BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  - HOÀNG PHƯƠNG THẢO MÃ SINH VIÊN: 1401559 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID MỚI HƯỚNG ỨC CHẾ HISTONE DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI -  - HOÀNG PHƯƠNG THẢO MÃ SINH VIÊN: 1401559 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƯ CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT N-HYDROXYPROPENAMID MỚI HƯỚNG ỨC CHẾ HISTONE DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Phan Thị Phương Dung NCS Đỗ Thị Mai Dung Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trước trình bày phần nội dung đề tài khóa luận mình, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến người suốt thời gian qua hỗ trợ, động viên giúp đỡ tơi hồn thành cách tốt khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến với người thầy, người đáng kính tơi: GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Phan Thị Phương Dung, NCS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội Thầy cô không tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành khóa luận mà ln có dẫn xác, kịp thời động viên tơi lúc khó khăn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hóa Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi thực khóa luận Cuối cùng, tơi muốn cảm ơn gia đình, bạn bè, anh chị, bạn nhóm nghiên cứu mơn Hóa Dược, đặc biệt NCS Dương Tiến Anh, anh Nguyễn Văn Sự, em Bùi Xuân Trường, em Nguyễn Tuấn Linh chia sẻ buồn vui, giúp đỡ khích lệ tơi suốt q trình nghiên cứu Hà Nội, ngày 30 tháng 10 năm 2018 Sinh viên Hoàng Phương Thảo MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN .2 1.1 HISTON DEACETYLASE 1.1.1 Khái niệm phân loại histon deacetylase 1.1.2 Cấu trúc trung tâm hoạt động enzym HDAC chế deacetyl hóa 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi) .5 1.2.1 Phân loại HDACi 1.2.2 Cấu trúc chất HDACi .5 1.2.3 Liên quan cấu trúc tác dụng chất ức chế HDAC .6 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC HƯỚNG ỨC CHẾ HDAC 1.3.1 Trên giới 1.3.1 Trong nước 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC .10 1.4.1 Một số phương pháp tạo liên kết amid .11 1.4.2 Một số phương pháp tổng hợp acid hydroxamic 13 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ .16 2.1.1 Hóa chất 16 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 16 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.2.1 Tổng hợp hóa học .17 2.2.2 Thử tác dụng sinh học dẫn chất tổng hợp .17 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1 Tổng hợp hóa học .17 2.3.2 Thử tác dụng sinh học .18 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1 HÓA HỌC 20 3.1.1 Tổng hợp hóa học .20 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 31 3.1.3 Xác định cấu trúc 32 3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 36 3.2.1 Thử tác dụng ức chế HDAC .36 3.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro .37 3.3 BÀN LUẬN .38 3.3.1 Tổng hợp hóa học .38 3.3.2 Khẳng định cấu trúc 40 3.3.3 Thử hoạt tính sinh học 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 13 C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (Carbon-13 nuclear magnetic resonance) H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton nuclear magnetic resonance) ADN : Acid desoxyribonucleic Asp : Acid aspartic D : Vạch đôi phổ NMR (Doublet) DCM : Dicloromethan dd : Vạch chẻ đôi lần phổ NMR (Doublet of doublet) DMAP : Dimethylaminopyridin DMF : Dimethylformamid DMSO : Dimethylsulfoxid DMSO-d6 : Dimethylsulfoxid deuteri hóa FBS : Huyết bào thai bò (Fetal bovine serum) FDA : Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ (U.S Food and Drug Administration) H (%) : Hiệu suất HAT : Histon acetyltransferase HCT116 : Dòng tế bào ung thư ruột kết người HDAC : Histon deacetylase HDACi : Các chất có tác dụng ức chế HDAC (Histon deacetylase inhibitors) His : Histidin IC50 : Nồng độ ức chế 50% (The half maximal inhibitory concentration) IR : Hồng ngoại (Infrared) J : Hằng số ghép cặp phổ NMR KRIBB : Viện nghiên cứu Sinh học Công nghệ sinh học Hàn Quốc (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) M : Đa vạch phổ NMR (Multiplet) MeOH : Methanol MS : Phổ khối lượng (Mass spectrometry) NAD+ : Nicotinamid adenin dinucleotid NCI –H23 : Dòng tế bào ung thư phổi thể không nhỏ người NST : Nhiễm sắc thể PC-3 : Dịng tế bào ung thư biểu mơ tuyến tiền liệt người Rf : Hệ số lưu giữ TLC S : Vạch đơn phổ NMR (Singlet) SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic SRG : Nhóm nhận diện bề mặt (Surface recognition group) SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng người T : Vạch ba phổ NMR (Triplet) THF : Tetrahydrofuran TLC : Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TMS : Tetramethylsilan Tºnc : Nhiệt độ nóng chảy TSA : Trichostatin A THF : Tetrahydrofuran UV : Tử ngoại (Ultraviolet) ZBG : Nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc binding group) δ (ppm) : Độ dịch chuyển hóa học (phần triệu) phổ NMR Ν : Dao động hóa trị phổ IR DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (Tºnc) dẫn chất IVa-e .31 Bảng 3.2 Kết phân tích phổ IR dẫn chất IVa-e 32 Bảng 3.3 Kết phân tích phổ khối lượng (MS) dẫn chất IVa-e 33 Bảng 3.4 Kết phân tích phổ 1H-NMR dẫn chất IVa-e 33 Bảng 3.5 Kết phân tích phổ 13C-NMR dẫn chất IVa-e 35 Bảng 3.6 Kết thử tác dụng ức chế HDAC dẫn chất IVa-e 36 Bảng 3.7 Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư dẫn chất IVa-e .37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Vai trị HDAC HAT điều hịa q trình phiên mã .2 Hình 1.2 Phân loại HDAC Hình 1.3 Cơ chế deacetyl hóa theo Finnin Hình 1.4 Phân loại chất ức chế HDAC .5 Hình 1.5 Mơ hình cấu trúc HDACi Hình 1.6 Kết nghiên cứu M.W Martin Hình 1.7 Cấu trúc chất 5a,b nghiên cứu Dae-Kee Kim Hình 1.8 Hợp chất 6c nghiên cứu J.Chen Hình 1.9 Cấu trúc chung chất 7a-c nghiên cứu Đoàn Thanh Hiếu 10 Hình 1.10 Cấu trúc chung chất nghiên cứu Trần Thị Lan Hương 10 Hình 3.1 Phổ khối lượng MS dẫn chất IVe 41 Hình 3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR IVb .43 Hình 3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR dẫn chất IVe 44 Hình 3.4 Biểu đồ so sánh tác dụng gây độc tế bào dẫn chất IVa-e dòng tế bào SW620, PC-3 NCI-H23 .46 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1 Phản ứng tạo liên kết amid trực tiếp 11 Sơ đồ 1.2 Phản ứng tạo liên kết amid thơng qua acid hoạt hóa .11 Sơ đồ 1.3 a, Phản ứng tạo acyl clorid; b, Phản ứng tổng hợp amid 12 Sơ đồ 1.4 Vai trò xúc tác pyridin .12 Sơ đồ 1.5 Tổng hợp thông qua tạo acyl azid 12 Sơ đồ 1.6 Tổng hợp amid thông qua tạo ester 13 Sơ đồ 1.7 Phản ứng tổng hợp acid hydroxamic nghiên cứu tác giả Trần Thị Lan Hương 14 Sơ đồ 1.8 a, Tổng hợp từ ester; b, Tổng hợp từ acid carboxylic .14 Sơ đồ 3.1 Các bước tổng hợp hóa học chung 20 Sơ đồ 3.2 Tổng hợp dẫn chất IIa .20 Sơ đồ 3.3 Tổng hợp dẫn chất IIIa 21 Sơ đồ 3.4 Tổng hợp dẫn chất IVa 22 Sơ đồ 3.5 Tổng hợp dẫn chất IVb 24 Sơ đồ 3.6 Tổng hợp dẫn chất IVc 26 Sơ đồ 3.7 Tổng hợp dẫn chất IVd 27 Sơ đồ 3.8 Tổng hợp dẫn chất IVe 29 Sơ đồ 3.9 Cơ chế phản ứng tạo thành IIa-e .38 Sơ đồ 3.10 Vai trò xúc tác DMAP 38 Sơ đồ 3.11 Cơ chế phản ứng tổng hợp dẫn chất IIIa-e .39 Sơ đồ 3.12 Cơ chế tạo thành chất IVa-e 39 Phụ lục 13 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR IVc (phổ giãn rộng) Phụ lục 14 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR IVd Phụ lục 14 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR IVd (phổ giãn rộng) Phụ lục 15 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR IVe Phụ lục 15 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR IVe (phổ giãn rộng) Phụ lục 16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVa Phụ lục 16 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVa (phổ giãn rộng) Phụ lục 17 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVb Phụ lục 17 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVb (phổ giãn rộng) Phụ lục 18 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVc Phụ lục 18 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVc (phổ giãn rộng) Phụ lục 19 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVd Phụ lục 19 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVd (phổ giãn rộng) Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVe Phụ lục 20 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR IVe (phổ giãn rộng) ... 3.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Các d? ?n chất IVa-e đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thư người dòng tế bào ung thư: ung thư phổi thể không nhỏ (NCI-H23), ung thư biểu mô ti? ?n. .. tính tế bào [13] Tr? ?n sở nghi? ?n cứu tr? ?n, ti? ?n hành đề tài ? ?Tổng hợp thử hoạt tính kháng tế bào ung thư số d? ?n chất N- hydroxypropenamid hướng ức chế histon deacetylase? ?? với hai mục tiêu: Tổng hợp. .. SW620 (tế bào ung thư đại tràng) NCI-H23 (tế bào ung thư phổi thể không nhỏ) Các dòng tế bào ung thư lấy từ Ng? ?n hàng tế bào ung thư Vi? ?n nghi? ?n cứu Sinh học Công nghệ sinh học H? ?n Quốc (KRIBB) nuôi