Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt trâu của Vườn Quốc gia Cúc Phương
PHẦN I MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật quan trọng công nghệ sinh học thực vật Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào thực vật đạt chứng tỏ khả ứng dụng hiệu nhiều lĩnh vực, đặc biệt nhân nhanh bảo tồn lồi thực vật q [1] Đặc trưng rừng nhiệt đới đa dạng loài, song thường lồi kích thước quần thể nhỏ, mật độ thấp, nhiều loài bị suy giảm mạnh tàn phá rừng Hiểu biết người mối tương tác phụ thuộc lẫn lồi hệ sinh thái cịn Do nghiên cứu để bảo tồn đa dạng sinh học cần phải tiến hành đồng thời với việc bảo tồn hiệu loài hệ sinh thái Bảo tồn nguồn gen thực vật việc cấp thiết thường xuyên nhằm bảo vệ đa dạng sinh học nước ta [12], [13] Trong kho tàng thuốc Việt Nam có nhiều thuốc q, số Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv ) loài thực vật danh mục cần bảo tồn Vườn Quốc gia Cúc Phương [11], [14] Ngoài công dụng chữa số bệnh thông thường trị ghẻ, sâu đốt, ngộ độc thức ăn hay bệnh vàng da Mắt trâu cịn phục vụ cho cơng tác nghiên cứu tìm hoạt chất phịng chống bệnh [9], [41], [42] Theo Ma cộng dịch chiết vỏ thân Mắt trâu phân tích micromeline, hợp chất alkaloids có khả kháng chủng vi khuẩn H37Rv gây bệnh lao [32] Bên cạnh đó, Mắt trâu cịn có giá trị mặt bảo tồn quần thể thực vật Vườn Quốc gia Cúc Phương Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu tác dụng chữa bệnh Mắt trâu Vì vậy, cần có nghiên cứu đầy đủ ứng dụng nhân giống bảo tồn lồi Với lý chúng tơi tiến hành đề tài: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh bảo tồn Mắt trâu Vườn Quốc gia Cúc Phương Mục đích, nội dung nghiên cứu Mục đích Xây dựng qui trình hồn chỉnh để nhân nhanh bảo tồn in vitro Mắt trâu (Micromelum hisutum Oliv.) Vườn Quốc gia Cúc Phương Nội dung Khử trùng mẫu để nuôi cấy in vitro Xác định công thức mơi trường thích hợp tạo đa chồi in vitro Xác định cơng thức mơi trường thích hợp tạo in vitro hồn chỉnh Xác định giá thể thích hợp cho in vitro ni trồng ngồi tự nhiên PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Mắt trâu Cây Mắt trâu có tên khoa học Micromelum hissutum Oliv Thuộc bộ: Rutales (Cam) Họ: Rutaceae (Cam) Đặc điểm sinh học, sinh thái Mắt trâu gỗ nhỏ cao đến 6m Thân phân cành, cành có nhiều lơng nhung, màu hung, màu xanh sẫm, kép lông chim lẻ, chét từ - 9, mọc so le, thuôn mũi mác hay mũi mác, dài 1,7 - 13cm, rộng 5cm, khơng cân góc mũi nhọn sắc, đài dài, có răng, có lơng nhung mặt Hoa trắng, hay vàng xanh, thành cụm hoa phủ lông nhung, ngắn lá, cánh hoa có lơng cứng Quả nạc dạng bầu dục, màu đỏ, cam hay có mùi thơm Mùa hoa tháng - 4, mùa chín tháng - [2], [6], [34] Cây Mắt trâu phân bố số khu vực Ninh Bình, Nha Trang, Hịa Bình, Thanh Hóa Lồi tìm thấy Ấn Độ, Malayxia, Lào, Campuchia, Thái Lan [8], [39] Lá Mắt trâu dùng trị bệnh ghẻ, nấu xông chữa bệnh vàng da hay ngộ độc thức ăn Sử dụng giã với me sau thêm muối dùng đắp vào da làm dịu đau bị sâu đốt Theo nghiên cứu tác giả Ma Cộng (2005) dịch chiết vỏ Mắt trâu (Micromelum hissutum Oliv.) chứa chất có khả kháng chủng vi khuẩn gây bệnh lao H37Rv Các thí nghiệm giai đoạn thử nghiệm chuột [32], [42] Cây Mắt trâu nằm danh sách loài thực vật cần bảo tồn VQG Cúc Phương Vì vậy, mà giá trị làm thuốc hay dùng nghiên cứu lồi cịn đóng góp vốn gen vào quần thể thực vật VQG Cúc Phương, lưu giữ bảo tồn nguồn gen phịng thí nghiệm [39], [41] Trên giới, nhờ ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật bảo tồn thành công nhiều thuốc Centella aistica, Rehmannia glutinosa [22], [38] Năm 2009 Geetha cộng thông qua phương pháp vi nhân giống hai loài Holostemma adakodien Ipomoea mauritiana đồng thời tuyên truyền cho người dân biết bảo tồn thuốc quí trước thảm họa bị tuyệt chủng [27] 2.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân giống bảo tồn nguồn gen thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật quan trọng công nghệ sinh học, tảng để nghiên cứu áp dụng công nghệ khác lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Trải qua 100 năm phát triển đạt thành tựu định lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen trồng [16] 2.2.1 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật khái niệm chung cho tất loại nguyên liệu thực vật hồn tồn ni cấy mơi trường dinh dưỡng nhân tạo, điều kiện vô trùng Bao gồm: - Nuôi cấy non trưởng thành - Nuôi cấy quan - Nuôi cấy phôi - Nuôi cấy mô sẹo - Nuôi cấy tế bào trần Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mơ tế bào thực vật tính tồn tế bào Haberlandt nêu năm 1902 Theo quan niệm sinh học đại tính tồn tế bào tế bào riêng rẽ phân hóa mang tồn lượng thơng tin di truyền cần thiết đủ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh Q trình phát sinh hình thái ni cấy mô tế bào thực vật kết q trình phân hóa phản phân hóa tế bào Trong đó: Sự phân hóa tế bào chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào mơ chun hóa, đảm nhận chức khác Khi tế bào phân hóa thành tế bào có chức riêng biệt, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi mà trường hợp cần thiết, điều kiện thích hợp chúng trở dạng tế bào phôi sinh phân chia mạnh mẽ Q trình gọi phản phân hóa tế bào ngược lại với phân hóa tế bào Phân hóa tế bào Tế bào phơi sinh Tế bào phân chia Tế bào chuyên hóa Phản phân hóa tế bào Về chất phân hóa phản phân hóa q trình hoạt hóa, ức chế gen Tại thời điểm q trình phát triển cá thể, có số gen hoạt hóa để biểu tính trạng mới, cịn số gen khác lại bị ức chế hoạt động Điều xảy theo chương trình mã hóa cấu trúc phân tử ADN tế bào, khiến trình sinh trưởng thể thực vật ln hài hịa Như vậy, kỹ thật nuôi cấy mô tế bào thực vật xét cho kỹ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi ni cấy tách rời điều kiện nhân tạo vô trùng) Đây điểm quan trọng sở đơn vị mô, tế bào, nhà sinh vật học thực kỹ thuật tiên tiến cho việc chọn, cải thiện lai tạo giống trồng [7], [10], [16] 2.2.2 Các bước nhân giống vơ tính in vitro Theo George (1993) q trình nhân giống vơ tính in vitro bao gồm bước sau: Bước 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ Trước tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận mẹ (nguồn mẫu nuôi cấy) Các cần phải bệnh, đặc biệt vi rút giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng mẹ điều kiện mơi trường thích hợp với chế độ chăm sóc phịng trừ sâu bệnh hiệu trước lấy mẫu nuôi cấy làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả sống sinh trưởng mẫu Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu cấy in vitro Các giai đoạn cần đảm bảo yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn loại mô, giai đoạn phát triển Quan trọng đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đỉnh chồi hoa, cuối đoạn thân, mảnh Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mơ ni cấy phát sinh hình thái tăng nhanh số lượng thơng qua đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định tạo phơi vơ tính Chúng ta cần phải xác định mơi trường điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu cao Theo nguyên tắc chung mơi trường có nhiều cytokinin kích thích tạo chồi Nhiệt độ nuôi cấy thường 25 27oC thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 2000 - 4000 lux Tuy nhiên, loại đối tượng ni cấy địi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy khác Bước 4: Tạo in vitro hoàn chỉnh Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Một số chồi phát sinh rễ sau chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang mơi trường khơng chứa chất kích thích sinh trưởng Bước 5: Thích ứng in vitro ngồi điều kiện tự nhiên Để đưa từ ống nghiệm vườn ươm với tỷ lệ sống cao, sinh trưởng tốt cần đảm bảo yêu cầu sau: Cây ống nghiệm đạt tiêu chuẩn hình thái định (số lá, số rễ, chiều cao cây) Có giá thể tiếp nhận in vitro thích hợp giá thể tơi xốp, thoát nước Phải chủ động điều chỉnh độ ẩm, chiếu sáng vườn ươm có chế độ dinh dưỡng phù hợp [5], [17] 2.2.3 Phương pháp nhân đa chồi Trong phương pháp nhân đa chồi, chồi tách nuôi cấy môi trường dinh dưỡng chồi bên từ nách phát triển ảnh hưởng cytokinin với nồng độ cao Vai trò cytokinin lúc ức chế ưu để chồi bên phát triển Các chồi tiếp tục chuyển sang mơi trường có bổ sung cytokinin chồi tiếp tục tạo Sau đó, chồi chuyển sang môi trường rễ đưa vườn ươm có rễ hồn chỉnh [16] Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hình thành đa chồi: Nhu cầu loại nồng độ cytokinin khác Nồng độ cytokinin thay đổi tùy theo giai đoạn ni cấy, thơng thường q trình tạo chồi người ta sử dụng auxin với nồng độ thấp, phối hợp với cytokinin nồng độ cao Không nên cảm ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin cao tạo chồi bất định mang đột biến Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng cần phải cắt bỏ chồi làm chết chồi chồi bên hoạt động Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [18] Hiện nhân nhanh phương pháp nhân chồi bên áp dụng rộng rãi nhiều lồi thực vật, q trình nhân chồi thường thực theo bước sau [10]: Cây tự nhiên Khử trùng mẫu Nhân đa chồi Cây trồng Trồng Tạo in vitro Sơ đồ tổng quát nhânbầu nhanh in vitro hoàn chỉnh tự nhiên 2.2.4 Vai trị chất kích thích sinh trưởng tái sinh in vitro Các chất kích thích sinh trưởng thực vật có vai trị quan trọng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Bằng cách cung cấp chất kích thích sinh trưởng mức độ thích hợp, điều khiển chiều hướng phát sinh hình thái mẫu ni cấy Auxin cytokinin hai chất kích thích sinh trưởng sử dụng phổ biến ni cấy mơ Đặc tính Auxin Auxin chất kích thích sinh trưởng thực vật sử dụng thường xuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với thành phần khác mơi trường dinh dưỡng để kích thích tăng trưởng mô sẹo, huyền phù tế bào điều hịa phát sinh hình thái đặc biệt sử dụng với cytokinin Sự áp dụng loại nồng độ auxin môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: Kiểu tăng trưởng phát triển cần nghiên cứu, hàm lượng auxin nội sinh mẫu nuôi cấy, tác động qua lại auxin ngoại sinh auxin nội sinh Auxin có vai trị kích thích tăng trưởng kéo dài tế bào Cùng với cytokinin nhóm auxin kích thích phân chia tế bào Các hormone nhóm có hoạt tính như: Tăng trưởng chiều dài thân, lóng, tính hướng (sáng, đất), tính ưu ngọn, kích thích rễ phân hóa mạch dẫn Tác động auxin thường liên quan tới độ dài thân, đốt, chồi chính, rễ Đối với nuôi cấy mô tế bào thực vật, auxin sử dụng để kích thích phân chia tế bào phân hóa rễ Những auxin thường dùng rộng rãi nuôi cấy mô tế bào thực vật: IBA (Indoly Butyric Acid), IAA (Indoly Acetic Acid), NAA (α - Naptalen Acetic Acid), 2,4 - D (Dichlorphenoxy Acetic Acid) [18] Đặc tính cytokinin Cytokinin dẫn xuất adenine, hormone liên quan chủ yếu đến phân chia tế bào, thay đổi ưu phân hóa chồi ni cấy mơ tế bào thực vật Các cytokinin thường xuyên sử dụng BAP (6 - Benzyl Amino Purin), kinetin (N - (2 - furfurylamin) - - H - amin ), zeatin (6 - (4 - hydroxy - 3metyl - trans - butanylamin) purin) Hàm lượng sử dụng loại cytokinin dao động từ 0,1 - 0,2 mg/l Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh tạo rễ chồi ni cấy Ngồi hai nhóm auxin cytokinin, nuôi cấy mô tế bào thực vật người ta cịn sử dụng thêm gibberellin để kích thích kéo dài tế bào, qua làm tăng kích thước chồi nuôi cấy… GA3 loại gibberellin sử dụng nhiều Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có loại mẫu cần auxin cytokinin, nhiên người ta hay dùng phối hợp auxin cytokinin tổ hợp tỷ lệ khác cho hiệu tốt [19] 2.2.5 Thành tựu bảo tồn nguồn gen trồng sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trở thành phương thức quan trọng để nhân nhanh, đặc biệt trồng khó nhân nhanh phương pháp truyền thống Dưới số thành tựu đạt • Trong nước Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật để bảo tồn lồi thực vật nhiệt đới q hiếm, có giá trị kinh tế nhà nghiên cứu quan tâm, Thông (Taxus sps.) lồi có chứa hoạt chất chữa ung thư hiệu Taxoid hợp chất số lồi thực vật có giá trị làm thuốc [20] Cây Màng tang (Litsea verticillata) loại thân gỗ có chứa số hợp chất có khả kháng HIV (+)- demethoxyepiercelsin verticillatol [29], [40] Tác giả Lê xuân Đắc Cộng thành công việc nhân nhanh bảo tồn Màng tang (Litsea verticillata) tìm thấy Vườn Quốc gia Cúc Phương kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật [4] Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) biết vị thuốc quí việc chữa số bệnh ung thư Tác giả Lưu Trường Sinh 10 Kết bảng cho thấy, chồi Mắt trâu tạo rễ tất mơi trường có chất kích thích, trừ mơi trường đối chứng MS khơng có chất kích thích sinh trưởng nên chồi nuôi cấy không xuất rễ Tuy nhiên, môi trường có chất kích thích sinh trưởng IBA tỷ lệ rễ môi trường MTI1, MTI2 tương ứng với nồng độ IBA (0,3; 0,6) mg/l tương đối thấp đạt 28,57%; 51,43%, rễ nhỏ, ngắn phát triển chậm yếu Trên môi trường MTI3, MTI5 tỷ lệ rễ đạt 71,43%; 68,57% quan sát phía gốc có xuất khối mơ sẹo xốp, thân có nhiều chồi nách nhỏ, điều ảnh hưởng không tốt Riêng môi trường MTI5 (1,5 mg/l IBA) nồng độ cao môi trường MTI3 (0,9 mg/l IBA) lại cho tỷ lệ rễ thấp nồng độ chất kích thích sinh trưởng cao gây hiệu ngược lại ức chế trình phát sinh rễ Trên mơi trường MTI4 có tỷ lệ rễ cao chiếm tới 85,71%, rễ to nhiều dài Cây phát triển tốt màu sắc xanh đậm dày, gốc có khối mơ sẹo nhỏ xuất Vậy thí nghiệm chúng tơi lựa chọn môi trường MTI4 (1,2 mg/l IBA) môi trường thích hợp để tạo rễ số chồi rễ/ CTMT 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 MTI1 MTI2 MTI3 CTMT 32 MTI4 MTI5 Hình 8: Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Mắt trâu 4.3.2 Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Chúng thử nghiệm ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến hình thành rễ Mắt trâu với nồng độ khác là: 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5 (mg/l) NAA Kết thể bảng 6, hình 9, hình 10 Bảng 6: Ảnh hưởng NAA lên hình thành rễ CTMT NAA (mg/l) Số chồi nuôi cấy Số chồi rễ Tỷ lệ rễ (%) ĐC 35 0 MTN1 0,3 35 24 68,57 MTN2 0,6 35 29 82,86 MTN3 0,9 35 32 91,43 MTN4 1,2 35 26 74,29 MTN5 1,5 35 23 65,71 Qua quan sát phát triển hình thành rễ, thân màu sắc hình thành chồi thấy: Trên môi trường MTN3 phát triển tốt tỷ lệ tạo rễ cao đến 91,43%, rễ to dài nhiều, xanh to khỏe có khối mơ sẹo nhỏ gốc, khơng có chồi gốc Cịn mơi trường MTN1, MTN2, MTN4, MTN5 tỷ lệ rễ tương đối cao gốc lại có nhiều mơ sẹo xốp nên không tốt cho việc Riêng hai môi trường MTN4 (1,2 mg/l), MTN5 (1,5 mg/l) NAA nồng độ NAA cao ức chế hình thành rễ mà tỷ lệ rễ giảm 33 dần nồng độ NAA cao cụ thể MTN4 (74,29%), MTN5 (65,71%) Vì vậy, chúng tơi lựa chọn môi trường MTN3 (0,9 mg/l NAA) môi trường tạo rễ thích hợp số chồi rễ/ CTMT 100,00 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 MTN1 MTN2 MTN3 MTN4 MTN5 CTMT Hình 9: Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Mắt trâu Qua hai kết bảng bảng thực tế q trình làm thí nghiệm chúng tơi rút kết luận sau: Môi trường MTN3 mơi trường thích hợp để tạo rễ Mắt trâu Hình 10: Cây Mắt trâu in vitro mơi trường tạo rễ sau 30 ngày 4.4 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống bầu Cây có đầy đủ thân rễ đưa trồng bầu, giai đoạn cần phải có chế độ chăm sóc đặc biệt phải đảm bảo độ ẩm ánh sáng vừa phải để thích nghi dần với điều kiện tự nhiên 34 Kết thống kê sau tháng trồng bầu trình bày bảng 7, hình 11 Bảng 7: Ảnh hưởng giá thể đến trồng bầu Số Số Cây sống trồng sống sót (%) TT Công thức Tỷ lệ Đất trồng 34 14 41,18 Đất trồng cây: Trấu hun 1:1 34 26 76,47 Trấu hun 34 32 94,12 Từ kết bảng ta rút nhận xét: Trên giá thể đất trồng tỷ lệ sống đạt thấp 41,18% non yếu mà lại trồng giá thể khơng tơi xốp nên khơng thích nghi với loại giá thể nên có 14 sống tổng số 34 trồng Đối với giá thể đất trồng: Trấu hun tỷ lệ sống đạt 76,47% tương đối cao khơng phải giá thể thích hợp để trồng số khơng thích nghi bị chết Còn giá thể trấu hun tỷ lệ sống cao đạt 94,12% giá thể thống khí tơi xốp mơi trường lý tưởng cho phát triển tốt giai đoạn đầu, tán rộng Vì vậy, chúng tơi lựa chọn giá thể thích hợp để trồng Mắt trâu ngồi tự nhiên giá thể trấu hun 35 A B C D Hình 11: Cây Mắt trâu trồng loại giá thể A Giá thể đất trồng; B Giá thể đất trồng: trấu hun; C Giá thể trấu hun; D Cây Mắt trâu trồng vườn ươm sau tháng PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Bước đầu nhân thành công Mắt trâu phương pháp nuôi cấy in vitro Môi trường thích hợp để tạo đa chồi Mắt trâu môi trường MT9 (MS + 30 g/l đường saccharose + g/l agar + 1,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l IBA) với hệ số nhân chồi 3,29 lần Mơi trường tốt để tạo hồn chỉnh môi trường MTN4 (MS + 30 g/l đường saccharose + g/l agar + 0,9 mg/l NAA) với tỷ lệ tạo rễ 91,43% sinh trưởng, phát triển tốt Giá thể thích hợp để trồng sau in vitro cho Mắt trâu trấu hun với tỷ lệ sống 94,12% Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu sinh trưởng phát triển Mắt trâu ni cấy in vitro ngồi tự nhiên 36 37 PHỤ LỤC Các thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) MnSO4.H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Vitamin Nồng độ (mg/l) Thiamine HCl 0,1 Nicotinic Acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glyxine 2,0 38 Một số hình ảnh minh họa làm thí nghiệm Hình 12: Quan sát mẫu ni cấy phịng phịng cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học Hình 13: Thao tác cấy chuyển mẫu ni cấy box vô trùng 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng, NXB Nông nghiệp Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, NXB Y học, TP HCM Nguyễn Thành Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), Kết bước đầu nhân giống in vitro Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.) kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học Kỹ thuật: 450-453 Lê Xuân Đắc, Hà Hồng Hải, Đào Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Danh, Lê Thị Xn, Nơng Văn Hải, Lê Trần Bình (2004) Nhân nhanh bảo tồn Màng tang (Litsea verticillata) tìm thấy Vườn Quốc gia Cúc Phương kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4): 479-486 Lê Văn Hồng (2007), Cơng nghệ ni cấy mơ tế bào thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Phạm Hoàng Hộ (1993), Cây cỏ Việt Nam, tập 2(2), NXB Montréal 528 Nguyễn Như Khanh (2006), Sinh học phát triển thực vật, NXB Giáo dục Hà Nội Phùng Ngọc Lan, Nguyễn Nghĩa Thìn, Nguyễn Bá Thụ (1996), Tính đa dạng thực vật Cúc Phương, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Đỗ Tất Lợi (2005), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 526-527 40 10 Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại Học Quốc gia Hồ Chí Minh 11 Trần Kim Liên (2003), Danh lục thực vật Việt Nam 2, NXB Nơng Nghiệp 969 12 Nguyễn Hồng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội 13 Nguyễn Hoàng Nghĩa (2006), Một số lồi bị đe dọa Việt Nam, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội 14 Hoàng Thị Sản, Hoàng Thị Bé (2006), Phân loại học thực vật, NXB Đại học Sư Phạm 15 Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), nghiên cứu hồn thiện qui trình nhân giống Trinh nữ hoàng cung phương pháp in vitro Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, NXB Khoa học Kỹ thuật 16 Nguyễn Đức Thành ( 2000), Nuôi mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội 17 Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông Nghiệp TPHCM 18 Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 19 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục Hà Nội 20 Lê Thị Xuân, Schemluck M, Mai Văn Trì (1996) Cây Thơng đỏ Lâm Đồng (Taxus walli chiana) nguồn nguyên liệu quí để sản xuất thuốc chữa ung thư nhóm Taxoid, Tạp chí hóa học, 34(1): 80-81 Tài liệu tiếng Anh 21 Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignacimuthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnus catus (Verbenaceae) A 41 valuable medicinal plant, In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 44(5): 436-441 22 Bangaru NT, Nageswara RS, Sarada MN, Jagan MYSYV, Sudhakar P (2010), Conservation of an endangered medicinal plant Centella asiatica through Plant Tissue culture, Drug Invention Today, 2(1): 17-21 23 Bedir E, Lata H, Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), Micropropagation of Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species, Planta Med: 86-88 24 Chan LK, Lim SY, Pan LP (2009), Micropropagation of Gynura procumbens (Lour.) Merran important medicinal plant, Journal of Medicinal Plants, 3(3): 105-111 25 Dibax R, Eisfeld CL, Cuquel FL, Koehler H, Quoirin M (2005), Plant regeneration from cotyledonary explants of Eucalyptus camaldulensis, Science Agriculture, 62: 406-412 26 Geetha SP, Raghu AV, Martin G, George S, Balachandran I (2009), In vitro Propagation of Two Tuberous Medicinal Plants: Holostemma adakodien and Ipomoea mauritianaProtocols for In vitro Cultures and Secondary Metabolite Analysis of Aromatic and Medicinal Plants, Springer Protocols, (547)7: 81-92 27 George EF (1993), plant propagation by tissue culture (2), Exegetics Ltd, Edin 28 Guillaumin A (1912), Rutacéae, Flore Gesnesneerale de L Indo-chine 29 Hoang VD, Tan GT, Zhang HJ, Tamex PA, Hung NV, Cuong NM, Soejarto DD, Fong HH, Pezzuto JM (2002), Natural anti - HIV agents part I : (+)- demethoxyepiexcelsin and verticillatol from Litsea verticillata, Phytochemistry, 59(3): 325-329 42 30 Hussain MT, Chandrasekhar T, Rama GG (2008), In vitro propagation of Crotalaria verrucosa L animportant ethnobotanical plant, Journal of Medicinal Plants, 2(9): 242-245 31 Kalidass C, Mohan VR (2009), In vitro Rapid clonal propagation of Phyllanthus urinaria Linn (Euphorbiaceae), A Medicinal Plant, 1(4): 56-59 32 Ma C, Case RJ, Wang Y, Zhang HJ, Tan Gt, Nguyen Van Hung, Nguyen Manh Cuong, Eranzblau SG, Soejato DD, Fong HH, Panli GE (2005), Anti tuberculosis consituents from the Stembark of Micromelum hissutum, Planta Med, 71(3): 261-267 33 Mahender A, Srinivasa RK, Venugopal RK (2009), Efficient in vitro Regeneration and Micropropagation of Medicinal Plant Momordica tuberosa Roxb., Journal of Herbs, Spices & Medicinal Plants, 2(15): 141-148 34 Nguyen Ngoc Chinh, Cao Thuy Chung, Vu Van Can, Nguyen Xuan Dung, Nguyen Kim Đao, Tran Hop, Tran Tuyet Oanh, Nguyen Boi Quynh, Nguyen Nghia Thin (1996), Viet Nam Forest trees, Agricultural Publishing house 35 Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L., Journal of Medicinal Plants, 3(1): 031-034 36 Park AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered medicinal plant, Planta Med, 69(6): 571-573 37 Samuel K, Debashish D, Madhumita B, Padmaja G, Siva RP, Murthy BRV, Rao PS (2009), In vitro germination and micropropagation of Givotia rottleriformis Griff., In vitro Cellular & Developmental Biology 43 38 Sang Un Park, Nam I Park, Yong Kyoung Kim, Seung Yeon Suh, Seok Hyun Eom, Sook Young Lee (2009), Application of plant biotechnology in the medicinal plant, Rehmannia glutinosa Liboschitz, Journal of Medicinal Plants, 3(13): 1258-1263 39 Soejarto DD, Nguyen Tien Hiep, Phan Ke Loc, Nguyen Manh Cuong, Le Kim Bien, Tran Đinh Đai, Regalado Jt, Kadushin MR, Nguyen Thi Thanh Huong, Truong Quang Bich (2004), Seed plants of Cuc Phuong National Park Viet Nam, Documented Checklist 40 Zhang HJ, Tan GT, Santarsiero BD, Mesecar AD, Hung NV, Cuong NM, Soejarto DD, Pezzuto JM, Fong HH (2003), New Sesquiterpenes from Litsea verticillata, J Nat Prod, 66(5): 609-615 Tài liệu từ Internet 41 http://lib.ucr.edu/agnic/webber/VollChapter3.html 42 http://www.lrc-hueuni.edu.vn/dongy/index.html 44 MỤC LỤC 45 ... dân biết bảo tồn thuốc quí trước thảm họa bị tuyệt chủng [27] 2.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật nhân giống bảo tồn nguồn gen thực vật Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kỹ thuật quan... tác dụng chữa bệnh Mắt trâu Vì vậy, cần có nghiên cứu đầy đủ ứng dụng nhân giống bảo tồn loài Với lý tiến hành đề tài: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh bảo tồn Mắt trâu. .. Bao gồm: - Nuôi cấy non trưởng thành - Nuôi cấy quan - Nuôi cấy phôi - Nuôi cấy mô sẹo - Nuôi cấy tế bào trần Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật tính tồn tế bào Haberlandt nêu
