Bộ Giáo dục Đào tạo Trường Đại học Quy Nhơn TIỂU LUẬN BÀI THI CUỐI KỲ Môn: Vật lý vật liệu nano Đề tài: HÃY TRÌNH BÀY NHỮNG HIỂU BIẾT CỦA BẠN VỀ TÍNH CHẤT, CÁC CƠNG NGHỆ CHẾ TẠO PHỔ BIẾN (PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC) VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÁC HẠT NANO OXXIT SẮT (Fe3O4) TỪ TÍNH? Tên người làm: Lê Thị Diễm Hằng Lớp: Cao học Vật Lý-K20 Giáo viên: PGS.TS.Phạm Thành Huy Quy Nhơn, Năm 2018 MỤC LỤC Trang Một số tính chất hạt nano từ tính Fe3O4 : 1.1 Kết đo phổ nhiễu xạ tia X mẫu Fe3O4 1.2 Ảnh TEM mẫu hạt nano từ tính Fe3O4: 2 Các công nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học): Ứng dụng hạt nano xít sắt(Fe3O4) từ tính .4 3.1 Ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 đánh dấu tách chiết tế bào: 3.1.1 Chức hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4: 3.1.2 Đánh dấu tế bào tách chiết tế bào 3.1.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe3O4 với kháng thể antiCD4 3.1.2.2 Gắn kết với tế bào bạch cầu: Một số tính chất hạt nano từ tính Fe3O4 : 1.1 Kết đo phổ nhiễu xạ tia X mẫu Fe3O4 Mục đích phép đo xác định cấu trúc kích thước hạt mẫu Fe3O4 Mẫu Fe3O4 sau chế tạo rửa nước cất vài lần, tiến hành sấy khô thành dạng bột Sau mẫu đem ghi phổ nhiễu xạ tia X(XRD) Hình kết đo XRD mẫu hạt Fe 3O4 Phổ nhiễu xạ so sánh với PDF 790418 với bước sóng Cu Kα1 Kết cho thấy đỉnh nhiễu xạ thuộc Fe 3O4 chứng tỏ mẫu chứa phần lớn Fe3O4 Đồng thời đỉnh nhiễu xạ cực đại, mẫu tạo thành dạng tinh thể Các đỉnh nhiễu xạ cực đại tương ứng với đỉnh chuẩn cấu trúc oxit sắt từ dạng nano Trong kết đo nhiễu xạ tia X khơng thấy có xuất đỉnh nhiễu xạ cực đại lạ, chứng tỏ có pha ơxit sắt từ cấu trúc tinh thể Sự mở rộng đỉnh nhiễu xạ nguyên nhân trạng thái cấu trúc thân hạt từ gây nên Kích thước trung bình hạt tính từ đỉnh nhiễu xạ có cường độ mạnh phổ nhiễu xạ tia X, vị trí 2θ vào cỡ 35o sử dụng công thức Scherrer (1): D= (1) với D đường kính hạt trung bình, λ bước sóng tia X tới (λ = 1,54056 Ǻ) , B độ rộng phổ (B=0,62 o), θ vị trí đỉnh nhiễu xạ (17,5 o) Kết tính tốn thu được: D=13,51 nm Từ khẳng định rằng, chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 với đường kính vào khoảng cỡ vào khoảng 10-16 nm (4 2 ) (3 3 ) (4 0 ) (2 2 ) 30 40 (4 ) (3 1 ) (2 ) In tensity 20 50 60 70 2 (degree) Hình 1: Phổ nhiễu xạ tia X mẫu Fe3O4 1.2 Ảnh TEM mẫu hạt nano từ tính Fe3O4: Sau mẫu Fe3O4 tiến hành ghi phổ nhiễu xạ tia X để khẳng định chế tạo hạt nano từ tính Fe 3O4 xác định cấu trúc kích thước hạt dựa tính tốn lý thuyết tiếp tục tiến hành chụp ảnh TEM cho mẫu Fe3O4 với mong muốn xác định rõ kích thước cấu trúc hạt nano từ tính Fe 3O4 Trước đem chụp ảnh TEM mẫu Fe3O4 rửa nhiều lần nước cất đánh siêu âm vòng 15-30 phút hạt phân tán nước Bằng cảm quan chúng tơi thấy hạt nano từ tính Fe3O4 phân tán nước dung dịch có màu đen, hạt có từ tính theo cách đơn giản dùng miếng nam châm nhỏ đặt đáy cốc sau chừng 10-15 phút hạt bị lắng xuống phía đáy cốc, sau thời gian để ngồi khơng khí dung dịch có chuyển sang màu nâu 1.3 Tính chất từ: Tiến hành đo đường cong từ hóa mẫu Fe3O4 dạng bột sấy khơ nhiệt độ phịng sử dụng hệ đo thiết bị từ kế mẫu rung Mục đích phép đo xác định tính chất từ từ độ bão hòa mẫu Fe3O4 Kết thu thể hình 2: 100 80 B 60 40 M(H) 20 -20 -40 -60 -80 -100 -15000 -10000 -5000 5000 10000 15000 H (Oe) Hình 2: Đường cong từ hóa mẫu Fe3O4 Kết cho ta thấy lực kháng từ H c=0, mặt khác thấy từ độ dư Mr=0, tức khơng có hiệu ứng trễ khơng đáng kể, nhận xét hạt nano từ tính Fe 3O4 có tính chất siêu thuận từ Đường cong đường đối xứng, từ độ bão hịa (tính theo emu/g) tương đối cao, cụ thể đồ thị ta thấy M S=80 emu/g, từ độ bão hịa mẫu khối 90 emu/g, thấy từ độ bão hịa hạt nano từ tính Fe 3O4 tương đối cao, nhiên thấp giá trị từ độ bão hòa mẫu khối Các công nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học): Phương pháp dựa phản ứng thủy phân muối FeSO để tạo hạt nano sắt từ Quy trình thực tiến hành theo bước cụ thể sau Sau rửa dụng cụ thí nghiệm dung dịch muối FeSO pha chế cách cho 17,71 g muối FeSO4 hòa với 200 ml nước cất, tương tự 10,11 KNO hòa vào 100 ml nước cất, 13,81 g KOH pha với 50 ml nước cất, ba dung dịch pha chế ba cốc thí nghiệm khác nhau, sau pha xong dung dịch lọc giấy lọc định lượng trước đưa vào tiến hành thí nghiệm Các dung dịch chuẩn bị đổ vào bình thủy tinh 1L theo thứ tự khuấy máy khuấy từ gia nhiệt Hỗn hợp phản ứng gia nhiệt tới 90oC giữ vòng 2h, tồn thí nghiệm tiến hành mơi trường khí nitơ Sau 2h, khí nitơ tắt bình thủy tinh chứa hỗn hợp sau phản ứng đưa khỏi máy khuấy từ để nhiệt độ phòng Tiếp theo, hỗn hợp rửa lần nước cất (2L), lần với axit nitric 1M (1L), cuối rửa với lần với nước cất (2L) Phần chất rắn màu đen tách xuống cách sử dụng miếng nam châm, sau loại bỏ phần dung dịch trên, tiếp tục trình rửa nước cất thấy cần thiết dung dịch phía trở nên Cuối cùng, tồn sản phẩm giữ 1L nước, thơng thường phương pháp cho ta 10 g sản phẩm Theo phân tích hạt tạo Fe 3O4 với kích thước lớn so với phương pháp đồng kết tủa hạt nano Fe 3O4 sau tạo thành dễ bị kết đám lại với sau thời gian ngắn Ứng dụng hạt nano xít sắt(Fe3O4) từ tính 3.1 Ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 đánh dấu tách chiết tế bào: 3.1.1 Chức hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4: Để ứng dụng sinh học, hạt nano cần phải chức hóa bề mặt để gắn kết với đối tượng sinh học DNA, kháng thể, enzyme Các nhóm chức thường gặp nhóm amino, biotin, steptavidin, cacbonxyl, thiol Để có nhóm chức bề mặt hạt nano, người ta sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo môt lớp polymer bề mặt hạt nano Organosilane phân tử có hai nhóm chức có cơng thức tổng qt là: X(CH2)n-SiRn(OR’)3-n Trong X nhóm chức cần thiết để gắn kết với đối tượng sinh học, (CH2)n nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm dày hay mỏng SiRn nhóm liên kết với nhóm hydroxyl bề mặt hạt nano Alkoxysilane với nhiều nhóm chức X khác thương mại hóa Trong ứng dụng sinh học nhóm chức amino sử dụng nhiều Trong q trình chức hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy hai phản ứng đồng thời, q trình thủy phân nhóm silane alkoxy n thành nhóm silanol hoạt tính q trình hóa rắn silanol với nhóm OH tự bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo liên kết Si-O-Si bền vững Trong q trình tiến hành chức hóa bề mặt điều kiện mơi trường phản ứng có ảnh hưởng nhiều đến q trình chức hóa bề mặt Ví dụ cồn thường làm gia tăng q trình thủy phân động học hóa rắn làm tăng cường q trình chức hóa bề mặt, nhiên cồn cạnh tranh với nhóm silane bề mặt liên kết hydro Trong nghiên cứu sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane (APTS, n=2) để tạo nhóm chức amino bề mặt hạt nano Quy trình chức hóa bề mặt gồm bước sau: Lấy 400 mg hạt nano từ tính cho vào 100 ml nước cất hai lần Dùng máy siêu âm để phân tán hạt dụng dịch để thể huyền phù ổn định Nhỏ ml dung dịch APTS vào dung dịch huyền phù nói dùng máy khuấy từ để khuấy vòng cho q trình chức hóa bề mặt xảy hồn tồn Kết thúc q trình ta thu sản phẩm, đem lọc rửa lần lần nước cất lọc từ thu hạt nano từ tính Fe3O4 có bề mặt nhóm amino Lúc hạt ta gắn hạt nano với kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang không phát huỳnh quang tế bào bạch cầu T Kháng thể anCD4 kháng thể có khả đối ứng với kháng nguyên CD4 bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T, nhờ khả phát huỳnh quang kháng thể giúp cho việc đếm tế bào bạch cầu dễ dàng với độ xác cao Hình 3: Chức hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 nhóm amino sử dụng APTS (Hạt nano sau chức hóa bề mặt gọi tắt Amino-NP) Nguyên tắc phép xác định dùng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) cho phản ứng với hạt nano Fe3O4 có nhóm chức NH2 bề mặt, sau đo dung dịch sau phản ứng phép đo phổ hấp thụ (UV Vis), phép đo xác định số lượng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) dung dịch, từ xác định số nhóm amino bề mặt hạt nano Trong cấu tạo phân tử 4Nitrobenzaldehyde có tồn cấu trúc vịng benzen cạnh, đo phổ hấp thụ UV-Vis cho đỉnh hấp thụ tương ứng với nồng độ khác Phổ hấp thụ cho thấy bước sóng 270 nm có đỉnh hấp thụ hình 3: sample 30 microgram/ml sample 27 microgram/ml sample 24 microgram/ml sample 18 microgram/ml sample 15 microgram/ml sample 12 microgram/ml 2.5 Intensity 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 150 200 250 300 350 400 -1 wave number (cm ) Hình 4: Phổ hấp thụ dung dịch chứa 4-Nitrobenzaldehyde với nồng độ khác Sau tiến hành đo phổ hấp thụ xong xây dựng đường miêu tả phụ thuộc nồng độ 4-Nitrobenzaldehyde có dung dịch với cường độ phổ hấp thụ đem so sánh với đường chuẩn 4-Nitrobenzaldehyde với nồng độ tương ứng Hình đồ thị miêu tả so sánh 3.1.2 Đánh dấu tế bào tách chiết tế bào 3.1.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe3O4 với kháng thể antiCD4 Q trình gắn với kháng thể antiCD4 thực sau: Lấy 0,4g hạt nano từ tính chức hóa bề mặt nhóm amino sử dụng APTS (amino-NP) đem rửa tách từ hai lần 1ml dung dịch đệm 2-(NMorpholino) ethanesulfonic acid (MES) có pH nồng độ 0,1M Sau amino-NP phân tán 0,25 ml dung dịch đệm chứa MES 2mg 1-ethyl3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) dạng bột cách khuấy nhiệt độ phòng vòng 15 phút Tách rửa từ trường hai lần trước nhỏ µg–100 µg kháng thể đơn dòng antiCD4 (antiCD4, Invitrogen) Tách rửa từ bốn lần nước cất ta thu hạt nano gắn kháng thể antiCD4, gọi tắt antiCD4-NP Trong số mẫu, chúng tơi có sử dụng 20 µl kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang (gọi tắt *antiCD4, bước sóng kích thích 480 nm, bước sóng phát xạ 520 nm hãng Exiobio) trộn với antiCD4 có nồng độ khác Sau hai hạt nano bọc kháng đơn dòng antiCD4 *antiCD4 tách rửa từ lần 1ml dung dịch đệm phosphate saline (PBS) Kết cuối ta thu hạt nano từ bọc loại kháng thể đơn dòng antiCD4: loại thường (gọi tắt antiCD4-NP) loại phát huỳnh quang (gọi tắt *antiCD4-NP) chúng bảo quản PBS bổ sung thêm albumin huyết bị (BSA) Hình 5: Quy trình gắn kết hạt nano chức hóa với kháng thể antiCD4 Phản ứng (A) Hạt nano từ tính chức hóa EDC Phản ứng (B) Gắn kết kháng thể antiCD4 với hạt nano từ tính bao phủ EDC 3.1.2.2 Gắn kết với tế bào bạch cầu: Lấy 200 µl máu người bình thường li tâm ống nghiệm Eppendorf 1,5 ml với tốc độ 1000 vòng / phút vòng 10 phút để loại bỏ huyết hịa vào 200 µl PBS bổ sung 1% BSA Sau ủ với 0,2 mg antiCD4-NP *antiCD4-NP vòng 20 phút nhiệt độ phòng Bổ sung 1,3 ml dung dịch đệm nhược trương (5 mM Tris pH 7.0, 10% glycerol) để đột ngột phá tung màng tế bào máu làm tế bào trở thành dạng ko có bào quan bào tương hay gọi tế bào ma Lúc antiCD4-NP *antiCD4-NP gắn đặc hiệu lên tế bào bạch cầu CD4+ T thông qua tương tác kháng nguyên -kháng thể tách lọc từ trường, giúp loại bớt tế bào ma Trong thí nghiệm tiến hành để đối chứng, chúng tơi tiến hành gắn trực tiếp 20 µl kháng thể đơn dịng antiCD4 phát huỳnh quang với 200 µl máu để nhuộm tế bào bạch cầu CD4 + T, trình xử lí tiến hành tương tự khác khơng có tuyển từ Các tế bào sau phản ứng gắn đặc hiệu với kháng thể bảo quản 50 µl PBS lạnh, bổ sung 1% ABS 10% glycerol µl dung dịch chứa tế bào nhỏ lên kính (slide glass) phủ lên phiến kính mỏng (cover glass) để tiến hành quan sát kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss Axio Cường độ phát huỳnh quang xử lý phần mềm Scion Image Một số hình ảnh tế bào chụp từ kính hiển vi huỳnh quang Hình ảnh chụp tế bào máu từ kính hiển vi ánh sáng thường (6A, 6C) chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích 480nm ánh sáng huỳnh quang 520nm (6B, 6D) Đối với mẫu chụp hình 3.8 chưa tuyển từ nên ánh sáng thường (6A, 6C) nhìn thấy tế bào hồng cầu nhiều loại tế bào bạch cầu Có thể nhận biết loại tế bào dựa vào hình dạng chúng Khi chụp chế độ phát huỳnh quang (6B, 6D) quan sát thấy tế bào bạch cầu CD4 + T mà không quan sát thấy tế bào hồng cầu tế bào bạch cầu dạng khác Lý kháng thể đơn dịng antiCD4 phát huỳnh quang đặc hiệu, gắn với kháng nguyên CD4 bề mặt tế bào bạch cầu CD4+ T làm cho tế bào phát sáng 10 Hình 6: Hình ảnh tế bào bạch cầu CD4+ T riêng lẻ chụp kính hiển vi ánh sáng thường (A, C ) ánh sáng kích thích (480 nm) (B, D) sau chúng gắn kết với kháng thể đơn dòng phát huỳnh quang antiCD4.Mũi tên tế bào bạch cầu CD4+ T Còn hình hình ảnh tế bào bạch cầu CD4 + T chụp kính hiển vi ánh sáng thường (7A, 7C) chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích 480nm (7B, 7D) khác so với mẫu hình tế bào được gắn kết với hạt nano từ tính chức hóa bề mặt kháng thể phát huỳnh quang antiCD4 (*antiCD4-NP) tuyển từ Khơng giống hình hình khơng thấy xuất nhiều tế bào hồng 11 cầu hay tế bào bạch cầu loại khác Hơn tín hiệu thu chế độ ảnh chụp huỳnh quang (7B, 7D) cho thấy cường độ phát huỳnh quang tế bào bạch cầu CD4+ T mạnh cường độ phát huỳnh quang tế bào gắn kết với kháng thể huỳnh quang mà khơng có hạt nano Hình 7: Hình ảnh tế bào bạch cầu CD4+ T chụp kính hiển vi ánh sáng thường (A, C) ánh sáng kích thích (480nm) (B, D) sau 12 gắn kết với hạt nano chức hóa bề mặt kháng thể antiCD4 phát huỳnh quang Mũi tên tế bào bạch cầu CD4+ T 13 ... số tính chất hạt nano từ tính Fe3O4 : 1.1 Kết đo phổ nhiễu xạ tia X mẫu Fe3O4 1.2 Ảnh TEM mẫu hạt nano từ tính Fe3O4: 2 Các cơng nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học): ... phương pháp hóa học): Ứng dụng hạt nano xít sắt( Fe3O4) từ tính .4 3.1 Ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 đánh dấu tách chiết tế bào: 3.1.1 Chức hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4: 3.1.2... cao, nhiên thấp giá trị từ độ bão hòa mẫu khối Các công nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học): Phương pháp dựa phản ứng thủy phân muối FeSO để tạo hạt nano sắt từ Quy trình thực tiến hành