Đang tải... (xem toàn văn)
nâng o giá trị ủ rừng trồng Bạ h n uro ặ biệt l ung ấp gỗ lớn ở nƣớ t . B n ạnh ó, một số tổ hợp l i giữ Bạ h n uro v một số lo i bạ h n khá ã ƣợ l i tạo ể ƣ v o khảo nghiệm giống tại B V - H Nội, Đ ng H - Quảng Trị v Bầu B ng - B nh Dƣơng. Một số òng Bạ h n l i UP o Viện Nghi n ứu Giống v C ng nghệ Sinh h Lâm nghiệp h n tạo ũng ho năng suất ạt tới 25-35m 3 /h /năm tr n á lập ị thoái hó , nghèo inh ƣỡng ở B V , H Nội v Đ ng H , Quảng Trị (H Huy Thịnh v ộng s 2015; Mai Trung Kiên, 2014) [23], [15]. Tuy nhiên, giống l i UG (E. urophylla x E. grandis) l giống l i ó triển v ng hƣ ƣợ nghi n ứu một á h rộng rãi, mặt khá á khảo nghiệm giống l i giữ Bạ h n uro v một số lo i khá mới hỉ theo õi sinh trƣởng ến gi i oạn 3 năm tuổi, v thế việ tiếp tụ theo dõi sinh trƣởng ủ húng ở gi i oạn s u 3 tuổi ũng nhƣ nghi n ứu một số tính hất gỗ l ần thiết trong việ ánh giá một á h ầy ủ hơn khả năng phát triển giống bạ h n l i trong trồng rừng gỗ lớn. Trong khu n khổ kết quả á ề t i “Nghiên cứu chọn tạo giống có năng suất và chất lượng cao cho một số loài cây trồng rừng chủ yếu”giai oạn 2001 - 2005, ề t i “Nghiên cứu chọn tạo giống Bạch đàn lai mới giữa Bạch đàn pelita và các giống Bạch đàn khác” gi i oạn 2011- 2015, án “Phát triển giống cây lấy gỗ phục vụ trồng rừng rừng kinh tế”gi i oạn 2006 - 2010 ã xây ng á khảo nghiệm hậu thế thế hệ h i v khảo nghiệm tổ hợp l i khá lo i giữ Bạ h n uro v á lo i bạ h n khá . Để tiếp tụ ánh giá ịnh hƣớng nghi n ứu Bạ h n uro v á giống l i Bạ h n uro với á lo i bạ h n khá qu ó góp phần v o hiến lƣợ ải thiện giống nhằm nâng năng suất v hất lƣợng o phụ vụ mụ í h gỗ xẻ, luận án “Nghiên cứu đặc điểm biến dị và khả năng di truyền về sinh trưởng và một số tính chất gỗ của Bạch đàn uro và giống lai giữa Bạch đàn uro với các loài bạch đàn khác” ƣợ th hiện. thấp gần đây được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym [13,14,23], [15–22], enzym kết hợp với chiếu xạ [24], thủy phân bằng axit HCl [14,25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kết hợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp nhiệt [28]...Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới mới chỉ tập trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính chất, cấu trúc hóa học, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng, đặc biệt khả năng giảm hấp thu đường huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu. Những nghiên cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại càng ít và hầu như chưa có. Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ bản về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loại hợp chất này nhằm đưa ra những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị thực tiễn cao từ cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây Amorphophalus konjac K.Koch ở Lâm Đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết”. Các mục tiêu cụ thể cho luận án như sau: 1. Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc của glucomannan từ củ (thân củ) cây Amorphophallus konjac K.Koch (A.konjac) thu nhận tại Việt Nam. 2. Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan từ cây A.konjac để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các phương pháp khác nhau. 3. Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sản thấp gần đây được nhiều tác giả trên thế giới quan tâm, gồm: thủy phân bằng enzym [13,14,23], [15–22], enzym kết hợp với chiếu xạ [24], thủy phân bằng axit HCl [14,25], axit HCl kết hợp sử dụng sóng siêu âm [26] hay chiếu xạ tia gamma kết hợp etanol [27], bằng kiềm kết hợp nhiệt [28]...Tuy nhiên các nghiên cứu trên thế giới mới chỉ tập trung nhiều vào các phương pháp điều chế glucomannan khối lượng phân tử thấp mà chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết về tính chất, cấu trúc hóa học, về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của chúng, đặc biệt khả năng giảm hấp thu đường huyết và cơ chế tác dụng chưa được nghiên cứu. Những nghiên cứu như vậy về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam lại càng ít và hầu như chưa có. Để đóng góp nghiên cứu mới có ý nghĩa khoa học cơ bản về glucomannan có nguồn gốc tại Việt Nam, đồng thời góp phần nâng cao giá trị sử dụng của loại hợp chất này nhằm đưa ra những sản phẩm dược phẩm, thực phẩm chức năng có giá trị thực tiễn cao từ cây Nưa Amorphophalus konjac K.Koch ở Việt Nam chúng tôi đã lựa chọn đề tài “Nghiên cứu tách, tinh chế và thủy phân glucomannan từ cây Amorphophalus konjac K.Koch ở Lâm Đồng và định hướng ứng dụng hạ đường huyết”. Các mục tiêu cụ thể cho luận án như sau: 1. Tách, xác định tính chất và chứng minh cấu trúc của glucomannan từ củ (thân củ) cây Amorphophallus konjac K.Koch (A.konjac) thu nhận tại Việt Nam. 2. Xác định điều kiện tối ưu cho phản ứng thủy phân glucomannan từ cây A.konjac để chế tạo các loại glucomannan với khối lượng phân tử thấp bằng các phương pháp khác nhau. 3. Thăm dò hoạt tính hạ đường huyết và cơ chế hạ đường huyết của sản
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - TRẦN THỊ NỮ NGHIÊN CỨU TÁCH, TINH CHẾ VÀ THỦY PHÂN GLUCOMANNAN TỪ CÂY AMORPHOPHALLUS KONJAC K KOCH Ở LÂM ĐỒNG VÀ ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG HẠ ĐƯỜNG HUYẾT DỰ THẢO LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội, 2020 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung glucomannan 1.1.1.Nguồn gốc, cấu trúc glucomannan 1.1.2 Tính chất vật lý glucomannan 1.1.3 Tính chất hóa học glucomannan 1.1.4 Hoạt tính sinh học tác dụng dược lý glucomannan 1.2 Cây nưa A.konjac K.Koch quy trình tách chiết glucomannang 1.2.1 Cây Nưa Amorphophallus Konjac K.Koch 1.2.2 Quy trình tách chiết glucomannan từ củ A.konjac 12 1.3 Phản ứng cắt mạch glucomannan 15 1.3.1 Cắt mạch phương pháp lý -hóa học 15 1.3.2 Thủy phân với xúc tác enzym 17 1.3.2.1 Đặc điểm xúc tác enzym 17 1.3.2.2.Các hệ enzym thủy phân mannan 19 1.3.2.3 Nghiên cứu thủy phân glucomannan enzym 26 1.3.2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xúc tác enzym 28 1.3.2.5 Phương pháp quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện phản ứng tối ưu 30 1.4 Enzym AMPK vai trị hạ đường huyết 31 1.4.1 Q trình chuyển hóa glucose thể 31 1.4.1.1 Quá trình hấp thu glucose 31 1.4.1.2 Q trình chuyển hóa glucose 32 1.4.2 Khái quát enzym Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase (AMPK) 34 1.4.3 Các phương pháp hoạt hóa AMPK 36 1.4.3.1 hoạt hóa AMPK vận động 36 1.4.3.2 hoạt hóa AMPK hoạt chất 38 1.5 Tính hình nghiên cứu glucomannan từ nưa A.konjac Việt Nam 40 Chương THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1 Nguyên liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 43 2.1.1 Nguyên liệu hóa chất 43 2.1.2 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 44 2.2 Thực nghiệm .45 2.2.1 Tách, tinh chế xác định cấu trúc, tính chất glucomannan từ A.konjac 45 2.2.1.1 Tách glucomannan từ A.konjac K.Koch 45 2.2.1.2 Xác định hàm lượng glucomannan bột konjac glucomannan 47 2.2.1.3 Xác định cấu trúc đặc trưng glucomannan .49 2.2.2 Thủy phân glucomannan 52 2.2.2.1 Thủy phân axit 52 2.2.2.2 Thủy phân konjac glucomannan enzym .53 2.2.3 Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK LKGM-E in vitro 57 2.2.4 Nghiên cứu hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E mơ hình in vivo.59 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 Nghiên cứu tách, tinh chế đặc điểm cấu trúc, tính chất glucomannan củ nưa A.konjac 61 3.1.1 Tách tinh chế glucomannan từ củ Nưa A.konjac 61 3.1.1.1 Hàm lượng glucomannan củ Nưa A.konjac 61 3.1.1.2.Tách glucomannan từ củ Nưa A.konjac .63 3.1.1.3 Tinh chế glucomannan 65 3.1.2 Đặc trưng cấu trúc, tính chất glucomannan từ củ A.konjac 65 3.1.2.1 Phổ IR glucomannan 65 3.1.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân .66 3.1.2.3 Tính chất nhiệt KGM 72 3.1.2.4 Độ kết tinh 73 3.1.2.5 Khối lượng phân tử KGM .73 3.1.2.6 Hàm lượng tro kim loại nặng bột KGM .75 3.2 Thủy phân glucomannan xúc tác axit HCl 76 3.2.1 Nghiên cứu điều kiện thích hợp phản ứng thủy phân xúc tác axit 76 3.2.2 Cấu trúc tính chất sản phẩm thủy phân 82 3.2.2.1 Độ tan hiệu suất thu hồi LKGM-1 82 3.2.2.2 Phổ IR LKGM-1 83 3.2.2.3 Phổ NMR LKGM-1 .84 3.2.2.4 Tính chất nhiệt LKGM-1 87 3.2.2.5 Khối lượng trung bình LKGM-1 88 3.3 Thủy phân konjac glucomannan enzym 89 3.3.1 Định tính khả phân huỷ glucomannan enzym từ vi khuẩn 89 3.3.2 Xác định điều kiện tối ưu phản ứng phương pháp bề mặt đáp ứng90 3.3.2.1 Kết theo mơ hình thực nghiệm 90 3.3.2.2 Phân tích thống kê .92 3.3.2.3 Tìm chế độ thủy phân tối ưu 96 3.3.3 Đặc điểm cấu trúc tính chất LKGM-E 97 3.3.3.1 Phổ IR LKGM-E 97 3.3.3.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân LKGM-E 99 3.3.3.3 Tính chất nhiệt LKGM-E 102 3.3.3.4 Khối lượng phân tử trung bình sản phẩm thủy phân 103 3.3.3.5 Độ tan hiệu suất thu hồi LKGM-E 104 3.4 Hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E 106 3.4.1 Hoạt tính hạ đường huyết LKGM-E mơ hình in vitro .106 3.4.2 Tác dụng ức chế dung nạp glucose huyết LKGM-E mơ hình in vivo109 KẾT LUẬN CHUNG 114 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A konjac Amorphophallus konjac K Koch ADP Adenosine diphotphat AMP Adenosine monophotphat AMPK Adenoidin 5'-monophosphat hoạt hóa protein kinase ATP Adenosine triphotphat DA Độ axetyl hóa DMF Dimetyl Fomamide DMSO Dimethyl sulfoxit DMEM Môi trường ni cấy tế bào DLS Thiết bị phân tích kích thước hạt DRS Tổng hàm lượng đường khử DSC Phân tích nhiệt quét vi sai E Enzym EC 3.2.1.21 β- glucosidase EC 3.2.1.22 α-galactosidase EC 3.2.1.25 exo-β- mannosidase EC 3.2.1.78 endo-β-mannanase FBS Huyết thai bò GH họ enzym glycosyl hydrolase GM Glucomannan HPGPC Sắc kí thẩm thấu gel hiệu cao HRP Enzym Horseradish peroxidase HS Huyết ngựa KGM Konjac glucomannan IR Phổ hồng ngoại LDK Sản phẩm thủy phân LKGM-1 Konjac glucomannan thủy phân axit LKGM-E Konjac glucomannan thủy phân enzym NAD Nicotinamid adenin dinucleotid NADH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid NADP Nicotinamid adenin dinucleotid photphat NADPH Hidro nicotinamid adenin dinucleotid photphat NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân OGTT Xét nghiệm dung nạp glucose qua đường uống PPAR Peroxisom proliferator S Cơ chất (Substrate) SDS Sodium dodecyl sulfat TCA tricarbocylic acid TBS-T Tri Buffer saline T Ween 20 TZD Thiazolidinedion UV Phổ tử ngoại XRD Quang phổ nhiễu xạ tia X DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hệ sinh vật phân huỷ mannan 21 Bảng 1.2 Đặc điểm β-mannanase sinh từ số vi sinh vật 25 Bảng 1.3 Số thí nghiệm kế hoạch bậc hai Box – Behnken 30 Bảng 2.1 Các mức yếu tố ảnh hưởng 55 Bảng 2.2 Ma trận kế hoạch bậc Box – Behnken cho trường hợp k = 56 Bảng 3.1 Hàm lượng nước củ Nưa A.konjac 61 Bảng 3.2 Phương trình hồi quy hệ số tương quan đường chuẩn glucose 62 Bảng 3.3 Hàm lượng glucomannan củ nưa A.konjac khô .63 Bảng 3.4 Hàm lượng glucomannan củ nưa A konjac 64 Bảng 3.5 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) proton (1H) KGM 69 Bảng 3.6 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) cacbon (13C) KGM 70 Bảng 3.7 Kết phân tích TGA KGM 72 Bảng 3.8 Kết đo áp suất thẩm thấu KGM 74 Bảng 3.9 Hàm lượng tro kim loại nặng bột KGM 75 Bảng 3.10 Tổng hợp đặc điểm cấu trúc, tính chất glucomannnan từ củ A.konjac76 Bảng 3.11 Ảnh hưởng nồng độ axit đến hiệu suất độ nhớt sản phẩm 76 Bảng 3.12 Ảnh hưởng tỉ lệ KGM/dd axít đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng độ thu hồi sản phẩm 81 Bảng 3.13 Độ tan hiệu suất thu hồi sản phẩm 82 Bảng 3.14 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) proton (1H) LKGM-1 85 Bảng 3.15 Độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) cacbon (13C) LKGM-1 .85 Bảng 3.16 Kết phân tích TGA LKGM-1 87 Bảng 3.17 Áp suất thẩm thấu dung dịch sau thủy phân .88 Bảng 3.18 Đường kính vịng phân giải glucomannan 90 Bảng 3.19 Kết thực nghiệm theo kế hoạch Box Behnken 91 Bảng 3.20 Kết phân tích ANOVA tối ưu hóa điều kiện phản ứng thủy phân 92 Bảng 3.21 Kết phân tích phù hợp mơ hình với thực nghiệm 93 Bảng 3.22 Kết tính tìm điều kiện tối ưu 96 Bảng 3.23 1H NMR độ dịch chuyển hóa học (δ ppm) LKGM-E .99 Bảng 3.24 Độ dịch chuyển hóa học 13C - NMR (δ ppm) LKGM-E D2O101 Bảng 3.25 Kết phân tích TGA LKGM-E 103 Bảng 3.26 Áp suất thẩm thấu dung dịch sau thủy phân enzym 103 Bảng 3.27 Độ tan tính chất Konjac glucomannan sản phẩm thủy phân105 Bảng 3.28 Tỷ lệ biểu p-AMPK/ β-actin 107 Bảng 3.29 Glucose huyết ban đầu sau uống glucose 110 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học glucomannan Hình 1.2 Hình ảnh củ Nưa A.konjac trồng thử nghiệm Lâm Đồng 12 Hình 1.3 Cấu trúc số loại β,1–4 mannan/heteromannan 20 Hình 1.4 Cấu trúc phân tử ATP AMP 35 Hình 3.1 Hình ảnh củ Konjac gọt vỏ thái lát 61 Hình 3.2 Đường chuẩn glucose 63 Hình 3.3 Hình ảnh bột glucomannan thu sau sấy 64 Hình 3.4 Quá trình tách tinh bột tạp chất bột KGM 65 Hình 3.5 Phổ IR KGM 66 Hình 3.6 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR KGM 67 Hình 3.7 Phổ 13C-NMR KGM 69 Hình 3.8 Phổ 13C-NMR KGM 70 Hình 3.9 phổ HSQC KGM 71 Hình 3.10 Giản đồ phân tích nhiệt KGM 72 Hình 3.11 Giản đồ nhiễu xạ tia X KGM 73 Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ C Π/C KGM 74 Hình 3.13 Ảnh hưởng nồng độ axit đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng 77 Hình 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng thủy phân glucomannan 79 Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian đến phản ứng thủy phân glucomannan 80 Hình 3.16 Phổ IR LKGM-1 83 Hình 3.17 Phổ 1H -NMR LKGM-1 84 Hình 3.18 Phổ 13C-NMR LKGM-1 84 Hình 3.19 Giản đồ phân tích nhiệt LKGM-1 87 Hình 3.20 Mối quan hệ nồng độ áp suất thẩm thấu LKGM-1 88 Hình 3.21 Vòng phân giải glucomannan vi khuẩn Bacillus subtilis (A) mẫu chứng (B) 90 Hình 3.22 Biến đổi độ nhớt hỗn hợp phản ứng theo thời gian 90 Hình 3.23 Đường mức đáp ứng bề mặt 3D ảnh hưởng cặp yếu tố đến độ nhớt hỗn hợp phản ứng 95 Hình 3.24 Phổ IR LKGM-E 98 Hình 3.25 Phổ 1H-NMR LKGM-E 80oC D2O .99 Hình 3.26 Phổ 13C-NMR LKGM-E 80 oC D2O 100 Hình 3.27 Phổ 1H-13C-NMR-HSQC LKGM-E 80 oC D2O .101 Hình 3.28 Giản đồ phân tích nhiệt LKGM-E 102 Hình 3.29 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ nồng độ (C) Π/C LKGM-E 104 Hình 3.30 Số lần tăng mức độ biểu p-AMPK lô tế bào ủ với mẫu thử so với lô chứng 108 Hình 3.31 Hình ảnh mức độ biểu p-AMPK actin 108 Hình 3.32 Tỷ lệ phần trăm tăng glucose huyết trước sau cho uống glucose so với thời điểm ban đầu 110 Hình 3.33 Glucose huyết trước sau cho uống LKGM-E KGM 112 Bảng 3.29 Glucose huyết ban đầu sau uống glucose Thời điểm sau uống glucose Tên lô Lô (ĐC) Lô2 LKGM-E (3g/kg) Lô3 LKGM-E (6g/kg) Lô Glucomannan (6g/kg) Lô Glyclazid (10 mg/kg) Ban đầu t=0 t = 30 phút t = 60 phút t = 120 phút 4,51 ± 0,51 3,98 ± 0,44 5,32 ± 0,14 5,02 ±0.25 4,12 ± 0,25 4,42 ± 0,51 3,53 ± 0,34 5,58 ± 0,24 5,17 ± 0,31 4,04 ± 0,41 p>0,05 p>0,05 P>0,05 P>0,05 4,28 ± 0,59 3,22 ± 0,43 5,35 ± 0,55 5,05 ± 0,43 4,18 ± 0,55 P0,05 P>0,05 P0,05 P>0,05 4,4 ± 0,62 3,17 ± 0,51 4,06 ± 0,11 3,74 ± 0,29 3,17 ± 0,66 P