Đang tải... (xem toàn văn)
Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea brasliensis Muell. Arg) bằng phương pháp RFLP - PCR
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2001 – 2005 SINH VIÊN THỰC HIỆN: VŨ THỊ QUỲNH CHI Thành phố Hồ Chí Minh -2005- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Hội đồng hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN ThS PHAN THÀNH DŨNG VŨ THỊ QUỲNH CHI Thành phố Hồ Chí Minh -2005- LỜI CẢM TẠ Chân thành cảm ơn: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học trường Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực tập hồn thành tốt khóa luận tốt nghiệp PGS.TS Bùi Cách Tuyến ThS Phan Thành Dũng – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam – tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận TS Bùi Minh Trí TS Đinh Duy Kháng có dẫn, động viên giúp tơi thực tốt khóa luận KS Nguyễn Ngọc Mai cô chú, anh chị cán công nhân viên Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật/Viện Nghiên Cứu Cao Su nhiệt tình giúp đỡ hướng dẫn suốt thời gian thực tập Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam Chị Huỳnh Kim Hưng anh chị trực thuộc Trung Tâm Phân Tích – Thí Nghiệm Hóa Sinh Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh hướng dẫn chia sẻ tơi khó khăn thời gian thực khóa luận Các bạn bè thân u lớp Cơng Nghệ Sinh Học 27 giúp đỡ chia sẻ vui buồn suốt năm học thời gian thực tập tốt nghiệp Và Con xin thành kính ghi ơn Cha Mẹ sinh thành, dưỡng dục nên người, để Con ngày hôm iii TÓM TẮT VŨ THỊ QUỲNH CHI Đại học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2005 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Hướng dẫn khoa học: PGS.TS BÙI CÁCH TUYẾN ThS PHAN THÀNH DŨNG Bệnh rụng Corynespora cao su bệnh nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây có tác hại lớn đến kinh tế nhiều nước, đặc biệt nước sản xuất cao su thiên nhiên Triệu chứng biểu bệnh biến thiên dễ nhầm lẫn với bệnh khác Do tìm hiểu phương pháp chẩn đoán, phát nhanh bệnh Corynespora cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước bệnh lây lan Những nghiên cứu giới cho thấy, nấm C cassiicola có phân hóa lồi, C cassiicola dịng vơ tính cao su khác có khác biệt di truyền, nhờ nhận biết C cassiicola qua khả gây bệnh cho dịng vơ tính cao su khác Việc nghiên cứu đa dạng di truyền nấm C cassiicola cao su nước ta việc làm cần thiết nhằm tìm hiểu mối quan hệ đa dạng di truyền C cassiicola với tính kháng số dịng vơ tính cao su trồng Việt Nam Kết đạt được: Nhận diện triệu chứng đặc trưng bệnh rụng Corynespora cao su Thu thập mẫu bệnh 32 dịng vơ tính cao su khác nhau, tiến hành quy trình chẩn đốn phân tích đa hình vùng ITS nấm C cassiicola phương pháp RFLP – PCR dịng vơ tính Qua phân tích chúng tơi đến kết luận: Quy trình phản ứng PCR nấm C cassiicola Silva cộng (1998) sử dụng để nghiên cứu vùng ITS nấm C cassiicola Việt Nam Chẩn đoán bệnh Corynespora cách nhận diện sản phẩm khuếch đại vùng ITS sử dụng cặp primer ITS A ITS B không hiệu quả, sản phẩm thu nhận khơng đặc trưng cho nấm C cassiicola iv Khơng tìm thấy đa hình vùng ITS mẫu nấm nghiên cứu sử dụng phương pháp RFLP – PCR với enzyme cắt giới hạn EcoRI, CfoI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI Các mẫu nấm dùng phân tích thuộc chủng nấm C cassiicola chủng gây bệnh cao su Việt Nam v MỤC LỤC PHẦN TRANG Trang tựa Lời cảm tạ i Tóm tắt ii Mục lục iii Danh sách chữ viết tắt vi Danh sách hình vii Danh sách bảng vii MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 2.2 Sơ lược nấm C cassiicola (Berk & Curt.) Wei 2.2.1 Lịch sử phát 2.2.2 Phạm vi phân bố 2.2.3 Phạm vi ký chủ khả gây bệnh 2.2.4 Đặc tính sinh học C cassiicola 2.3 Nấm C cassiicola (Berk & Curt.) Wei cao su Hevea brasiliensis Muell Arg 2.3.1 Sự xuất nấm C cassiicola (Berk & Curt.) Wei cao su Hevea brasiliensis 2.3.2 Tình hình bệnh C cassiicola gây cao su số nước trồng cao su 2.3.3 Đặc tính sinh học nấm C cassiicola cao su 2.4 Triệu chứng bệnh cao su bị nhiễm bệnh C cassiicola vi 2.5 Kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) 10 2.5.1 Nguyên tắc phản ứng PCR 10 2.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR 12 2.6 Enzyme cắt giới hạn (restriction endonuclease – RE) 14 2.6.1 Giới thiệu 16 2.6.2 Định danh enzyme 15 2.6.3 Trình tự nhận biết enzyme cắt giới hạn 16 2.6.4 Sử dụng enzyme cắt giới hạn phân tích DNA 16 2.6.5 Phân tích kết phản ứng cắt RE 18 2.6.6 Bản đồ giới hạn 19 2.7 Vùng ITS vai trò phân tích đa dạng di truyền 19 2.8 Những nghiên cứu C cassiicola nước 21 2.8.1 Những nghiên cứu C cassiicola nước 21 2.8.2 Những nghiên cứu C cassiicola nước 23 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 24 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 24 3.1.1 Thời gian 24 3.1.2 Địa điểm 24 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu 24 3.2 Nội dung nghiên cứu 24 3.2.1 Phân lập nấm nguồn nấm C cassiicola 24 3.2.1.1 Hóa chất dụng cụ 24 3.2.1.2 Phương pháp lấy mẫu 25 3.2.1.3 Phương pháp phân lập 25 3.2.2 Khuếch đại vùng ITS kỹ thuật PCR 26 3.2.2.1 Chuẩn bị DNA khuôn mẫu cho phản ứng PCR 26 3.2.2.2 Thực phản ứng PCR 28 3.2.2.3 Đọc kết phản ứng PCR 30 3.2.3 Phân tích sản phẩm PCR enzyme cắt giới hạn (RE) 30 vii 3.2.3.1 Hóa chất dụng cụ 31 3.2.3.2 Thành phần hóa chất phản ứng RFLP 31 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 4.1 Về tác nhân gây bệnh rụng Corynespora 32 4.2 Kết ly trích DNA nấm C cassiicola 37 4.3 Kết PCR vùng ITS nấm C cassiicola 37 4.4 Kết phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1 Kết luận 46 5.2 Đề nghị 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 PHỤ LỤC 52 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT PCR: Polymerase Chain Reaction RE: Restriction endonuclease PDA: Potato Dextrose Agar PSA: Potato Saccharose Agar EtBr: Ethidium Bromide TE: Tris EDTA TAE: Tris Glacial Acetic Acid EDTA RFLP: Restriction Fragments Length Polymorphism ITS: Internal Transcribed Spacer RAPD: Random Amplified Polymorphism DNA Bp: base pairs rRNA: ribosomal RNA dvt: dịng vơ tính BVTV: bảo vệ thực vật VNCCSCN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam ix DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1: Một vài RE vị trí phân cắt 15 Bảng 2.2: Liệt kê RE xếp thứ tự theo chất vị trí cắt 17 Bảng 2.3: Trình tự số primer trình tự dùng nghiên cứu vùng ITS nấm 21 Bảng 1: Thành phần hóa chất phản ứng PCR 29 Bảng 3.2: Thành phần hóa chất phản ứng RFLP 31 Bảng 4.1: Các dịng vơ tính cao su lấy mẫu đặc điểm triệu chứng bệnh (đặc trưng/ không đặc trưng) 33 Bảng 4.2: Một số dịng vơ tính cao su phân lập nấm C cassiicola 36 x 41 phẩm phụ, phản ứng có nhiều chu kỳ Trong điều kiện cho phép thay đổi lượng primer sử dụng thu nhận sản phẩm PCR đặc hiệu hình 4.8 Tuy nhiên, ngồi yếu tố primer kiểm tra yếu tố khác có ảnh hưởng đến khuếch đại đoạn DNA vùng ITS nấm C cassiicola Kết cho thấy yếu tố khác không tạo ảnh hưởng đáng kể lên sản phẩm PCR tạo thành không đưa thảo luận Hình 4.8: Sản phẩm PCR thu nhận đƣợc sau giảm lƣợng primer dùng phản ứng PCR L1: MT/C/5 L5: LH 83/152 L2: RRIV L6: LH 82/008 L3: RRIV4 L7: LH 83/152 L4: AC 88 Sản phẩm PCR mẫu phân lập kiểm tra kích thước so sánh với đối chứng dương khác (sử dụng quy trình tương tự để khuếch đại vùng ITS nấm Beauveria bassiana Metarhizum anisopliae) (hình 4.9) Qua hình 4.9, chúng tơi nhận thấy, phản ứng PCR với cặp primer ITS A ITS B có khả khuếch đại vùng ITS nấm Beauveria bassiana Metarhizum anisopliae Điều hợp lý cặp primer thiết kế cho vùng bảo tồn ITS, hầu hết nấm có vùng Theo chúng tôi, sử dụng kỹ thuật để chẩn đoán bệnh rụng Corynespora nấm C cassiicola gây dựa sản phẩm khuếch đại vùng ITS 1, ITS cặp primer ITS A ITS B khơng hiệu quả, sản phẩm PCR thu có kích 42 thước giống (540 bp) lồi nấm khác, điều khơng cho phép nhận dạng nấm C cassiicola dựa sản phẩm khuếch đại vùng ITS1, ITS2 540 bp 500 bp Hình 4.9: Kiểm tra kích thƣớc sản phẩm PCR nấm C cassiicola so sánh với sản phẩm PCR nấm Beauveria bassiana Metarhizum anisopliae L1: DNA ladder L7: LH 82/152 L2: MT/C/5 L8: LH 82/008 L3: RRIV2 L9: Beauveria bassiana L4: RRIV4 L10: Metarhizum anisopliae L5: AC 88 L11: Đối chứng âm L6: RO/CM/10 Ghi chú: Hai nguồn nấm Beauveria bassiana Metarhizum anisopliae Bộ môn BVTV – Khoa Nông Học, Đại học Nông Lâm TP.HCM cung cấp Kết cho thấy cần phải tìm vị trí khác DNA hệ gen đặc trưng cho C cassiicola, để việc chẩn đốn bệnh C cassiicola gây nhanh chóng xác Việc nghiên cứu gen mã hóa cho protein độc tố cassiicoline giúp giải vấn đề Đây hướng nhiều phịng thí nghiệm lựa chọn tương lai 4.4 Phân tích đa dạng vùng ITS nấm C cassiicola RFLP kỹ thuật ứng dụng rộng rãi phân tích đa dạng di truyền Trong kỹ thuật chủ yếu ứng dụng enzyme cắt giới hạn nhằm phân cắt đoạn DNA hệ gen sinh vật Nếu hai sinh vật có giống mặt di truyền phân cắt RE tạo thành đoạn DNA có kích thước giống nhau, số đoạn DNA tạo thành giống Phương pháp RFLP 43 nguyên đòi hỏi phải trải qua giai đoạn Southern blot Do vậy, phân tích đa dạng di truyền lồi nấm, đặc biệt phân tích đa dạng di truyền loài, phương pháp RFLP – PCR ứng dụng phổ biến Kỹ thuật có nghĩa sử dụng RE để phân cắt sản phẩm PCR đoạn gen hay đoạn DNA đó, khơng trải qua giai đoạn southern blot Sau phân cắt RE, sản phẩm phân tích cách điện di gel để xem xét có hay khơng có đa hình kích thước đoạn DNA tạo thành Kỹ thuật đơn giản kỹ thuật RFLP thông thường Hiện nay, RFLP – PCR ứng dụng nhiều phân loại, phân loại mức độ loài (đã ứng dụng thành công nấm Verticilium, Rhizoctonia Fusarium) (Bridge P.D Arora D.K., 2000) Do sản phẩm PCR tương đối đặc hiệu nên sử dụng trực tiếp vào phân tích RFLP mà khơng cần phải tinh Sản phẩm PCR nấm C cassiicola phân cắt riêng rẽ enzyme cắt giới hạn CfoI, EcoRI, MspI, HaeIII, RsaI, Sau3AI Sản phẩm tạo thành phân tích cách điện di gel agarose Chúng tơi nhận thấy enzyme tạo sản phẩm giống tất mẫu khảo sát (hình 4.10, hình 4.11, hình 4.12, hình 4.13, hình 4.14, hình 4.15) 300 bp 200 bp Hình 4.10: Phân cắt sản phẩm PCR enzyme EcoRI L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L5: AC 88 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 44 Sản phẩm PCR cắt khơng hồn tồn 400 bp 100 bp Hình 4.11: Phân cắt sản phẩm PCR enzyme MspI Ghi chú: L1: DNA ladder L5: AC 88 L2: MT/C/5 L6: RO/CM/10 L3: RRIV2 L7: LH 82/152 L4: RRIV4 L8: LH 82/008 300 bp 100 bp Hình 4.12: Phân cắt sản phẩm PCR enzyme CfoI Ghi L1: DNA ladder L5: AC 88 L2: MT/C/5 L6: RO/CM/10 L3: RRIV2 L7: LH 82/152 L4: RRIV4 L8: LH 82/008 45 400 bp 100 bp Hình 4.13: Phân cắt sản phẩm PCR enzyme RsaI Ghi chú: L5: AC 88 L1: DNA ladder L2: MT/C/5 L3: RRIV2 L4: RRIV4 L6: RO/CM/10 L7: LH 82/152 L8: LH 82/008 L9: sản phẩm PCR trƣớc cắt 400 bp 100 bp Hình 4.14: Phân cắt sản phẩm PCR enzyme HaeIII L1: DNA ladder L5: AC 88 L2: MT/C/5 L6: RO/CM/10 L3: RRIV2 L7: LH 82/152 L4: RRIV4 L8: LH 82/008 300 bp 100 bp Hình 4.15: Phân cắt sản phẩm PCR enzyme Sau3AI Ghi chú: L5: AC 88 L1: DNA ladder L6: RO/CM/10 L2: MT/C/5 L7: LH 82/152 L3: RRIV2 L8: LH 82/008 L4: RRIV4 L9: Sản phẩm PCR chƣa cắt Kết nghiên cứu cho thấy, cắt enzyme EcoRI, thu hai đoạn DNA có kích thước khoảng 240 bp 300 bp Sự phân cắt enzyme HaeIII tạo thành hai đoạn DNA có kích thước khoảng 390 bp 160 bp Những kết phù hợp với nghiên cứu trước Silva cộng (1998), Safiah cộng (2003) Sự phân cắt RE điện di gel agarose cho phép ước lượng kích thước đoạn DNA tạo thành dựa vào thang DNA chuẩn Tuy nhiên, so sánh kết mà thu nhận cắt sản phẩm PCR enzyme khác với kết nghiên cứu trước giới khơng có số liệu nghiên cứu mức độ phân tử nấm C cassiicola chưa nhiều Trong thí nghiệm chúng tơi, hầu hết RE sử dụng tìm thấy vị trí cắt ngoại trừ enzyme CfoI có đến vị trí cắt khác Kết điện di cho thấy, cắt CfoI thu nhận đoạn DNA, đoạn có kích thước khoảng 300 bp, đoạn có kích thước khoảng 100 bp Điều có nghĩa ngồi đoạn DNA cịn có đoạn DNA khác khơng thể quan sát được, nguyên nhân sau: lượng DNA ít, nhuộm ethidium bromide không cho phép nhận biết có mặt đoạn DNA Ngồi enzyme CfoI, phân cắt enzyme Sau3AI, đoạn DNA vừa tạo thành có tổng kích thước khơng kích thước sản phẩm PCR, điều giải thích tương tự trường hợp xảy với enzyme CfoI Mặc dù mẫu phân tích có biểu triệu chứng khác cao su, phân tích đa hình vùng ITS enzyme cắt giới hạn không nhận thấy khác biệt vị trí cắt enzyme sử dụng Các mẫu thu nhận khu vực khác cho kết giống phân cắt enzyme cắt giới hạn Tuy nhiên, số lượng mẫu phân tích cịn nên chưa thể đánh giá có hay khơng có đa dạng di truyền quần thể nấm C cassiicola dvt cao su Việt Nam Mặt khác, mẫu có khác biệt trình tự nucleotide, khác biệt khơng xảy vị trí cắt enzyme cắt, phân tích enzyme cắt không phát sai khác Kết phân tích vùng ITS RE khơng phát khác biệt Các mẫu nấm mà chúng tơi phân tích thuộc chủng nấm C cassiicola chủng nấm C cassiicola gây bệnh cao su Việt Nam Tuy nhiên, để đến kết luận xác cần phải nghiên cứu số lượng lớn mẫu nấm C cassiicola PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Bệnh rụng Corynespora cao su có biểu triệu chứng bệnh khác nhau, mức độ bệnh tùy theo tính mẫn cảm dvt cao su khác Việc làm cho việc kiểm sốt tình hình bệnh trở nên khó khăn Việc nghiên cứu tác nhân gây bệnh C cassiicola phần giúp cho chiến lược quản lý tình hình bệnh trở nên dễ dàng Qua nghiên cứu số mẫu bệnh tác nhân C cassiicola gây đưa số kết luận sau Quy trình thực phản ứng PCR nhằm khuếch đại vùng ITS nấm C cassiicola ứng dụng nhiều phịng thí nghiệm giới sử dụng để nghiên cứu nấm C cassiicola Việt Nam Việc ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán bệnh rụng Corynespora cao su với cặp primer ITS A ITS B không hiệu kích thước đoạn DNA khuếch đại không đặc hiệu so với nấm khác Phân tích sản phẩm khuếch đại vùng ITS mẫu nấm dvt cao su khác nhau, có triệu chứng bệnh khác enzyme cắt giới hạn không nhận thấy khác biệt kích thước đoạn DNA tạo thành Các mẫu nấm giống phân tích RFLP sản phẩm PCR vùng ITS Các mẫu nấm nghiên cứu thuộc chủng chủng C cassiicola gây bệnh cho cao su Việt Nam 5.2 Đề nghị Những dvt cao su lai tạo Việt Nam biểu mức độ bệnh khác (Nguyễn Ngọc Mai, 2005) Những nghiên cứu khác giới cho thấy dịng nấm C cassiicola cao su có phân hóa di truyền (Safia cộng sự, 2003 ) Do vậy, đưa số đề xuất sau Tăng số lượng mẫu kiểm tra để kết phân tích mang tính khái qt Cần có nghiên cứu cụ thể đặc điểm sinh trưởng, phát triển tính độc nấm C cassiicola cao su kết hợp với ứng dụng kỹ thuật RAPD – PCR để nghiên cứu đa dạng di truyền nấm C cassiicola cao su Việt Nam, đồng thời xác định mối quan hệ tính kháng dvt cao su lai tạo nước với khác biệt di truyền nấm C cassiicola Điều có lợi cho cơng tác tạo giống kháng công tác quản lý bệnh Tiến tới giải trình tự vùng ITS để xác định mức độ biến dị vùng ITS nấm C cassiicola Việt Nam so với dòng nấm C cassiicola khác giải trình tự giới, xác định vị trí phân loại C cassiicola Việt Nam phân loại nấm C cassiicola Để hướng tới tạo giống cao su kháng bệnh rụng Corynespora cần nghiên cứu đa hình gen kháng C cassiicola cao su, việc giúp chọn nhanh dvt có khả kháng C cassiicola sở để thực lai tạo dvt có khả kháng bệnh PHẦN VI TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bùi Chí Bửu – Nguyễn Thị Lang, 1999 Di truyền phân tử Quyển II, Những nguyên tắc chọn giống trồng NXB Nông nghiệp 45-60 Cục Bảo Vệ Thực Vật 2000 Báo cáo đề tài: Điều tra phân bố mức độ phổ biến nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei cao su số trồng khác số vùng trọng điểm miền Bắc Việt Nam Phan Thành Dũng, 2004 Kỹ thuật bảo vệ thực vật cao su Nhà xuất Nông Nghiệp.124 trang Hồ Huỳnh Thùy Dương 2000 Sinh học phân tử Nhà xuất Đại Học Quốc Gia Trần Văn Lợt Giáo trình cơng nghiệp Học phần Cây Cao Su Tài liệu học tập, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 2005 70 trang Nguyễn Ngọc Mai Điều tra đánh giá tính kháng bệnh rụng Corynespora số dvt cao su lai tạo nước LVTN Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 2005 Tổng Công Ty Cao Su Việt Nam 2004 Báo cáo tổng kết hoạt động kinh doanh năm 2003 Đặng Văn Vinh 2000 Một trăm năm cao su Việt Nam Nhà xuất Nông Nghiệp TP HCM 11-38 Tài liệu tiếng nƣớc Begho, E.R.,2000 The status of Corynespora leaf spot disease of Para Rubber in Nigeria: Preliminary investigations Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 10 Bridge, P D., Arora D.K., Reddy C.A and Elander R.P., 1998 Application of PCR in mycology CABI publishing UK - 21 11 Brown, T.A.,1997 Chapter 4: Manipulation of purified DNA Gene cloning an introduction Third edition Published by Chapman and Hall London, UK 12 Chee, K.H., 1987 Corynespora leaf spot Rubber Research Institute of Malaysia Planters’ Bulletin, No 194: – 13 Desmond S.T, Nicholl, 1994 An introduction to genetic engineering Cambridge University Press 166p 14 Dũng, P.T and Hoan, N.T., 2000 Current status of corynespora leaf fall in Vietnam Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 15 Dũng, P.T., 1995 Studies on C cassiicola (Berk & Curt.) Wei on rubber Masters’ thesis University Pertanian Malaysia 16 Ellis, M.B and Holiday, 1971 Corynespora cassiicola C.M.I Description of Pathogenic Fungi and Bacteria No 303 1-2 17 Ismail, H., N.Z Radzia and K Silvadadyan, 1996 Management stragies of Corynespora leaf fall with fungicides and cultural practices Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 18 Jayashinge, C.K and W.P.K, Silva and Wettasinghe D S., 2000 Corynespora cassiicola: a fungal pathogen with diverse symptoms on Hevea rubber Bulletin of the Rubber Research Institute of Sri Lanka 39, 1-5 19 Jayashinge, C.K and W.P.K, Silva.1996 Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 20 Jayashinge, C.K 2000 Current status of Corynespora leaf fall in Sri Lanka Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 21 Jayasinghe, C.K., 1997 Leaf fall disease: a threat to world NR industry Rubber Asia 55 - 56 22 Kurt Weising, Hilde Nybom, Kirsten Wolff, Wieland Meyer, 1995 DNA fingerprinting in plants and fungi CRC Press 322p 23 Liyanage, AdeS, Jayasinghe, C.K., Liyanage, N.S.I and Jayaratne, R., 1986 Corynespora leaf spot disease of (Hevea brasiliensis): a new record Journal of rubber research institute of Sri Lanka 65 47 - 50 24 McPherson M.J., Moller S.G., 2001 PCR BIOS Scientific Publisher Limited, UK 276p 25 Narisa Chanruang, 2000 Current status of Corynespora leaf fall in Thailand Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 50 26 Sabu, P.I., 2000 Current status of Corynespora leaf fall in India Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 27 Safiah A and Noor H.H., 2003 Differentiating races of C cassiicola using RAPD and ITS markers Journal of Rubber Research 6(1) 59 – 64 28 Shukhor S.K and Hidir S.M., 1996 Current status of Corynespora leaf fall in Malaysia Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 29 Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1995 RFLP and RAPD analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus C cassiicola Aust J Bot., 43, 609 – 618 30 Silva, W.P.K, Deverall, B.J & Lyon, B.R., 1998 Molecular, physiological and pathological characterization of Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka Plant pathology, 47 (3), 267-277 31 Silva, W.P.K, Eric H Karunanayake, Ravi L.C Wijesundera and Uhanowita M.S Priyanka., 2003 Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence Mycol Res 2003 May;107(Pt 5):567-71 32 Sinulinga W., Suwanto and Soepena H., 1996 Current status of Corynespora leaf fall in Indonesia Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Medan, Indonesia 16 – 17, Dec, 1996 33 Sujanto and Irwan Suhendry., 2000 Corynespora leaf fall disease on Hevea rubber in Indonesia.Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur, Malaysia and Medan, Indonesia, – 15, June, 2000 34 Tan A.M, Loo T.P, Gangadara Vadivel, Mohd Rosli Bachik and K.F Yoon, 1992 Survey of Corynespora leaf disease of rubber in Peninsular Malaysia Planters' Bulletin Rubber Research of Malaysia No 211 51- 62 35 Tan A.M 1990 Survey on Corynespora leaf fall disease Planters’ Bulletin Rubber Research of Malaysia No.194 55 – 60 36 The International Natural Rubber Organization, 1999 Improvement of management strategy in combating Corynespora leaf fall disease (CLFD) in Hevea brasiliensis Tài liệu internet 37 http://www.cmb.ac.lk/ibmbb/curactplmolsci.html 38 http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm Conserved primer sequences for PCR amplification and sequencing from nuclear ribosomal RNA 39 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Database: Corynespora cassiicola 40 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&li st_uids=12884953&dopt=Abstract Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation between host and virulence 41 http://www.irrdb.com/ Annual report 42 http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/ 5,8S Primer Map 43 http://www.bioinfo.unice.fr/ressources/sms2/primer_Map Primer Map PHỤ LỤC CÁCH THỨC PHA MỘT SỐ HÓA CHẤT CẦN THIẾT Pha lysis buffer Lysis buffer có thành phần cụ thể sau: Tris HCl 50mM, EDTA 50mM, SDS 3%, - mercaptoethanol 1% - Cho vào becher thể tích nước siêu gần với thể tích dung dich buffer mong muốn - Lần lượt cho thành phần khác: Tris HCl, EDTA SDS vào dung dịch với lượng cho đảm bảo nồng độ cuối mong muốn - Khuấy cho hỗn hợp hịa tan, sau cho - mercaptoethanol vào - Khuấy chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH Nếu sau chuẩn độ thể tích cuối chưa đạt mong muốn cần thêm nước siêu vào cho đạt thể tích mong muốn Pha Phenol - Hòa tan 100g phenol (tinh thể) đặt bồn ủ nhiệt 650C (phải bịt kín dụng cụ đựng phenol hịa tan) - Sau phenol tan hoàn toàn, thêm vào 100ml dung dịch Tris bazơ 0.5 M, pH8 - Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng hỗn hợp tách thành hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên cách cẩn thận Lưu ý thao tác nên thực tủ hood phải giữ phenol tối để tránh oxy hóa nguy hiểm đến sức khỏe - Tiếp tục cho vào 100ml dung dịch Tris HCl 0.5 M, pH - Khuấy từ 10 phút, để yên nhiệt độ phòng dung dịch tách làm hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên - Lập lại chu kỳ lần Sau phủ lên dung dịch phenol thu lớp TE 1X (50ml) -Lưu ý phải bảo quản dung dịch phenol tối (dùng bình đựng có màu tối bịt kín bình giấy bạc) Pha dung dịch TE 1X Thành phần gồm: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH8 Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8 Cho dung dịch Tris HCl EDTA vào nước tinh Khuấy chuẩn độ pH đến ... SINH HỌC PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell Arg.) BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Hội đồng... Phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2005 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ MẪU NẤM Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU BẰNG PHƢƠNG PHÁP RFLP – PCR Hướng dẫn khoa học: PGS.TS... đề trên, thực đề tài ? ?Phân tích đa dạng di truyền số mẫu nấm Corynespora cassiicola (Berk & Curt.) Wei gây bệnh cao su (Hevea brasliensis Muell Arg) phƣơng pháp RFLP – PCR? ?? 1.2.Mục đích yêu cầu
