ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA  HỒ THỊ HUYỀN TRÂN NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID TỪ CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR.) QUẢNG NAM Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KĨ THUẬT Đà Nẵng – Năm 2018 Cơng trình hồn thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Người hướng dẫn khoa học: TS LÊ LÝ THÙY TRÂM Phản biện 1: PGS.TS Trần Thị Xô Phản biện 2: TS Bùi Xuân Đông Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ Công nghệ Sinh học họp Trường Đại học Bách khoa vào ngày 13 tháng 10 năm 2018 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm Thông tin – Học liệu,Đại học Đà Nẵng - Thư viện Trường Đại học Bách Khoa Đại học Đà Nẵng MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Cây An xoa (hay gọi thâu kén cái, thâu kén lơng, tổ kén cái, dó lơng) có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour loài thực vật thuộc họ Trôm (Sterculiaceae), bụi, thân gỗ, mọc nơi đất ẩm, thường to bàn tay, có lơng, hoa có màu hồng hay đỏ, có sâu, có lơng chạm vào ngứa [2]; [25] Cây phân bố chủ yếu Nam Trung Quốc, khu vực Nam Á nước Đông Nam Á Lào, Indonesia, Campuchia, Thái Lan Việt Nam Cây dễ trồng, sinh trưởng phát triển tốt nhiều điều kiện sinh thái Tại số nước Ấn Độ, Trung Quốc, An xoa sử dụng loại thuốc truyền thống để điều trị bệnh sốt rét bệnh tiểu đường Trong đó, An xoa chứa hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng điều trị nhiều bệnh khác nhau, sử dụng để làm thuốc chữa bệnh, hầu hết phận sử dụng để trị bệnh… Cây An xoa dùng trường hợp người hay nhức mỏi, đau lưng, ngủ, da xanh, kể người tim hay mệt cải thiện sức khỏe cách hiệu [2]; [6] Lá An xoa chữa trị số bệnh thường gặp ung nhọt, sưng lở Phần rễ dùng làm dịu đau, chữa kiết lỵ, đậu sởi, cảm cúm, đái dắt làm thuốc tiêu độc [2] Ở Campuchia tỉnh Bình Phước - Việt Nam, sử dụng loại thuốc dân gian để điều trị bệnh gan Hiện nay, Việt Nam An xoa tìm thấy nhiều nơi tỉnh giáp biên giới Campuchia Bình Phước nhiều tỉnh miền Trung Trong đó, tỉnh Quảng Nam nơi tìm thấy nhiều An xoa, mọc hoang chưa trồng phổ biến Tại huyện Phú Ninh tìm thấy nhiều chưa trồng sử dụng rộng rãi để làm thuốc Trên giới, có số cơng trình nghiên cứu xác định An xoa chứa chất có hoạt tính sinh học có tác dụng chữa số bệnh Ở Việt Nam, vấn đề nghiên cứu An xoa hạn chế chưa thực quan tâm nhiều, sử dụng thuốc cổ truyền, chưa ứng dụng nhiều vào công nghệ dược phẩm để chữa bệnh Với tác dụng to lớn loài này, đồng thời nhằm tìm hiểu để ứng dụng vào dược phẩm loại thực phẩm chức định chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách xác định hoạt tính sinh học flavonoid từ An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Quảng Nam” Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng quy trình tách chiết để thu dịch chiết cao chiết có chứa hàm lượng flavonoid tồn phần cao từ An xoa - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính gây độc tế bào từ cao chiết Đối tượng phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu Các phận An xoa (thân, lá, rễ) thu hái huyện Phú Ninh - tỉnh Quảng Nam, Việt Nam * Phạm vi nghiên cứu Các nghiên cứu thực quy mơ phịng thí nghiệm thuộc khoa Hóa - Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn đề tài * Ý nghĩa khoa học - Cung cấp thơng tin khoa học thành phần hóa học, hoạt tính sinh học dịch chiết cao chiết flavonoid từ An xoa huyện Phú Ninh, tỉnh Quảng Nam - Cung cấp thông số công nghệ trình tách chiết phương pháp phân tích khoa học đại * Ý nghĩa thực tiễn - Xây dựng phương trình tối ưu hóa điều kiện chiết quy mơ phịng thí nghiệm, làm sở cho nghiên cứu ứng dụng quy mô sản xuất công nghiệp - Cao chiết từ An xoa nguồn sử dụng tạo sản phẩm có giá trị dược liệu cao, góp phần đa dạng hóa sản phẩm nâng cao giá trị chữa bệnh từ An xoa Cấu trúc luận văn CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY AN XOA (Helicteres hirsuta Lour.) Cây An xoa có tên khoa học Helicteres hirsuta Lour., biết đến với nhiều tên gọi khác như: Cây dó lơng, tổ kén lơng, thâu kén lông, thâu kén [6] 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái An xoa 1.1.3 Cơng dụng An xoa 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY AN XOA 1.2.1 Các nghiên cứu giới 1.2.2 Các nghiên cứu nước 1.3 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2 Phân loại hợp chất flavonoid 1.3.3 Phân bố flavonoid thực vật 1.3.4 Hoạt tính sinh học hợp chất flavonoid 1.3.4.1 Tác dụng flavonoid đời sống thực vật 1.3.4.2 Tác dụng sinh học + Tác dụng chống oxy hóa flavonoid + Tác dụng enzyme + Tác dụng chống độc + Tác dụng kháng sinh, chống viêm + Tác dụng hệ tim mạch + Tác dụng hệ thần kinh + Tác dụng chống ung thư HIV 1.4 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT TÁCH CÁC HỢP CHẤT FLAVONOID 1.4.1 Khái niệm phương pháp chiết tách 1.4.2 Phương pháp chiết tách hợp chất flavonoid 1.4.2.1 Nguyên tắc lựa chọn dung môi 1.4.2.2 Chiết tách flavonoid 1.4.3 Các phương pháp chiết tách dung môi 1.4.3.1 Phương pháp ngấm kiệt 1.4.3.2 Phương pháp ngâm dầm 1.4.3.3 Chiết với hỗ trợ siêu âm 1.4.4 Một số phương pháp chiết tách khác 1.4.4.1 Chiết với hỗ trợ vi sóng 1.4.4.2 Chiết chất lỏng tới hạn 1.4.4.3 Chiết áp suất cao 1.4.4.4 Phương pháp chiết hồi lưu 1.4.4.5 Chiết phương pháp lôi nước 1.5 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI QUÁ TRÌNH CHIẾT 1.5.1 Dung môi 1.5.2 Những yếu tố kỹ thuật 1.5.2.1 Nhiệt độ chiết 1.5.2.2 Thời gian chiết 1.5.2.3 Độ mịn nguyên liệu 1.5.2.4 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1.5.2.5 pH dung môi CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Với mục tiêu đề tài đặt ra, tiến hành thực nội dung nghiên cứu theo sơ đồ sau: Hình 2.1 Sơ đồ thực đề tài 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu 2.1.2 Thiết bị, hóa chất 2.1.2.1 Thiết bị 2.1.2.2 Hóa chất 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xác định số thành phần hóa học lá, thân rễ An xoa 2.2.1.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu tươi phương pháp sấy đến khối lượng không đổi [5] 2.2.1.2 Xác định hàm lượng lipid phương pháp Soxhlet [14] 2.2.1.3 Xác định hàm lượng protein phương pháp Kjeldahl [14] 2.2.1.4 Xác định hàm lượng tro tổng số [1] Xác định tro toàn phần phương pháp tro hóa nhiệt độ 550 - 6000C 2.2.1.5 Xác định hàm lượng số kim loại nặng [10]; [11] 2.2.2 Phương pháp tách chiết xác định hàm lượng flavonoid toàn phần 2.2.2.1 Xây dựng đường chuẩn Catechin phương pháp đo quang 2.2.2.2 Khảo sát hàm lượng flavonoid phận khác An xoa 2.2.2.3 Ảnh hưởng dung môi chiết đến hàm lượng flavonoid tồn phần có An xoa 2.2.2.4 Ảnh hưởng phương pháp chiết đến hàm lượng flavonoid tồn phần có An xoa 2.2.2.5 Ảnh hưởng số yếu tố đến khả trích ly flavonoid tồn phần từ An xoa a) Ảnh hưởng thời gian chiết b) Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi c) Ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm 2.2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời số yếu tố đến hàm lượng flavonoid tồn phần 2.2.2.7 Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa từ dịch chiết cao chiết 2.2.2.8 Phương pháp tinh flavonoid từ cao chiết 2.2.2.9 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn 2.2.2.10 Khảo sát khả gây độc tế bào 2.2.3 Xử lý số liệu - Tất thí nghiệm lặp lại lần xử lý phần mềm Statistix 10 - Phương trình đường chuẩn biểu đồ vẽ phần mềm Excel 2010 - Mơ hình tối ưu hóa thiết kế phần mềm Minitab 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG CÂY AN XOA Bảng 3.1 Một số thành phần hóa học có bột An xoa STT Tên tiêu Độ ẩm bột khô Hàm lượng tro tổng số Hàm lượng kim loại Cu Hàm lượng kim loại Pb Hàm lượng kim loại Hg Hàm lượng kim loại As Đơn vị tính % % mg/kg mg/kg μg/kg μg/kg Kết 5,24 6,03 KPH 0,003 KPH KPH STT Tên tiêu Hàm lượng protein Hàm lượng lipid Đơn vị tính % % Kết 7,58 3,27 Ghi chú: KPH: khơng phát 3.2 PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN CATECHIN Xây dựng đường chuẩn cách pha loãng thành dãy dung dịch có nồng độ catechin khác 45, 90, 180, 360, 450, 540 590 µg/ml dung môi Kết đo mật độ quang hấp thu bước sóng 510 nm (OD510 nm) hàm lượng catechin qua dung môi khác thể hình 3.1 với hệ số tương quan R2 dung môi khác dao động từ 0,992 - 0,995 đạt độ tin cậy cao, từ tính tốn hàm lượng flavonoid tồn phần dựa catechin thơng qua phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng cho loại dung mơi (hình 3.1 A, B, C) Hình 3.1 Đồ thị phương trình đường chuẩn catechin A: Dung môi methanol 40%; B: Dung môi ethanol 40%; C: Dung mơi chloroform 40% 10 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng phương pháp chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần 3.5 NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN DUNG MÔI CHIẾT Sau lựa chọn nguyên liệu phương pháp chiết thích hợp, chúng tơi tiến hành khảo sát với loại dung mơi có độ phân cực tương đối khác nhau: methanol 40%, ethanol 40% chloroform 40% Các thí nghiệm tiến hành thời gian 50 phút, nhiệt độ 60oC tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 g/ml Kết nghiên cứu lựa chọn dung môi chiết với điều kiện thể hình 3.4 cho thấy nguyên liệu chiết flavonoid toàn phần dung mơi khác cho kết khác Methanol dung mơi thu hàm lượng flavonoid tồn phần cao (10,933 mgCE/g ± 0,101a), tiếp đến ethanol (7,173 mgCE/g ± 0,040b) thấp chloroform (6,596 mgCE/g ± 0,043c) (hình 3.4), sai số có ý nghĩa mặt thống kê mức xác suất 95% Mặt khác, dựa vào nguyên tắc phân cực dung mơi, dung mơi có độ phân cực khác (methanol (5,1δP), ethanol (5,2δP) chloroform (4,1δP) khả hịa tan hợp chất hữu có tính phân cực khác Do vậy, kết nghiên cứu phù hợp methanol dung môi sử dụng để tiến hành nghiên cứu 11 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng dung môi chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần 3.6 NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG QUÁ TRÌNH CHIẾT 3.6.1 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng flavonoid tồn phần q trình chiết Sau lựa chọn nguyên liệu, dung môi chiết methanol 40% phương pháp chiết thích hợp, chúng tơi tiến hành khảo sát ảnh hưởng thời gian trích ly flavonoid toàn phần phù hợp Các mức thời gian khảo sát 10, 30, 50 70 phút Kết ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng flavonoid tồn phần q trình chiết có rễ An xoa thể hình 3.5 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng thời gian chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần Kết thể hình 3.5 cho thấy rằng, điều kiện, thời gian chiết khác hàm lượng flavonoid tồn phần thu khác Thời gian cho hàm 12 lượng flavonoid toàn phần cao 50 phút với giá trị tương ứng 10,356 mgCE/g ± 0,198a thấp thời gian 10 phút (6,467 mgCE/g ± 0,135d) (hình 3.5), sai số có ý nghĩa mặt thống kê mức xác suất 95% 3.6.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng flavonoid tồn phần q trình chiết Với thời gian chiết 50 phút, nguyên liệu rễ An xoa, dung môi methanol 40%, tiến hành khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng flavonoid toàn phần thu từ rễ An xoa Các tỷ lệ nguyên liệu/dung môi khảo sát 1/10, 1/20, 1/30 1/40 (g/ml) Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi chiết khác đến hàm lượng flavonoid tồn phần Kết thể hình 3.6 cho thấy tỷ lệ ngun liệu/dung mơi thích hợp để trích ly flavonoid toàn phần rễ An xoa 1/20, tương ứng với hàm lượng flavonoid toàn phần thu 10,555 mgCE/g ± 0,057a Khi tăng tỷ lệ ngun liệu/dung mơi lên 1/30 1/40 hàm lượng flavonoid tồn phần thu tăng lên khơng đáng kể, sai số có ý nghĩa mặt thống kê mức xác suất 95% Vậy xét hiệu kinh tế, chọn tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 cho thí nghiệm 3.6.3 Ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid tồn phần q trình chiết 13 Với ngun liệu rễ An xoa, dung môi methanol 40%, tiến hành khảo sát ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid tồn phần thu Các cường độ sóng siêu âm khảo sát 15, 20, 25 30 kHz Các thông số kỹ thuật khác không thay đổi Kết ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm đến hàm lượng flavonoid toàn phần rễ An xoa thể hình 3.7 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng cường độ sóng siêu âm chiết khác đến hàm lượng flavonoid toàn phần Kết cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần rễ An xoa thu tăng dần theo cường độ sóng siêu âm đạt giá trị cao cường độ 25 kHz, tương ứng với giá trị thu 10,942 mgCE/g ± 0,054a Tuy nhiên, tiếp tục tăng cường độ sóng siêu âm hàm lượng flavonoid tồn phần thu có xu hướng giảm Nguyên nhân tượng tác động cường độ sóng siêu âm lớn làm cho số flavonoid có cấu trúc khơng ổn định bị biến tính, dẫn đến hàm lượng flavonoid tồn phần thu có xu hướng giảm (bảng 3.7) Do đó, cường độ sóng siêu âm thích hợp cho q trình trích ly flavonoid tồn phần từ rễ An xoa 25 kHz 3.7 TỐI ƯU HĨA Q TRÌNH TRÍCH LY FLAVONOID TỒN PHẦN TỪ RỄ CÂY AN XOA BẰNG PHƯƠNG PHÁP 14 ĐÁP ỨNG BỀ MẶT RSM Các thí nghiệm mục 3.6 nhằm khảo sát ảnh hưởng số yếu tố thời gian, cường độ sóng siêu âm, tỷ lệ nguyên liệu/dung mơi đến khả trích ly flavonoid tồn phần từ rễ An xoa hỗ trợ phương pháp siêu âm điện cực dung môi methanol 40% nhiệt độ 60ºC Kết xác định điều kiện tối ưu là: thời gian (50 phút), tỷ lệ ngun liệu/dung mơi (1/20), cường độ sóng siêu âm (25 kHz) Tuy nhiên, chưa phải điều kiện tối ưu để thu hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ An xoa cao Với mục đích tìm điều kiện tối ưu cho trình chiết để thu hàm lượng flavonoid toàn phần tối đa, sau khảo sát ảnh hưởng yếu tố đơn biến đến trích ly flavonoid tồn phần, chúng tiến hành tối ưu hóa phương pháp đáp ứng bề mặt RSM theo mô hình Box- behnken phần mềm Minitab 17 Các yếu tố đơn biến sử dụng để thục tối ưu hóa thời gian chiết (X1), cường độ sóng siêu âm (X2) tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (X3) với mức độ khoảng biến thiên tương ứng trình bày bảng 3.8 với hàm lượng flavonoid tồn phần hàm mục tiêu Phương trình tốn học ứng với mơ hình thí nghiệm Box- behnken trình bày phần phương pháp Bảng 3.2 Nhân tố mức độ bố trí thí nghiệm theo mơ hình Boxbehnken Yếu tố ảnh hưởng X1, Thời gian chiết (phút) X2, Cường độ (kHz) X3, Tỷ lệ dung môi (g/ml) Mức Mức sở -1 30 50 20 25 100 200 Mức 70 30 300 Khoảng biến thiên 20 100 15 Bảng 3.3 Kết hàm lượng flavonoid toàn phần từ rễ An xoa Thí nghiệm 10 11 12 13 14 15 Thời gian (phút) (X1) 30 70 30 70 30 70 30 70 50 50 50 50 50 50 50 thu qua thí nghiệm Cường độ (kHz) (X2) 20 20 30 30 25 25 25 25 20 30 20 30 25 25 25 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) (X3) Hàm lượng flavonoid toàn phần (mgCE/g) 200 200 200 200 100 100 300 300 100 100 300 300 200 200 200 9,507 ± 0,096 10,067 ± 0,098 9,188 ± 0,056 9,748 ± 0,060 9,791 ± 0,042 9,557 ± 0,066 9,643 ± 0,055 10,203 ± 0,059 9,539 ± 0,130 9,221 ± 0,136 10,185 ± 0,109 9,867 ± 0,152 10,529 ± 0,128 10,588 ± 0,043 10,689 ± 0,109 Bố trí thí nghiệm theo mơ hình thí nghiệm Box- behnken với 12 thí nghiệm nhân tố với thí nghiệm tâm Dịch chiết thu từ 15 thí nghiệm sử dụng để xác định hàm lượng flavonoid tồn phần theo mơ tả Phạm Hồng Ngọc Thúy cs [23] Kết trình bày bảng 3.9 Từ bảng 3.9 cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần thu từ rễ An xoa có giá trị cao nhất, dao động từ 10,529 mgCE/g ± 0,128 đến 10,689 mgCE/g ± 0,109 khơng sai khác nhiều thí nghiệm Sự sai khác nhỏ sai khác tiến hành thí nghiệm Các kết sử dụng để xử lý phần mềm Minitab 17, kết thể bảng 3.10 cho thấy, thành phần tham gia vào mơ hình thể mức độ ý nghĩa cao, hầu hết giá trị p0,05 nên giá trị khơng có ý nghĩa hồi quy Bảng 3.4 Mức ý nghĩa hệ số hồi quy Nhân tố β̥ X1 X2 X3 X 12 X 22 X 32 X 1X X 1X X 2X Coef 10,620 0,1817 -0,1593 0,2237 -1,4395 -1,5351 -1,3640 0,000 0,1985 0,000 SE Coef 0,107 0,0653 0,0653 0,0653 0,0962 0,0962 0,0962 0,0924 0,0924 0,0924 T 99,38 2,77 -2,44 3,42 -4,57 -5,56 -3,78 0,00 2,15 0,00 P 0,000 0,040 0,059 0,019 0,006 0,003 0,013 1,000 0,084 1,000 Phương trình hồi quy biểu diễn mối quan hệ hàm lượng flavonoid tồn phần biến độc lập cho mơ hình bậc hai bề mặt đáp ứng Box- behnken thu sau: Y = -11.81 + 0.0991 X1 + 0.01183 X3 - 0.001099 X12 0.1338 X22 - 0.000036 X32 (9) Trong đó: Y: Hàm lượng flavonoid tồn phần X1: Thời gian chiết (phút) X2: Cường độ sóng siêu âm (kHz) X3: Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (g/ml) Giá trị mơ hình Fisher F test (F = 9,74) giá trị xác suất p thấp (p = 0,011) bảng 3.11 cho thấy phương trình hồi quy thiết lập có ý nghĩa thống kê cao Mặt khác, phù hợp mơ hình kiểm tra thơng qua hệ số xác định tương quan R2 Theo Guan Yao (2008) cho biết rằng, 17 mơ hình phù hợp giá trị R2 đạt giá trị thấp 80% theo Zabeti cs (2009) thông số Adeq Precision lớn cần thiết [18]; [28] Kết phân tích mơ hình thể bảng 3.11 cho thấy giá trị R2 mơ hình 94,60% giá trị R2-(adj) = 84,89% tất giá trị p thể mức độ có ý nghĩa thống kê mức độ cao chứng tỏ mơ hình xây dựng dựa đơn biến lựa chọn phù hợp thể tương thích cao giá trị thực nghiệm giá trị dự đoán Mặt khác, mức độ phù hợp mơ hình đánh giá thông qua giá trị F Lack of fit Mơ hình tương quan tốt cần phù hợp số liệu thực tế lý thuyết, mơ hình thu với kiểm định Lack of fit (sự khơng phù hợp) khơng có ý nghĩa thống kê điều mong muốn [26] Kết bảng 3.11 cho thấy hai giá trị F (8,03) p (0,113)> 0,05 nên khơng có ý nghĩa thống kê, Vì khả phù hợp mơ hình cao (bảng 3.11) Tóm lại, chúng tơi sử dụng phương trình hồi quy (9) để dự đốn lý thuyết giá trị hàm lượng flavonoid toàn phần mẫu dịch chiết từ rễ An xoa Đồ thị bề mặt đáp ứng thể mối tương quan yếu tố thời gian, cường độ sóng siêu âm, tỷ lệ ngun liệu/dung mơi đến hàm lượng flavonoid tồn phần từ dịch chiết rễ An xoa thể hình 3.8 Kết cho thấy rằng, tăng thời gian chiết, cường độ sóng siêu âm tỷ lệ ngun liệu/dung mơi hiệu suất chiết flavonoid tồn phần tăng lên Tuy nhiên, đến giới hạn hiệu suất chiết có xu hướng giảm ta tiếp tục tăng nhân tố (hình 3.8) 18 Bảng 3.5 Phân tích phương sai (ANOVA) phương trình hồi quy cho q trình chiết có hỗ trợ siêu âm điện cực Tổng bình Độ tự Trung bình phương bình phương Mơ hình (Model) 2,9921 0,3325 Không phù hợp (Lack-of-Fit) 0,1576 0,0526 Sai số (Pure Error) 0,0131 0,0065 Tổng (Total) 3,1629 14 R-Sq = 94,60% R-Sq(adj) = 84,89% Nguồn Giá trị F 9,74 8,03 Giá trị P 0,011 0,113 Hình 3.8 Biểu đồ chu tuyến 3D (A) biểu đồ bề mặt 2D (B) xác định vùng giá trị cho điều kiện Các giá trị tối ưu biến chọn lọc xác định cách giải phương trình hồi quy dựa phần mềm Minitab 17 Kết thu điều kiện tối ưu để đạt hiệu suất trích ly flavonoid tồn phần cao thời gian trích ly (55,86 phút), cường độ sóng siêu âm (24,24 kHz) tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đạt 239,40 g/ml thu hiệu suất trích ly cao với giá trị tương ứng 10,6836 mgCE/g (hình 3.9) Hình 3.9 Các điều kiện tối ưu trình chiết flavonoid toàn phần từ rễ An xoa phương pháp siêu âm điện cực dung môi methanol 40% 19 3.8 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG FLAVONOID TOÀN PHẦN TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT VỚI CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU Bảng 3.6 Hàm lượng flavonoid tồn phần có dịch chiết cao chiết Tỷ lệ pha loãng 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:600 1:800 1:1000 LSD0.05 Hàm lượng flavonoid toàn phần dịch chiết (mgCE/g) 10,053 ± 0,133a 8,850 ± 0,139b 7,338 ± 0,407c 5,180 ± 0,267d 3,657 ± 0,400e 2,127 ± 0,133f 0,784 ± 0,240g 0,174 ± 0,073h 0,054 ± 0,015h 0,404 Hàm lượng flavonoid tồn phần có cao chiết (mgCE/g) 13,031 ± 0,407a 11,028 ± 0,557b 8,671 ± 0,470c 6,069 ± 0,555d 3,746 ± 0,468e 2,749 ± 0,658f 1,539 ± 0,077g 0,485 ± 0,043h 0,214 ± 0,056h 0,726 3.9 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CÓ TRONG DỊCH CHIẾT VÀ CAO CHIẾT TỪ RỄ CÂY AN XOA Dịch chiết rễ An xoa có chứa hàm lượng flavonoid tồn phần 10,053 mgCE/g ± 0,133a (bảng 3.13) tiến hành pha loãng thành tỷ lệ khác Các độ pha loãng khảo sát từ - 1/1000 Theo tăng dần hệ số pha lỗng hàm lượng flavonoid tồn phần giảm theo hay nói cách khác hoạt tính bắt gốc tự DPPH giảm theo Chứng tỏ, khả kháng oxy hóa tỷ lệ thuận theo chiều tăng dần hàm lượng flavonoid toàn phần Với dịch chiết ban đầu (hàm lượng flavonoid toàn phần = 10,053 mgCE/g ± 0,133a) cho tỷ lệ % bắt gốc tự DPPH cao chiếm 94,193% (bảng 3.13) Phương trình hồi quy tuyến tính có từ dịch chiết rễ An xoa là: y = 0,167ln(x) + 0,465, với hệ số tương quan R² = 0,955 (hình 3.10) 20 Tương tự cao chiết hoạt tính bắt gốc tự DPPH đạt 95,249% (bảng 3.14) Phương trình hồi quy tuyến tính có từ cao chiết rễ An xoa y = 0,216ln(x) + 0,346, với hệ số tương quan R² = 0,972 (hình 3.11) Các phương trình hồi quy tuyến tính sử dụng để tính giá trị IC50 dịch chiết cao chiết Kết thể hình 3.12 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự DPPH hàm lượng flavonoid khác có dịch chiết từ rễ An xoa Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn % bắt gốc tự DPPH hàm lượng flavonoid khác có cao chiết từ rễ An xoa Hình 3.12 Ảnh thực phản ứng khử gốc tự DPPH nồng độ flavonoid toàn phần khác Ghi chú: 0: đối chứng dương; 1, 2, 3….,9 tương ứng với nồng độ 21 flavonoid tồn phần pha lỗng 1, 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:600, 1:800, 1:1000 Bảng 3.9 Giá trị IC50 dịch chiết cao chiết từ rễ An xoa dung môi methanol 40% phương pháp siêu âm điện cực điều kiện tối ưu Giá trị IC50 (µg/mL) Dịch chiết 302,850 Cao chiết 271,900 Trolox 8,210 Qua bảng 3.15 cho thấy hàm lượng flavonoid toàn phần cao chiết dịch chiết 271,900 µg/mL 302,850 µg/mL có khả khử 50% gốc tự DPPH điều kiện thí nghiệm Mặt khác, khả khử gốc tự DPPH 50% dịch chiết cao chiết có khác nhau, cao chiết cho giá trị khử gốc tự cao Sở dĩ cao chiết trải qua trình tinh loại bỏ số tạp chất nên khả ảnh hưởng tạp chất đến hoạt tính bắt gốc tự giảm (bảng 3.15) Tuy nhiên khả trung hòa gốc tự DPPH cao chiết dịch chiết thấp Trolox từ 33,118 - 36,894 lần cao chiết chưa tinh hồn toàn 3.10 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN VÀ KHÁNG PHÂN BÀO TỪ CAO CHIẾT CỦA RỄ CÂY AN XOA 3.10.1 Đánh giá khả kháng khuẩn từ cao chiết rễ An xoa Bảng 3.10 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Chủng vi khuẩn Cao chiết (652 µg/ml) E coli LSD0.05 Samonella LSD0.05 20,667 ± 1,155a 16,667±1,1528a Đường kính vịng kháng khuẩn (mm) Đối chứng dương Mẫu trắng Tỷ lệ kháng khuẩn Ampicilin (Methanol so với đối chứng (100µg/ml) 40%) dương (%) 11,667 ± 0,577b 0,000 ± 0,000c 177,14 1,489 11,667 ± 0,577b 0,000 ± 0,000c 142,86 1,884 22 Hình 3.13 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn Cao flavonoid tồn phần thu từ rễ An xoa lấy 0,05g cao hịa tan 1ml dung mơi Methanol 40% để đạt nồng độ 0,652 mg/ml (652µg/ml) Khả kháng khuẩn cao chiết tiến hành khảo nghiệm hai chủng vi sinh vật E.coli Samonella typhi Viện Công Nghệ Sinh Học Đại học Huế cung cấp Kết kháng khuẩn thể bảng 3.16 cho thấy, khả ức chế sinh trưởng E.coli Samonella typhi cao chiết từ rễ An xoa tương đối cao với đường kính vịng kháng khuẩn tương ứng 20,667mm ± 1,155a 16,667mm ± 1,1528a cao so với đối chứng kháng sinh ampicilin (100µg/ml) (11,667mm ± 0,577b) Tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn hai chủng E.coli Samonella typhi có khác nhau, E.coli cho khả kháng cao so với Samonella (bảng 3.16 hình 3.13) 3.10.2 Đánh giá khả gây độc tế bào Chúng tiến hành thử nghiệm gây độc tế bào dòng tế bào ung thư gan Hep - G2 thử nghiệm SRB (Sulforhodamine B) phịng thí nghiệm sinh học phân tử-Bộ môn di truyền- Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM Kết thể bảng 3.17 Kết mẫu thể tác động ức chế dòng tế bào ung thư gan Hep G2 nồng độ 100 µg/mL, nhiên phần trăm ức chế không 23 cao nên không tiếp tục thực xác định IC50 Bảng 3.11 Tỷ lệ (%) gây độc tế bào cao chiết dòng tế bào Mẫu CPT Mẫu ung thư gan Hep - G2 nồng độ 100 µg/mL Phần trăm gây độc tế bào (%) Lần Lần Lần TB ± ĐLC 50,65 50,91 50,21 50,59 ± 0,36 53,49 56,59 52,72 54,27 ± 2,05 Chú thích: - CPT: chứng dương cho tính ổn định qui trình Tế bào cảm ứng với Camptothecine nồng độ 0,07 µg/mL; - Nồng độ thử nghiệm nồng độ cuối mẫu phản ứng; - TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu đề tài, đưa số kết luận sau: Thành phần hóa học bột An xoa huyện Phú Ninh, Quảng Nam sau: độ ẩm bột khô (5,24%); tro tổng số (6,03%); hàm lượng kim loại Pb (0,003 mg/kg); protein (7,58%); hàm lượng lipid (3,27%); kim loại Cu, Hg As không phát bột An xoa Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần cao thu rễ An xoa phương pháp siêu âm điện cực với cường độ sóng siêu âm thích hợp 25 kHz nhiệt độ 60ºC thời gian 50 phút với tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1/20 g/ml Xác định điều kiện tách chiết tối ưu theo phương trình hồi quy: Y = -11.81+ 0.0991 X1 + 0.01183 X3 - 0.001099 X12 0.1338 X22 - 0.000036 X32 (12) Với điều kiện tối ưu tính tốn 24 lý thuyết là: Thời gian (55,8586 phút); cường độ (24,2424 kHz) tỷ lệ nguyên liệu/dung môi (1/239,394 g/ml), tương ứng với hàm lượng flavonoid toàn phần thu 10,6836 mgCE/g Hoạt tính sinh học dịch chiết cao chiết - Hoạt tính kháng oxy hóa: Dịch chiết cao chiết từ rễ An xoa có khả khử gốc tự DPPH Hàm lượng flavonoid toàn phần cao chiết dịch chiết 271,900 µg/mL 302,8500 µg/mL có khả khử 50% gốc tự DPPH điều kiện thí nghiệm Mặt khác, khả khử gốc tự DPPH 50% dịch chiết cao chiết có khác Tuy nhiên khả trung hòa gốc tự DPPH cao chiết dịch chiết thấp Trolox từ 33,118 - 36,894 lần, cao chiết chưa tinh hoàn toàn - Khả kháng khuẩn: Cao chiết từ rễ An xoa có khả kháng với chủng vi khuẩn E coli Samonella typhi với đường kính vịng kháng khuẩn 20,667 mm ± 1,155a 16,667 mm ± 1,1528a so với đối chứng kháng sinh Ampicilin (100 µg/ml) 11,667 mm ± 0,577b KIẾN NGHỊ Trong trình nghiên cứu, điều kiện thí nghiệm thời gian cịn hạn chế, chúng tơi đưa số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu nhiều phương pháp chiết đại khác từ rễ An xoa để thu hàm lượng flavonoid toàn phần cao ... ứng dụng vào dược phẩm loại thực phẩm chức định chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu chiết tách xác định hoạt tính sinh học flavonoid từ An xoa (Helicteres hirsuta Lour.) Quảng Nam? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Xây... điểm hình thái An xoa 1.1.3 Cơng dụng An xoa 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY AN XOA 1.2.1 Các nghiên cứu giới 1.2.2 Các nghiên cứu nước 1.3 TỔNG QUAN VỀ HỢP CHẤT FLAVONOID 1.3.1 Định nghĩa 1.3.2... trình tách chiết để thu dịch chiết cao chiết có chứa hàm lượng flavonoid toàn phần cao từ An xoa - Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính gây độc tế bào từ cao chiết