TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN NGUYỄN THỊ TUYẾT SANG ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MUỐI LÊN VÒNG ĐỜI CỦA LUÂN TRÙNG NƯỚC NGỌT Brachionus angularis LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2011 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu, Ban Chủ Nhiệm khoa Thủy Sản trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện cho tơi thực đề tài, đồng thời tơi xin gửi lời cảm ơn đến Trần Sương Ngọc tận tình hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn đến anh chị Bộ mơn Thủy sinh học ứng dụng nhiệt tình giúp đỡ q trình thực thí nghiệm Xin chân thành cảm ơn TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu ảnh hưởng ñộ mặn lên thời gian thành thục, thời gian phát triển phôi, nhịp sinh sản, sức sinh sản, tuổi thọ, tốc ñộ lọc tốc ñộ ăn ln trùng Brachionus angularis Thí nghiệm thực với nồng ñộ muối 0, 1, 3, 5‰ có sử dụng dụng cụ điều hịa nhiệt độ 280C Bố trí độc lập cá thể cốc thủy tinh Kết cho thấy ñộ mặn cao trình sinh trưởng phát triển B angularis giảm Thời gian thành thục, thời gian phát triển phơi kéo dài, sức sinh sản, tốc độ ăn lọc thể giảm dần theo tăng độ mặn Ở độ mặn 1‰ thích hợp cho phát triển luân trùng, ñộ mặn 3‰ q trình bắt đầu suy giảm, độ mặn 5‰ thơng số có giá trị thấp so với nghiệm thức lai PHẦN ĐẶT VẤN ĐỀ Nghề nuôi thủy sản giới phát triển từ lâu, nguồn lợi sản phẩm thủy sản mang lại từ họat ñộng bảo vệ khai thác hợp lí từ người đóng góp tích cực vào an tồn nhu cầu thực phẩm cho người khắp Châu lục Nước ta nói chung, ĐBSCL nói riêng có tiềm lớn nuôi trồng thủy sản nước nước lợ - mặn Trong năm qua, nghề nuôi thủy sản ñã ñạt ñược thành tựu ñáng ghi nhận, góp phần quan trọng vào giá trị xuất thủy sản nước Sản lượng thủy sản vùng chiếm khoảng 50 %, diện tích ni trồng chiếm khoảng 60 %, sản lượng nuôi trồng thủy sản chiếm khoảng 65 % giá trị xuất thủy sản chiếm ñến 51 % nước Năm 2003 tổng kim ngạch xuất ngành thủy sản ñạt 2.240.000.000 USD.(Dương Nhật Long, 2008) Thức ăn tự nhiên đóng vai trị quan trọng, định thành cơng q trình ương ni nhiều lồi động vật thủy sản, đặc biệt thích hợp giai đoạn ấu trùng (Trần Thị Thanh Hiền ctv., 2000) Thức ăn tự nhiên có kích cỡ tương đối nhỏ, mắc xích tạo nên suất sinh học sơ cấp, ñánh giá sơ hàm lượng chất dinh dưỡng thị mơi trường Trong đó, ln trùng dùng làm thức ăn tươi sống cho ấu trùng nhiều loài cá giáp xác biển (Indy et al., 2008, Dhert, 1996) Ln trùng có kích thước nhỏ, bơi lội chậm, lơ lửng tầng nước, chịu ñựng tốt với điều kiện mơi trường, đặc biệt ni với mật ñộ cao (2000 con/ml theo báo cáo Hirata, 1979 trích dẫn Dhert, 1996) Ln trùng sinh sản nhanh nên đủ cung cấp số lượng lớn thức ăn cho ấu trùng tôm cá thời gian ngắn Ngoài ra, người ta cịn giàu hóa ln trùng để bổ sung dưỡng chất cho ấu trùng ñộng vật thủy sản nhờ vào khả ăn lọc thụ động của (Dhert, 1996) Việc nuôi sử dụng luân trùng làm thức ăn cho ấu trùng tơm cá ngày ứng dụng rộng rãi ương ni (hơn 60 lồi cá biển 18 lồi giáp xác, Dhert, 1996), việc nghiên cứu vịng đời phát triển ln trùng có vai trị quan trọng hệ thống ni ln trùng, nhằm góp phần vào việc đảm bảo thức ăn cho ấu trùng cá, ñặc biệt ñối với ấu trùng cá bống tượng (Lê Thành Nhân Thái Mỹ Anh, 2005) Những hiểu biết ñặc ñiểm sinh học đối tượng góp phần đáng kể cho phát triển nuôi thủy sản Tuy nhiên, tốc ñộ phát triển, khả sinh sản, tuổi thọ trung bình vịng đời ln trùng chịu ảnh hưởng chất lượng số lượng thức ăn, ñiều kiện mơi trường (Gilbert, 2003), yếu tố độ mặn xem yếu tố mơi trường quan trọng Vì vậy, việc xác định điều kiện tối ưu cho phát triển quần thể luân trùng cần thiết Trên sở đó, đề tài: “Ảnh hưởng nồng độ muối lên vịng đời ln trùng nước (Brachionus angularis)” ñược thực với : Mục tiêu ñề tài: nghiên cứu tiêu sinh học, sinh sản phát triển luân trùng nước Brachionus angularis nồng ñộ muối khác nhau, nhằm xác ñịnh ñiều kiện tối ưu cho phát triển luân trùng nước Brachionus angularis Nội dung ñề tài: Theo dõi tiêu thời gian thành thục, thời gian phát triển phôi, nhịp sinh sản, tuổi thọ, sức sinh sản, tốc ñộ lọc tốc ñộ ăn luân trùng Brachionus angularis theo ñiều kiện ñộ mặn 0, 1, 3, 5ppt PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc ñiểm sinh học 2.1.1 Phân loại Theo Pechenik (2005) hệ thống phân loại luân trùng nước (Brachionus angularis) ñược xác ñịnh sau: Giới: Ngành: Lớp: Bộ: Họ: Giống: Loài: 2.1.2 Animalia Rotifera Monogononta Ploima Brachionidae Brachionus Brachionus angularis (Gosse, 1851) Phân bố Luân trùng nhóm sinh vật phân bố rộng, chủ yếu nước (90%) giới hạn vùng có nhiệt độ q nóng q lạnh, nước chảy mạnh hay vùng nước mặn Loài Brachionus chủ yếu sống vùng nhiệt đới, tìm thấy chúng tất thủy vực ao, hồ, sơng, đầm lầy, vùng rêu ẩm…(Dương Trí Dũng, 2000) 2.1.3 Hình thái cấu tạo Trùng bánh xe thuộc nhóm ñộng vật ña bào nhỏ số 1000 lồi mơ tả, 90% số sống sinh cảnh nước ngọt, chiều dài thể ñạt tới 2mm Cơ thể tất lồi ln trùng gồm có số lượng khơng đổi tế bào, loài Brachionus chứa khoảng 1000 tế bào (Dhert, 1996) Ln trùng có kích thước từ 100 – 340 µm (Dhert, 1996), có dạng hình trứng dài, hẹp theo hướng lưng bụng, bờ bụng trước có gai dạng u lồi có khe hình chữ V Ln trùng thường phân bố ao ñầm nước lợ vùng cửa sơng (Đặng Ngọc Thanh, 1980) Hình 2.1: Hình thái bên ngồi Ln trùng Brachionus angularis Cơ thể luân trùng gồm phần: ñầu, thân chân - Phần đầu: có vịng tiêm mao bánh xe giúp di chuyển ñưa thức ăn vào thể, chứa quan quay, vành, dễ ñược nhận biết lơng tơ hình vành khăn Vành có chức vận động chuyển động xốy nước làm cho chúng dễ dàng hấp thu ñược thức ăn Miệng nằm phần trước vòng tiêm mao, gần cuối hay mặt bụng (Dương Trí Dũng, 2000) - Phần thân: bên bao phủ lớp chitin biểu bì lớp mỏng phần đầu dày có dạng đệm có thùy hướng vào Ở vài loài lớp chitin mỏng mềm dẻo vài lồi khác dày cứng gọi vỏ - Phần thân chứa ống tiêu hóa, hệ thống tiết quan sinh dục Hệ tiêu hóa: luân trùng thu thức ăn nhờ vịng tiêm mao sau vào miệng ñến hàm nghiền Hàm nghiền nghiền hạt thức ăn nhiều ñường khác (cắt, nghiền…) ñi vào thức quản, dày, ruột hậu mơn (Nogrady, 1993) Ống tiêu hóa có lát mơ bì có lơng giúp chuyển thức ăn ln trùng tảo, ñộng vật nhỏ bé cặn có kích thước thích hợp Con đực khơng có hệ tiêu hóa hoạt động (trừ seisonidae), chúng sống vài chết sau giao phối (Thái Trần Bái, 2001) Hệ tiết: luân trùng tiết chủ yếu chất thải có nguồn gốc đạm (phần lớn ammonia) Sự chuyển ñộng tiêm mao tế bào lửa (Hame cells) tạo nên dòng chảy nhỏ có chất lỏng tiết vào túi chảy vào bàng quang sau tiết ngồi thường xun đặn (Nogrady, 1993) Màu thân thể màu xám, vàng đơi tím hay xanh thường màu thể phần thức ăn ống tiêu hóa chất thải phận chứa chất tiết (Dương Chí Dũng, 2000) - Chân cấu trúc co rút được, kiểu vịng, khơng phân đốt cuối có ngón (Dhert, 1996) Sự chuyển tiếp chân thân hậu mơn, điểm nằm ngồi vị trí bên ngồi mặt lưng nơi thải ruột, bàng quang vòi trứng Cơ thể có khoảng 1000 tế bào Cơ thể lớn lên phân chia tế bào mà nguyên sinh chất tăng lên Con ñực có kích thước nhỏ cái, khơng có quan tiêu hóa khơng có bong bóng (Trần Thị Thanh Hiền ctv., 2000) 2.1.4 Kích thước luân trùng Theo Huang (1996), kích thước ln trùng Brachionus angularis có chiều dài 80 – 110 µm chiều rộng từ 62 - 83µm Luân trùng B angularis có kích thước khác tùy theo dịng Ln trùng B angularis có kích thước 88-120 µm (Nguyễn Văn Hải, 2008) Theo báo cáo Kaya and Altingdag (2007) ln trùng B angularis có kích thước nhỏ 174 x 140 µm Báo cáo Yin and Niu (2007) kích cở trung bình B angularis 130 ± x 115 ± µm Kết nghiên cứu dòng B.angularis Nhật Bản Minoru (1997) B.angularis pyriformis 80-110 x 62-83 µm, B.angularis donghuensis 98-102 x 80-82 µm 2.1.5 Đặc điểm sinh sản vịng đời Theo Dhert (1996) tuổi thọ luân trùng ngắn, trung bình 3,4 - 4,4 ngày ñiều kiện nhiệt ñộ 25oC Chúng đạt trưởng thành 0,5-1,5 ngày sau nở hay đẻ Sau ñẻ liên tục, mổi lần cách khoảng Suốt đời sống tham gia đẻ 10 lứa Tuy nhiên khả sinh sản chúng phụ thuộc nhiều vào điều kiện mơi trường, đặc biệt nhiệt độ Theo Hoff Snell (1989, trích Nguyễn Tuấn Khương, 2008), vịng đời ln trùng gồm giai đoạn: Giai đoạn phơi: từ trứng tạo thành ñến nở Giai ñoạn trước sinh sản: từ trứng nở ñến sinh sản lần ñầu tiên Giai ñoạn sinh sản: từ ñẻ trứng lần ñầu tiên ñến trứng cuối ñược ñẻ Giai ñoạn sau sinh sản: từ ngừng ñẻ ñến chết Thời gian trải qua giai ñoạn phụ thuộc vào điều kiện mơi trường tùy lồi Hình 2.2: Vịng đời Ln trùng Brachionus plicatilis Ln trùng có hai hình thức sinh sản: sinh sản vơ tính sinh sản hữu tính - Sinh sản vơ tính: điều kiên mơi trường thuận lợi vơ tính sinh sản trứng lưỡng bội (2n) phát triển thành đơn tính Con sinh sản với tốc ñộ nhanh, khoảng ñẻ trứng lần, lần cho – trứng 2n có kích cỡ (80 – 100) x (100 – 130) µm Tốc độ sinh sản phụ thuộc vào điều kiện ni tuổi thọ ln trùng Đây hình thức sinh sản nhanh để gia tăng quần thể ln trùng hình thức ni quan trọng hệ thống nuôi luân trùng - Sinh sản hữu tính: vịng đời ln trùng có biến đổi đột ngột điều kiện mơi trường (chẳng hạn nhiệt ñộ, nồng ñộ muối, số lượng chất lượng thức ăn thay ñổi, cạnh tranh…), chúng bắt đầu hình thức sinh sản hữu tính Trong q trình xuất đơn tính hữu tính, chúng có hình thái giống khó phân biệt, nhiên hữu tính sinh trứng đơn bội (1n) Trứng đơn bội khơng thụ tinh phát triển thành đực đực có kích thước 1/3 kích thước Chúng khơng có ống tiêu hóa bàng quang có tinh hồn đơn nhiều tinh trùng thành thục Ln trùng đực bơi lội nhanh khơng tiêu thụ thức ăn có vịng đời ngắn so với thơng thường ½ Con (2n) ñẻ – trứng 1n, có kích cỡ (50 – 70) x (80 – 100) µm, trứng sẻ nở thành đực 1n có kích cỡ nhỏ Con đực có chứa đầy tinh dịch (1n) Con ñực 1n sẻ bắt cặp giao phối với có trứng 1n để thụ tinh thành trứng 2n Trứng nghỉ (Cyst): trứng ñơn bội thụ tinh Trứng thụ tinh 2n có vỏ dày tương đối lớn giúp chịu đựng qua ñiều kiện khắc nghiệt (nhiệt ñộ, nồng ñộ muối, thức ăn thiếu, khô hạn…) trứng tồn lâu, mơi trường thuận lợi (có kích thích biến ñổi nhiệt ñộ, áp suất thẩm thấu, hóa học mơi trường nước phần thống khí) chúng nở thành 2n lại sinh sản đơn tính tiếp tục (Dương Trí Dũng, 2000) 2.1.6 Phát triển tuổi thọ Ln trùng khơng có tượng lột xác, trưởng thành thường lớn gấp – 10 lần so với cá thể nở Tuy số tế bào cá thể trưởng thành tương tự lồi (Dương trí Dũng, 2000) Tuổi thọ thường biến động theo lồi: ngày (Brachionus plicatilis), ngày (Epiphanes senta), 7.4 ngày (Lecan inermis) Con đực sống – ngày (Dương Trí Dũng, 2000) 2.1.7 Q trình phát triển phơi trứng luân trùng Theo kết nghiên cứu Paez et al., (1988) q trình phát triển phơi trứng amictic B.plicatilis, q trình phát triển phơi trứng amictic gồm có 19 giai đoạn, giai đoạn có đặc ñiểm khác Tác giả miêu tả: bắt ñầu phân chia tế bào khoảng 30-40 phút sau ñẻ, giai ñoạn tế bào khoảng 45-55 phút sau ñẻ, rãnh chân bắt ñầu xuất (8,5 -10,5 sau đẻ), xuất đầu ngón chân (11 -11,5 sau ñẻ), vành tiêm mao bắt ñầu chuyển ñộng (13,5 - 15,5 giờ), xuất ñiểm mắt (15,516,5 giờ), quan sát thấy tiêm mao vành (17-17,5 giờ), thời gian ngắn sau điểm mắt rõ ràng hàm nghiền xuất Khoảng 30 -60 phút trước nở trứng có hình dạng gần hình tam giác, phơi mở rộng trứng nở Thời gian phát triển phơi khác tùy theo lồi, dịng luân trùng (Kurokura, 1991) Thời gian phát triển phôi chịu ảnh hưởng nhiệt ñộ, yếu tố di truyền phần ăn (Yufera,1987 trích dẫn Paez et al.,, 1988), Xi and Huang, 2000, Walz,1987, Lonsdale and Levinton, 1985) Nhiệt độ cao thời gian phát triển phơi diễn nhanh (Xi ang Huang, 2000, Huang, 1989, Walz, 1987) Mặt khác, theo Sipaúbatavares and Bachion (2001) thời gian phát triển phơi lồi động vật cịn bị ảnh hưởng thức ăn 2.2 Đặc điểm dinh dưỡng Ln trùng lồi ăn lọc khơng chọn lọc,thức ăn có kích cỡ từ 20 – 25µm mang ñến miệng nhờ chuyển ñộng vòng tiêm mao (Dhert, 1996), thơng qua hoạt động bơi lội Trong tự nhiên thức ăn chủ yếu luân trùng loài tảo phiêu sinh như: Chlorella, Nanochoropsis (Hoff and Snell, 2004), Scenedesmus costato-granulatus, Kirchrenielle contorta, Phacus pyrum, Ankistrodesmus convoluus (Schuluter, 1908) Chlorella sử dụng nhiếu hệ thống ni ln trùng nhờ tốc độ sinh PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian ñịa ñiểm nghiên cứu Đề tài ñược thực thời gian từ 01/2011 ñến tháng 06/2011 phịng thí nghiệm ln trùng , Khoa Thủy Sản- Trường Đại học Cần Thơ 3.2 Đối tượng nghiên cứu Luân trùng nước Brachionus angularis 3.3 − − − − − − Vật liệu nghiên cứu Một số hóa chất: dung dịch Lugol, Javel, Na2S2O3, HCl (1.4N), NaOH (10N) Dụng cụ lưu giữ giống ln trùng (ống Falcon) Kính nhìn nổi, kính hiển vi Cốc thủy tinh, lưới lọc (thu) luân trùng, pipette, … Dụng cụ tăng nhiệt, máy ño pH, nhiệt kế, nước ót… Thức ăn cho Luân trùng: tảo Chlorella đặc 3.4 Phương pháp nghiên cứu Ln trùng B angularis có nguồn gốc từ phịng thí nghiệm thức ăn tự nhiên khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ cho ăn tảo Chlorella đặc với liều lượng 60.000 tb/con luân trùng/ngày Sau luân trùng ñạt giai ñoạn tăng trưởng nhanh, tiến hành hóa thời gian 20h, 20h chia làm lần hóa lần cách ñể tránh cho luân trùng bị sốc chết biến đổi đột ngột mơi trường Tảo Chlorella ni cấy phịng thí nghiệm dung dịch Walne (Coutteau, 1996) đặc máy ly tâm với vận tốc 3000 vòng/phút trữ tủ lạnh 4oC cho ăn tuần Mật ñộ tảo ñược ñếm buồng ñếm Burker ñược xác ñịnh theo công thức (Coutteau, 1996) Số tế bào/ml = n1 + n2 x 106 x d 160 Trong đó: n1 số tế bào tảo buồng ñếm thứ n2 số tế bào tảo buồng ñếm thứ hai d hệ số pha loãng 3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm * Ảnh hưởng nồng ñộ muối ñến tiêu sinh sản, sinh trưởng ln trùng Thí nghiệm bố trí nghiệm thức với 10 lần lặp lại Nghiệm thức (NT ppt): ni ln trùng nồng độ muối ppt Nghiệm thức (NT ppt): nuôi luân trùng nồng ñộ muối ppt Nghiệm thức (NT ppt): ni ln trùng nồng độ muối ppt Nghiệm thức (NT ppt): nuôi luân trùng nồng độ muối ppt Thí nghiệm tiến hành phịng thí nghiệm có máy điều hịa ổn định nhiệt độ Nước thí nghiệm pha từ nước 25‰ Mỗi luân trùng sau nở từ – bố trí riêng vào cốc thủy tinh có chứa 1ml nước độ mặn nghiệm thức Các cốc thủy tinh nghiệm thức ñược ñặt khai sử dụng heater ñể ổn ñịnh nhiệt ñộ 280C Luân trùng quan sát sau 30 phút kính lúp (độ phóng đại điều chỉnh lúc quan sát) Thức ăn tảo Chlorella đặc với liều lượng cho ăn x 106 tb/ml Con sau sinh sản ñược chuyển ñến cốc thủy tinh có điều kiện ni tương tự đếm số lượng non sinh Các thông số theo dõi: - Thời gian phát triển phơi – De (giờ): tính từ lúc trứng ñẻ cho ñến nở Thời gian thành thục – Dp (giờ): thời gian từ lúc nở cho ñến thành thục lần ñầu Nhịp sinh sản: thời gian lần sinh sản Sức sinh sản – R0: Số lượng trứng sinh từ suốt vịng đời Tuổi thọ trung bình: Thời gian sống trung bình luân trùng (giờ) Tốc độ lọc thức ăn – F (µl/con/giờ) tính theo cơng thức Stelzer (2006): v(lnC0 - lnCt) F= nt Trong đó: C0: Lượng thức ăn ban đầu (tế bào/µl) Ct: Lượng thức ăn thời điểm t (tế bào/µl) t : thời gian ni (giờ) n : số lượng luân trùng (con) thể tích v (tế bào/µl) - Tốc độ ăn – I ( tế bào/con/giờ): số tế bào tảo luân trùng sử dụng, xác ñịnh khoảng thời gian, tính theo cơng thức (Ferrando et al., 1993): I = F√C0 Ct Trong đó: C0: Lượng thức ăn ban đầu (tế bào/µl) Ct: Lượng thức ăn thời điểm t (tế bào/µl) F: tốc độ lọc (µl/con/giờ) 3.4.1 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu ñược xử lý theo Statistica 7.0 one – way ANOVA, khác biệt có ý nghĩa mức P < 0.05 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MUỐI LÊN VÒNG ĐỜI CỦA LUÂN TRÙNG NƯỚC NGỌT Brachionus angularis Kết thu ñược thời gian thành thục, nhịp sinh sản, thời gian phát triển phôi, sức sinh sản tuổi thọ Brachionus angularis trình bày bảng sau: Bảng 4.1 Ảnh hưởng ñộ mặn lên ñặc ñiểm sinh sản B angularis Đặc ñiểm Thời gian thành thục – Dp (giờ) Nhịp sinh sản (giờ) Thời gian phát triển phôi – De (giờ) Sức sinh sản – R0 (trứng) Tuổi thọ (giờ) Tốc độ lọc (µl/con/giờ) Tốc độ ăn (tb/con/giờ) NT ppt 13,30 ± 1,19bc NT ppt 12,11 ± 1,20a NT ppt 14,40 ± 1,51c NT ppt 24,52 ± 0,61d 2,08 ± 0,21a 2,43 ± 0,23b 3,30 ± 0,40c 6,67 ± 0,29d 8,56 ± 0,18b 7,75 ± 0,34a 12,16 ± 0,87c 15,75 ± 0,25d 21,40 ± 1,07c 20,70 ± 1,16c 9,1 ± 0,99b 4,20 ± 0,79a 65,69 ± 2,47bc 7,5 ± 0,9b 67,76 ± 1,78c 10,2 ± 1,6c 62,36 ± 2,68b 6,9 ± 1,8b 45,60 ± 3,88a 3,3 ± 0,5a 15336 ± 2089b 20022 ± 3095c 13997 ± 3811b 6681 ± 922a Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê mức P0.05 Hình 4.1: Ln trùng cốc ml điều hịa dụng cụ tăng nhiệt Hình 4.2: Ln trùng mang trứng q trình thí nghiệm 4.1 Thời gian thành thục (Dp) 30.00 Thời gian thành thục (giờ) 25.00 20.00 15.00 10.00 5.00 0.00 0ppt 1ppt 3ppt 5ppt NT Hình 4.3 Thời gian thành thục B angularis Kết cho thấy thời gian thành thục B angularis có xu hướng tăng dần tăng nồng ñộ muối Thời gian thành thục chậm nghiệm thức 5ppt (24,52 ± 0,61 giờ) nhanh nghiệm thức 1ppt (12,11 ± 1,20 giờ) Kết phân tích thống kê cho thấy tuổi thành thục nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa (P