thức khoa học, thực hành và công nghệ. Bên cạnh những lĩnh vực ñang phát triển rất cao như: công nghiệp ñiện tử, công nghệ thông tin, chúng ta ñang chứng kiến sự gia tăng phát triển ngày càng lớn mạnh của công nghệ sinh học (CNSH). Có nhiều lĩnh vực CNSH khác nhau theo ñối tượng ứng dụng như CNSH phân tử, CNSH thực vật, CNSH ñộng vật…CNSH có ứng dụng rộng rãi trong y dược, lương thực, thực phẩm, năng lượng, hóa chất, vật liệu mới, nông lâm ngư nghiệp, bảo vệ môi sinh và ngày nay trong thể thao ñỉnh cao CNSH cũng ñược áp dụng một cách hiệu quả. Trong CNSH, tế bào ñược coi là ñối tượng trung tâm vô cùng quan trọng. Chúng có cấu trúc phức tạp và tinh vi, thực hiện quá trình trao ñổi chất như một nhà máy hóa học với nhiều ưu việt. Do tế bào có nhiều ưu thế nên CNSH ñã sử dụng tế bào làm nhà máy sản xuất và là công cụ thử nghiệm. CNSH tế bào người và ñộng vật có nhiều ứng dụng trực tiếp liên quan ñến con người nên phát triển rất nhanh, nó ñáp ứng nhiều nhu cầu cho phòng và chữa trị bệnh và nhiều ứng dụng trong nông nghiệp nhất là trong lĩnh vực chăn nuôi…ðặc biệt, trong thế kỉ XX ñã có 3 phát minh nền tảng của CNSH ñộng vật mà cả thế giới phải xôn xao và công nhận, ñó là kháng thể ñơn dòng, tế bào gốc, và nhân bản vô tính ñộng vật. Sự ra ñời của kháng thể ñơn dòng là một bước tiến quan trọng, ñặc biệt là trong chẩn ñoán và có triển vọng lớn trong sản xuất thuốc hướng mục tiêu. [...]... A ch t t c các phân l p kháng th có ngu n g c t chu t có th thu ñư c * Tính n ñ nh c a t bào lai và kháng th ñơn dòng M t trong nh ng v n ñ c n ñư c nghiên c u trong quá trình s n xu t kháng th ñơn dòng là tính không n ñ nh c a t bào lai Trong qúa trình liên h p t bào lai, t bào lai ñư c hình thành m t cách ng u nhiên gi a các t bào 26 các giai ño n phân bào khác nhau Có th t bào giai ño n phân kỳ (interphase)... u Ki m tra các t bào lai ñư c ti n hành khi các qu n th t bào lai m c rõ và môi trư ng nuôi c y ng màu vàng Các qu n th t bào dương tính ph i ñư c tách dòng ñ s n xu t ra m t lo i kháng th ñ c hi u Hơn n a, vi c tách dòng nhanh còn giúp cho vi c tách bi t các t bào lai dương tính ra kh i s phát tri n quá m nh c a các t bào lai không s n su t kháng th Trư c ñây vi c tách dòng t bào lai thư ng ñư c th... ñơn dòng ( m t t bào - m t kháng th ), c a Okada dùng virut Sendai ñ lai các t bào (1958) và Barski (1960) vì s liên h p ng u nhiên c a các t bào Nhưng t t c các công trình nghiên c u trên ñ u không thu ñư c kháng th ñơn dòng có ñ c tính mong mu n Năm 1975 Kohler và Milstein cho là có th thu ñư c kháng th ñơn dòng có tính ñ c hi u cao t các dòng t bào thư ng tr c b ng cách lai t bào u tu v i t bào. .. tri n c a m i lo i FCS M t s nhà nghiên c u ưa dùng l p t bào nuôi c y trong nuôi c y các t bào lai Chúng là các t bào c a d ch phúc m c, các t bào lách, t bào tuy n c Các t bào này thư ng ñư c nuôi c y m t vài ngày trư c khi dung h p t bào 24 Bư c 4: Ch n l c và t o dòng các t bào s n xu t kháng th M c ñích c a vi c ki m tra và s m ñ nh lo i ñư c các t bào lai s n xu t kháng th mong mu n ñ ñ t n công... c các kháng th ñơn dòng cùng m t dòng thì gi ng h t nhau và ñư c s n xu t b i cùng m t dòng tương bào 2.1.6.1 Nguyên lý và quy trình s n xu t KTðD Nguyên lý: Cơ s c a k thu t s n xu t kháng th ñơn dòng là làm sao thu ñư c t bào dư i d ng th lai gi a t bào l mpho B và t bào u tu Các t bào này v a mang các ñ c tính c a t bào lympho (có kh năng hình thành kháng th ) và v a mang ñ c tính c a t bào u... n xu t kháng th ñơn dòng 21 Năm 1975 Kohler và Milstein ñã ñưa ra k thu t s n xu t kháng th ñơn dòng bao g m các bư c sau: * Bư c 1: Gây mi n d ch (t o ra các t bào lympho sinh kháng th ) * Bư c 2: Dung h p các t bào Lympho ñã ñư c gây m n c m v i t bào u tu Myeloma (HPRT-) ñ t o t bào lai * Bư c 3: Nuôi c y và phát tri n các t bào lai trong môi trư ng ch n l c và phát tri n các dòng t bào lai s n... t lo i kháng nguyên xâm nh p cơ th , ñáp ng mi n d ch c a cơ th s s n xu t ra nhi u lo i kháng th khác nhau, ñư c g i là kháng th ña dòng hay m t h kháng th M t t bào mi n d ch (lympho B) ch ñáp ng (m n c m) m t quy t ñ nh kháng nguyên (epitope) và s n xu t ra m t lo i kháng th Hình 6 Kháng th ñơn dòng liên k t v i m t epitope ñ c hi u Các kháng th ñơn dòng ch nh n bi t m t epitope trên m t kháng. .. các t bào u tu HPRT - không s n xu t kháng th v i t bào lách ñ ng v t ñã ñư c gây mi n d ch, dư i tác d ng c a polyethylen glycol (PEG) thì chúng có kh năng dung h p v i nhau thành các d ng: - T bào u tu v i t bào u tu - T bào u tu v i t bào lympho - T bào lympho v i t bào lympho Sau ñó chúng ñư c nuôi c y trong môi trư ng chon l c HAT Trong môi trư ng này ch có c p t bào lai: t bào u tu v i t bào lympho... nh ng ch t có tính kháng nguyên y u T bào lành ñư c nuôi c y r i gây mi n d ch 22 in vitro Phương pháp này ch c n m t lư ng nh kháng nguyên, th i gian gây mi n d ch ng n * Xét v dòng t bào ung thư tu : Có ba ñi u ki n ch y u ñ ch n dòng t bào ung thư tu ñ lai v i t bào lympho ñã ñư c gây mi n d ch Trư c tiên t bào ung thư tu ph i có d u n ñ kháng aminopterin, nh m lo i tr nh ng t bào u tu không dung... mi n d ch v i kháng nguyên là các protein ho c các kháng nguyên hoà tan M t s ñ c tính quan tr ng khác c a kháng th ñơn dòng c n ñư c xác ñ nh như kh năng gây k t t a, ngưng k t…, l p và phân l p Ig, ñi u này có liên quan ch t ch v i m c ñích s d ng kháng th * Nhân nuôi t bào lai s n xu t kháng th ñơn dòng in vitro S n xu t kháng th ñơn dòng trong môi trư ng nuôi c y thư ng d hơn và kháng th s n xu . 4.2. Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ñơn dòng kháng P3 - Al...................48 4.3. Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng progesteron. .......................................................................................................49 8. (A) Tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder. (B) Tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18
