Đang tải... (xem toàn văn)
Đu đủ (Carica papaya L.) là cây ăn quả có giá trị kinh tế cao, quả đu đủ rất giàu dinh dưỡng. Ngoài ra, nhựa đu đủ còn là nguồn nguyên liệu để tách papain, một loại enzym đã được thương mại hoá s
MỞ ĐẦU Đu đủ (Carica papaya L.) ăn có giá trị kinh tế cao, đu đủ giàu dinh dưỡng Ngồi ra, nhựa đu đủ cịn nguồn nguyên liệu để tách papain, loại enzym thương mại hố sử dụng cơng nghiệp thực phẩm, dược phẩm thuộc da Ở Việt Nam, diện tích trồng đu đủ khoảng 2500 ha, với sản lượng hàng năm khoảng 100 nghìn tấn, có giá trị tương đương 4,5 triệu USD [6,34] Đu đủ trồng nhiệt đới cận nhiệt đới mắc nhiều bệnh, bệnh đốm vịng papaya ringspot virus (PRSV) gây nguyên nhân làm giảm suất chất lượng đu đủ Bệnh truyền loài rệp nên lan rộng nhanh chóng Đến nay, tồn diện tích trồng đu đủ nước ta vùng khác giới Australia [39], Thái Lan [46] Hawaii [37,45]… bị nhiễm bệnh virus đốm vòng Những biện pháp truyền thống sử dụng để ngăn cản lan truyền PRSV mang tính chất phịng trừ chống lại bệnh này, lại địi hỏi nhiều thời gian cơng sức Gần đây, với việc áp dụng kỹ thuật tiên tiến sinh học phân tử vào nghiên cứu chọn tạo giống trồng, đặc biệt sử dụng vật liệu di truyền từ virus gây bệnh chuyển vào để tạo trồng chuyển gen kháng bệnh virus thu kết đáng khích lệ, đu đủ chuyển gen CP (coat protein) kháng PRSV thương mại hoá giới [25], khoai tây chuyển gen NIb kháng PVY (potato virus Y) [18] Một thách thức tồn phổ kháng bệnh chuyển gen phụ thuộc vào độ tương đồng mặt di truyền chủng virus có gen sử dụng để tạo chuyển gen dòng virus gây bệnh tự nhiên Chẳng hạn giống đu đủ chuyển gen CP Hawaii hồn tồn khơng có khả kháng lại dịng PRSV Việt Nam Vì vậy, việc khảo sát tính đa dạng di truyền gen chuyển có ý nghĩa quan trọng việc nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus Nghiên cứu đánh giá tính đa dạng dịng virus gây bệnh đốm vịng đu đủ Việt Nam, Chu Hồng Hà cộng (2004) cho biết 16 dòng PRSV phân lập từ khu vực khác Việt Nam có mức độ giống trình tự gen CP từ 89,7% đến 99,8% Trong dịng virus Tun Quang, Kon Tum, Sài Gịn Cần Thơ có tính đại diện cao [4] Trên sở đó, chủng PRSV lựa chọn cho nghiên cứu “Tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hoá Nuclear Inclusion Body protein (NIb) số dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ (Papaya Ringspot virus-PRSV) Việt Nam” nhằm tìm hiểu đa dạng mức độ phân tử gen NIb dòng virus tạo nguyên liệu cho nghiên cứu tạo đu đủ chuyển gen kháng PRSV Vit Nam Chơng Tổng quan tài liệu 1.1 Giới thiệu chung đu đủ 1.1.1 Phân loại Cây đu đủ (Carica papaya L.) thuộc ngành Mộc lan (hạt kín, Magnoliophyta), lớp Mộc lan (hai mầm, Magnoliopsida), phân lớp Sổ (Dilleniidae), liên Hoa tím (Violananae), Hoa tím (Violales), họ Đu đủ (Caricaceae) [11] Carica chi lín nhÊt hä víi 23 loµi chi lín nhÊt hä víi 23 loµi 1.1.2 Ngn gèc MỈc dï cã ý kiÕn cho r»ng ngn gèc C papaya châu Mỹ nhiệt đới [32], nhng bắt nguồn từ vùng đất thấp thuộc phía đông Trung Mỹ, từ Mexico tới Panama [38] Hạt đợc phát tán tới Carribean Đông Nam nhờ ngời thám hiểm Tây Ban Nha vào kỷ 16, từ đợc lan nhanh chóng tới ấn Độ, Thái Bình Dơng châu Phi [44] Đu đủ đà đợc trồng Việt Nam cách vài trăm năm đợc trồng phổ biến vờn từ Bắc chí Nam [10] Theo nhà khoa học, giống đu đủ nhập vào nớc ta hạt hạt đu đủ vừa nhiều, vừa nhỏ, lại bảo quản lâu Bắt đầu từ cha cố ngời Pháp, Tây Ban Nha khoảng kỷ 17, sau chuyên gia nông nghiệp Pháp, Mỹ nhiều quốc tịch khác, giống đu đủ đà vào Việt Nam Đu đủ lại giống ăn ngắn ngày thụ phấn ngoại hoa, nhiều biến dị Nhiều giống đà hình thành từ địa phơng với tên gọi không thống [10] 1.1.3 Giá trị sử dụng Trớc hết đu đủ loại thực phẩm thông dụng giàu dinh dỡng Quả chín ăn bổ dỡng có vị thơm ngon, chứa nhiều vitamin muối khoáng (Bảng 1) Quả đu đủ dùng làm rợu, mứt đờng, sấy khô sắc đờng kính [44] Quả xanh, hoa đợc sử dụng nh loại rau ăn chế biến số ăn truyền thống (nh hầm thịt xanh có chứa nhiều enzym có tác dụng giống nh pepsin dày, giống trypsin tụy việc tiêu hoá chất thịt, hay nấu cháo thông thảo, ý dĩ móng dò cho phụ nữ cho bú, hay chế biến bún chả Hà Nội tiếng).) Hơn nữa, đu đủ đợc sử dụng công nghiệp Lá xanh có chứa mét sè protein vµ alkaloid øng dơng quan träng công nghiệp dợc phẩm Trong papain enzym thuỷ phân quan trọng đợc sản xuất từ nhựa non, xanh đà đợc thơng mại hoá, sử dụng công nghiệp đồ uống, thức ăn, dợc phẩm, bao gồm sản phẩm keo dính, thị bia lạnh, làm mềm thịt, thuốc chữa bệnh tiêu hoá chứng hoại th Papain đợc sử dụng công nghiệp dệt để kéo tơ, làm mềm len công nghiệp mỹ phẩm, xà phòng, dầu gội đầu [39,44] Bảng Thành phần dinh dỡng đu đủ chín (trên 100g) [43] STT Thành phần Năng lợng 100g chín 35 59 cal 2 10 11 12 13 14 15 Níc Protein ChÊt bÐo Carbonhydrat Canxi Photpho S¾t Natri Kali Caroten Vitamin B1 Vitamin B2 Vitamin B5 Vitamin C 88,40 – 90,70 g 1,00 – 1,50 g 0,10 g 7,10 – 13,50 g 11 – 31 mg – 17 mg 0,60 – 0,70 mg – mg 39 – 337 mg 1,16 – 2,43 mg 0,03 – 0,08 mg 0,70 – 0,15 mg 0,10 mg 69,30 71,00 mg Đặc biệt đu đủ có tác dụng nh vị thuốc Papain có tính chất làm dễ tiêu hoá giải độc Nó làm triệt tiêu progesteron, hormon sử dụng cần thiết chuẩn bị cho tử cung thụ thai trì sống cho bào thai sau Hạt đu đủ chứa myrosin kali myronat kết hợp với tạo thành tinh dầu mùi diêm sinh hắc Quả xanh đợc định dùng chứng thiểu tiêu hoá, dày tụy, giảm dịch vị hay lên men dày, viêm dày mÃn tính, lên men ruột viêm dày ruột non trẻ em Hạt thờng dùng làm thuốc trị giun Rễ dùng trị sốt rét làm thuốc lợi tiểu Lá dùng tiêu mụn nhọt, nấu nớc dùng tẩy vết máu vải rửa vết loét, vết thơng, sát trùng Nhựa bôi mặt nạ bị tàn nhang vết nhơ khác da, hắc lào phát, loại lở sần da ngoan cố Hoa đực dùng trị ho gà [2] Nh đu đủ cã Ých cho ngêi, cã thĨ sư dơng ë tất phần, từ hoa, quả, lá, rễ nhựa 1.1.4 Năng suất, chất lợng Sản lợng đu đủ chín nớc ta ớc tính đạt 100.000 tấn/năm Mỗi kilôgam chín trị giá khoảng 2500đ đến 3500đ tổng giá trị đạt từ 250 - 350 tỉ đồng (khoảng 15 -20 triệu đôla Mỹ) [34] Tổng sản lợng đu đủ tơi giới năm 1995 ớc tính đạt triệu tấn, đạt giá trị khoảng 1,5 đến tỉ đôla Mỹ [34] Bảng Sản lợng đu đủ hàng năm số nớc [12] Nớc sản xuất Thế giới + châu Phi Tổng sản lợng năm ( x1000 tấn) 1989-1991 1995 1996 3625 5091 5011 786 780 786 1997 5024 780 + B¾c Mü 404 591 599 599 + Nam Mỹ 1263 2029 2090 2105 + châu 1156 1610 1518 1520 - Indonexia 342 597 500 500 - Ên §é 399 490 500 500 - Trung Quèc 94 142 143 143 - Th¸i Lan 100 120 115 115 - ViƯt Nam 54 57 58 61 1.1.5 Ph©n bè Bảng Vùng phân bố tập trung đu ®đ ë ViƯt Nam STT Vïng ph©n bè DiƯn tÝch (ha) Vùng núi Trung du phía Bắc (Sơn La, Lạng Sơn) 500 Đồng sông Hồng (Hà Nội, Hng Yên, Nam Hà, Ninh Bình) 250 Ven biển miền Trung (Nghệ An, Thanh Hoá) 100 Đồng sông Mê Kông (Ninh Thuận, Nha Trang, 500-550 Tây Ninh, Tiền Giang) Đu đủ đợc trồng tất nớc nhiệt đới nhiều vùng cận nhiệt đới giới [39] nớc ta đu đủ đợc trồng vờn nhà (từ đến 10 cây) gần 50% hộ nông dân Đu đủ đợc trồng tập trung nông trờng trang trại vùng đồng sông Hồng, ven biển miền Trung, đồng sông Mê Kông sờn núi đá vôi Tổng diện tích vào khoảng 2500 gồm khoảng 1250 trồng tập trung (Bảng 3) 1250 trồng vờn nhà [34] 1.1.6 Bệnh đu đủ - Bệnh đốm vòng: Còn gọi bệnh đốm hình nhẫn bệnh phổ biến đu đủ nớc ta nhiều nớc khác giới, đợc coi trở ngại lớn cho nghề trồng ®u ®đ Cã thĨ nãi ë ®©u cã trång ®u ®đ lµ ë ®ã cã bƯnh nµy BƯnh papaya ringspot virus gây Đặc điểm bệnh làm lùn cây, sản lợng bị giảm, bị khảm biến dạng, tạo đốm có dạng nh vòng màu xanh mờ quả, cuống hay tạo sọc xanh thân cuống chín, vòng lộ rõ có màu vàng, bị nhạt, virut đà làm giảm lợng đờng mặt gần đỉnh sinh trởng, vùng mô gân phụ gân nhánh bị nhăn phồng Bìa non bị vòng vào theo mặt dới Bìa già lên [5] Hình A: Hình ảnh đu đủ không nhiễm bệnh B,C,D: Hình ảnh vờn, cây, đu đủ bị nhiễm PRSV - Bệnh khảm: papaya mosaic virus gây Giống nh bệnh đốm vòng, bệnh khảm bệnh phổ biến đu đủ Cây bệnh có bị khảm gồm nhiều vết xanh vàng lẫn lộn, khảm nặng, biến sang màu vàng Lá bệnh bị nhỏ lại, biến dạng, số thuỳ gia tăng, nhăn phồng Lá bị rụng nhiều, trừ lại chùm bị khảm vàng Quả nhỏ biến dạng, chai sỵng [5] - BƯnh thèi gèc: nÊm Pythium spp gây ra, làm cho vàng bị rụng, gốc thân nơi tiếp giáp mặt đất bị úng thối, bị đổ chết - Bệnh cháy lá: nấm Helminthosporium gây ra, làm chóp bị đốm úng nớc, lan dần vào bên lá, làm bị nâu khô Nếu nhiễm nặng, cuống bị héo, mềm bị rụng [5] - Bệnh đốm lá: nấm Phyllosticta sulata gây Trên đốm bệnh có hình tròn, hình trứng thon dài hay bất dạng Vùng vết bệnh có màu bạc trắng, viền có màu vàng hay nâu, vùng bệnh khô mỏng dần bị tách [5] - Bệnh phấn trắng: nấm Odium caricae gây hại Lá bệnh bị đóng phấn màu trắng mặt dới, nặng phát triển kém, biến dạng Quả bị đốm phấn trắng tròn bầu dục phát triển - Bệnh thối quả: nhiều loại nÊm (Rhizopus, Colletotrichum, Ascochyta, Botryodiplodia, Phomopsis, Macrophoma, Fusarium, Alternaria) g©y c¸c triƯu chøng kh¸c [5] - BƯnh tun trùng (Meloidogyne incognita Rotylenchulus reniformis): phá hại rễ Cây nhiễm nặng bị chết lớn giảm sức tăng trởng, dùng thc trÞ tun trïng nh Mocap tíi xung quanh vïng rễ [5] 1.2 Giới thiệu virut gây bệnh đốm vòng đu đủ (PRSV) 1.2.1 Phân loại PRSV virut thùc vËt, thuéc chi potyvirus, hä potyviridae [29] PRSV đợc chia thành hai chủng dựa khả lây nhiƠm cđa chóng lµ: PRSV-w vµ PRSVp PRSV-p lµ virut phổ biến gây thiệt hại lớn tới đu đủ bầu bí khắp giới, PRSV-w ảnh hởng tới họ bầu bí, nhng thực tế không tìm thấy PRSV-P bầu bí, mà tìm thấy qua thí nghiệm [18] PRSV đợc tìm thấy lần vào năm 1949 phân lập virut từ đu đủ Hawaii sau đợc tìm thấy nhiều nớc khác giới [30] Hai chủng có quan hệ gần gũi với nhau, PRSV-p tiến hoá từ PRSV-w đột biÕn [16] 1.2.2 CÊu tróc PRSV kh«ng cã vá bäc, nucleocapsid có dạng hình sợi, xoắn, với chiều dài trọn vẹn 760-800nm, đờng kính 12nm (Hình 2) Virion chứa 5,5% axit nucleic sợi ARN đơn dơng liên kết với protein (VPg) đầu có đuôi poly(A) đầu [19,29] Hình Cấu trúc PRSV A: PRSV d íi hiĨn 10326 vi ®iƯn tư, B: CÊu trúc bêntrừ Hệ gen PRSV dài kính khoảng nucleotit, ngoại đầu poly(A), chứa khung đọc mở lớn vị trí nucleotit 86-88 kết thúc vị trí 10118-10120, mà hoá cho polyprotein với 3344 axit amin [24] Polyprotein đợc tự thuỷ phân tạo 12 protein có protein NIb, enzym polymerase cần thiết cho tái ARN virut Trình tự bảo thủ cao AAAUAAAANANCUCAACACAUA đầu PRSV đóng vai trò quan trọng cho tái potyvirus Tổ chức gen PRSV đ ợc đa tạm thời VPg-5 leader-63K NT-52K HC-Pro-46K-72K CI-6K-48K NIa-59K NIb-35K coat protein- kh«ng m· hãa 3’- vïng poly(A) (Hình 3) [48] Hình Bản đồ tổ chức genom PRSV 1.2.3 Đặc tính gây bệnh PRSV gây bệnh không truyền qua hạt giống, chúng lây hai cách: Một tiếp xúc giới (thông qua vết thơng giới trình canh tác ngời vô ý tạo ra, ma gió gây xây sát hay côn trùng hay động vật khác) Hai côn trùng môi giới chủ yếu loài rệp thuộc họ Aphididae nh Aphis gosipii, Aphis crasivora, đặc biệt loài rệp Myzus persicae, loài rệp thờng gây hại nhiều cho loại rau cải, bầu bí, mớp, da Bệnh lây lan nhanh, đợc 5-6 tháng tuổi trở lªn [13] 1.3 Gen NIb cđa PRSV 1.3.1 CÊu tróc cđa gen NIb Gen NIb (nuclear inclusion body) n»m gen NIa gen CP, có kích thớc khoảng 1554 bp, nằm từ vị trí nucleotit 7646 đến 9199 1.3.2 Vai trò protein NIb Protein NIb ARN polymerase phơ thc ARN (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) cđa virut, chịu trách nhiệm tái phân tử ARN dơng ©m cđa virut [20] Cã mét vµi dÉn chøng thùc nghiệm trực tiếp protein NIb potyvirus: Thứ nhất, đặc điểm trình tự bật protein NIb motif glycine-aspartate-aspartate (GDD) đặc trng cho phần lớn virut ARN vi khuẩn, động vật thực vật [32] Khi so sánh trình tự RdRp virut ARN dơng phân tích tiến hoá phân loại tất virut thành lớp, bộ, họ chi [32,33,17] Thứ hai, gần ngời ta đà chứng minh đợc protein NIb có hoạt động RdRp [36] Họ đà tìm thấy protein NIb có tơng tác với protein NIa CP tế bào nấm men Protein NIb tơng tác với vùng VPg protein NIa tơng tác đòi hỏi vị trí gắn ARN chức Tơng tác quan träng cho viƯc kÝch thÝch tỉng hỵp ARN virut tế bào nhiễm Hoạt động polymerase protein NIb đợc kích thích protein NIa VPg Tơng tác protein CP với NIb có khả thay đổi motif GDD Vai trò tơng tác tới hoạt động enzym protein NIb chức CP cha rõ ràng, nhng cần thiết cho việc tổng hợp ARN tế bào nhiễm virut [22,27] Ngoài chức RdRp, protein NIb TEV (tobacco etch virus) có chức khác, bao gồm hoạt động dịch chuyển nhân [35] NIb chứa hai dấu hiệu định vị nhân độc lập (NLS I NLS II) NLS I n»m ë vÞ trÝ axit amin tới 17, NLS II nằm axit amin 292 316 Đột biến điểm cộng gộp dẫn đến thay gốc NLS, làm hoạt động dịch chuyển nhân Những đột biến làm khuếch đại ARN TEV đợc đa vào genom virut Việc khả khuếch đại đột biến NLS đợc bổ sung vào dịch chuyển (in trans) tế bào truyền tin biểu protein NIb chức Điều chứng tỏ NLS chồng lớp cần thiết cho chức dịch chuyển-hoạt động NIb Thực tế chức in trans NIb có nghĩa phải tơng tác với nhiều thành phần khác máy chép genom Đột biến điểm cộng gộp ảnh hởng motif GDD NLS II vùng trung tâm protein NIb, nhng đột biến ảnh hởng tới NLS I gần đầu N, làm giảm tơng tác Vùng C-terminal proteinase (Pro) NIa, vùng N-terminal VPg, tơng tác với NIb Tác ®éng cđa nh÷ng ®ét biÕn NIb vïng NLS I, NLS II, motif GDD tới tơng tác NIb Pro-domain giống với ảnh hởng đột biến tới tơng tác chiều dài đầy đủ NIb NIa [36] NIb điều khiển trình tái phức tạp thông qua tơng tác với Pro-domain cđa NIa RdRp cÇn thiÕt cho sù chÐp genom virut RdRp thành phần khác virut tế bào chủ, tạo thành phức hợp chép thực trình tái genom virut RdRp đóng vai trò quan trọng giai đoạn sớm tái virut làm tăng khả ức chế enzym này, đợc xem nh chìa khoá tổng hợp phân tử đặc biệt, ví dụ scFv ức chế hoạt động enzym RdRp Nói cách khác, việc ngăn hay ức chế hoạt động RdRp phá vỡ tái virut giai đoạn sớm hiệu [26] 1.4 Các nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virut PRSV nguyên nhân gây thiệt hại lớn tới suất chất lợng đu đủ nhiều loại trồng khác có giá trị Việt Nam nh giới Vì vậy, giới đà có nhiều nơi nghiên cứu PRSV Một số gen PRSV nh gen CP đà đợc nghiên cứu kỹ đà chuyển vào để tạo đu đủ chuyển gen Nổi bật phòng thí nghiệm trờng đại học Hawaii đại học Cornell, Mỹ Hai nơi đà tiên phong việc chuyển gen CP vào đu đủ để kháng bệnh đốm vòng đà mở phơng pháp cho việc tạo giống trồng kháng bệnh virut Các nhà khoa học đà đa gen CP dòng virut PRSV HA 5-1 vào vectơ pGA482 chuyển thành công vào giống đu đủ "Sunset" súng bắn gen, tạo hai dòng đu đủ mang tên 55-1 63-1 có mang gen CP genom đà kiểm tra lai Southern ELISA Kết thử nghiệm khả kháng bƯnh cđa thÕ hƯ R1 tõ dßng 55-1 cho thÊy chóng cã tÝnh kh¸ng bƯnh rÊt cao (chØ cã 5% 128 đợc thử nhiễm bệnh) dòng virut phân lập Hawaii, nhng không kháng đợc dòng phân lập từ nơi khác Dòng 55-1 đà đợc lai với giống Kapoho tạo giống đu đủ "Rainbow" đà đợc đăng ký quyền trở thành giống đu đủ chuyển gen thơng mại hoá giới có khả kháng lại PRSV [9] Ngoài ra, gen NIb PRSV đợc quan tâm nghiên cứu Đà có nhiều nớc phân lập xác định trình tự gen NIb nh Thái Lan, Poonpipit cộng (2001) đà phân lập đợc gen NIb cđa PRSV cã kÝch thíc 1596bp [40]; ë Trung Quốc, Ye cộng (2002) phân lập đợc gen NIb cđa PRSV cã kÝch thíc 1600bp [47] Nhng việc nghiên cứu chuyển gen NIb vào đu đủ để tạo kháng bệnh đợc tiếp tục tiến hành, cha có giống thơng phẩm đợc đa thị trờng Tuy nhiên, đà có nhiều trồng chuyển gen NIb kháng virut gây bệnh khác giới đợc tạo nh đậu, thuốc lá, khoai tây Năm 1998, Jones cộng đà tạo đợc ba dòng ®Ëu chun gen NIb kh¸ng PSbMV (pea seed-borne mosaic potyvirus), dòng PSbMV-DPD1 biểu tính kháng cao lần nhiễm Theo ông, tính kháng đậu phụ thuộc vào mật độ virut nhiễm số copy gen NIb [31] Khoai tây đối tợng trồng đợc nghiên cứu nhiều chuyển gen NIb kháng loại virut khác nh PVY (potato virus Y), PLRV (potato leafroll virus) Năm 2004, Schubert cộng đà tạo đợc khoai tây chuyển gen NIb kháng PVY nhà kính [18,21] thuốc lá, Suzuki cộng đà chuyển gen chép ARNs CMV (cucumber mosaic virus) thành công tạo dòng thuốc V1 V2, sau đem lai hai dòng với tạo dòng V1V2 Kết dòng V1V2 có tính kháng cao so với dòng V1 V2 [41] 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng nghiên cøu bÖnh virut 1.5.1 Kü thuËt RT-PCR Kü thuËt RT-PCR (Reverse Transcriptase-PCR) kết hợp hai phản ứng mà ngợc (reverse transcription) PCR để nhân lên đoạn gen quan tâm từ ARN (Hình 4) Kỹ thuật gồm hai giai đoạn: - Tổng hợp sợi cADN thứ nhất: Nguyên lý phơng pháp sử dụng enzym mà ngợc (reverse transcriptase) để tổng hợp nên sợi cADN thứ từ ARN Tùy theo mục đích thí nghiệm mà loại ARN đợc sử dụng khác Nếu muốn nhân đoạn gen sinh vật bậc cao mà intron ngời ta thờng tổng hợp cADN từ mARN với måi oligo(dT)s NÕu lµ sinh vËt bËc thÊp nh vi khn, virut ngêi ta cã thĨ tỉng hỵp cADN từ ARN tổng số với mồi ngẫu nhiên mồi đặc hiệu cho gen cần nhân lên Khi mồi gắn bổ sung với sợi ARN khuôn enzym mà ngợc xúc tác cho trình tổng hợp cADN từ nucleotit tự có thành phần phản ứng nhiệt độ thích hợp Phản ứng tổng hợp cADN chØ x¶y mét chu kú, theo lý thut sau kÕt thóc ph¶n øng ta sÏ thu đợc lợng cADN tơng ứng với lợng ARN khuôn ban đầu Để tăng hiệu trình tổng hợp, lợng mồi đợc cho vào lớn nhiều lợng ARN khuôn chất kìm hÃm RNase đợc đa vào để bảo vệ cho ARN khỏi bị cắt RNase - Khuếch đại gen PCR: Sử dụng cADN làm khuôn để khuếch đại gen quan tâm phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (Primer-F Primer-R) Nguyên tắc kỹ thuật PCR đợc trình bày mơc 1.5.2 1.5.2 Kü tht PCR ARN tỉng sè S¶n phÈm PCR dNTPs Reverse Transcription Primer-R Primer-F dNTPs Taq polymerase PCR Reverse transcriptase cADN (mÉu PCR) Måi nhÉu nhiên Hình Sơ đồ minh họa kỹ thuật RT-PCR Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction chuỗi phản ứng trùng hợp) đợc Mullis cộng mô tả năm 1985 Đây kỹ thuật in vitro, tơng đối đơn giản cho phép nhân nhanh số lợng không hạn chế nguyên đoạn ADN định khoảng thời gian ngắn, nhờ xúc tác ADN polymerase Tất ADN polymerase hoạt động tổng hợp mạch ADN từ mạch khuôn cần diện mồi đặc hiệu Mồi đoạn ADN ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn ADN polymerase nối dài mồi để hình thành mạch Quá trình nhân enzym bao gồm bớc đợc lặp lại nhiều lần: - Biến tính ADN từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn cách nâng cao nhiệt độ lên 94-950C khoảng thời gian 30 giây đến phút - Gắn mồi (primer) với đoạn ADN cần nhân thông qua hạ nhiệt độ xuống 4060 C, khoảng thời gian 30 giây ®Õn phót, phơ thc vµo ®é dµi vµ tØ lệ G+C đoạn mồi - Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử ADN kéo dài từ đoạn mồi Hai phân tử ADN đợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử khuôn ban đầu Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút Để tránh tợng bắt cặp không đặc thù, phản ứng tổng hợp nên đợc thực 720C Loại polymerase dùng PCR loại chịu nhiệt (Taq polymerase) đợc tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, loại vi khuẩn đợc phân lập từ suối nớc nóng Hiện nay, enzym chủ yếu đợc sản xuất theo đờng tái tổ hợp Nh vậy, sau chu kỳ phản ứng lợng ADN cần nhân tăng gấp đôi, với N sợi khuôn ban đầu sau n chu kỳ có Nx2n sợi ADN đợc nhân lên Ví dụ, sau khoảng 20 chu kỳ có tới 30 triệu đợc nhân lên từ sợi khuôn ban đầu [1,3] 1.5.3 Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E coli Biến nạp theo nghĩa rộng là: đa bất kú ADN nµo vµo bÊt kú tÕ bµo nµo Trong trờng hợp tế bào E coli biến nạp có nghĩa đa ADN plasmit vào tế bào Lần biến nạp vi khuẩn đợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928 thí nghiệm tiếng ông gọi nguyên lý biến nạp Trên thực tế, phát minh sau đà chứng minh gen đợc cấu thành từ ADN Tuy nhiên, tất vi khuẩn đợc biến nạp cách dễ dàng Để cho biến nạp E coli có hiệu quả, tế bào cần trở nên khả biến (competent) Để đạt đợc điều này, ngời ta ngâm tế bào dung dịch CaCl2 lạnh đá, tế bào trở nên khả biến theo cách mà cha rõ nguyên nhân Việc biến nạp tế bào khả biến đợc thực cách trộn ADN plasmit với tế bào, ủ đá 20-30 phút, sau tạo sốc nhiệt ngắn (khoảng phút 42 0C), làm nh ADN chui vào tế bào Sau biến nạp, vi khuẩn đợc nuôi phục hồi môi trờng LB 370C vòng 60 đến 90 phút Sau đó, tế bào đợc đa lên môi trờng chọn lọc để nhân lên tế bào có plasmit Trong trình biến nạp, có phần nhỏ tế bào khả biến đ ợc biến nạp Mặc dù có nhợc điểm lớn này, biến nạp kü tht quan träng, nã cã thĨ t¹o tíi 10 tế bào biến nạp (tức thể biến nạp) đa 10 Tổng 15 Bảng 11 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bớc Nhiệt độ (0C) Ph¶n øng Thêi gian Chu kú BiÕn tÝnh 96 BiÕn tính 96 10 giây Gắn mồi 55 giây 25 Kéo dài chuỗi 60 phút Hoàn tất kéo dài 72 KÕt thóc ph¶n øng 30 phút Sản phẩm PCR đợc tinh cách bổ sung 5l EDTA 125mM, 60l cån 100% vµ đ ë nhiệt độ phòng 15 phút Tiếp ly tâm 12.000 v/p, 15 phút để kết tủa đoạn ADN, sau loại bỏ cồn Bổ sung 60l ethanol 70% ly tâm 10.000 v/p 10 phút Làm khô kết tủa ADN, bổ sung 10l Hi-DiTM Formamide biến tính 950C phút Các mẫu đợc tra vào giếng khay đựng mẫu, sau ®iƯn di èng mao qu¶n 80cm x 50l víi polymer POP4TMcủa hÃng ABI, Mỹ Kết đợc xử lý phần mềm ADNstar 2.2.9 Phơng pháp subclone (tách dới dòng) Đoạn gen cần xác định trình tự có chiều dài khoảng 2000bp, đọc hai chiều đợc 1500-1600bp Một đoạn khoảng 400-500bp không xác định đợc trình tự Do đó, cần phải tiến hành subclone xác đình đầy đủ trình tự đoạn gen Muốn tiến hành subclone trớc hết phải xác định trình tự chiều trình tự gen, sau xác định vị trí cắt enzym giới hạn Chọn vị trí cắt enzym giới hạn gen PCS phải khác Trong nghiên cứu chọn enzym SphII PCS PglII nằm gen cách đầu gen khoảng 600bp Enzym giới hạn SphI cắt tốt buffer II, BglII c¾t tèt nhÊt buffer III, chØ c¾t đợc 75% bufffer II Để cắt đồng thời enzym cần sử dụng buffer II tăng lợng enzym nh thời gian cắt Các bớc đợc tiến hành nh sau 1) Cắt plasmit enzym hạn chế Sph I Bgl II Bảng 12 Thành phần phản ứng cắt enzym STT Thành phần Plasmit Buffer II Sph I Bgl II Tổng Thể tích (l) 1 10 19 Hỗn hợp phản ứng đợc ủ 370C Sau đó, điện di sản phẩm cắt enzym gel agarose 1% Thôi gel tinh sản phẩm cắt enzym băng plasmit có kích thớc khoảng 4400bp 2) Xử lý sản phẩm cắt enzym enzym klenow 15 phút nhiệt độ phòng tinh 3) Tiếp tơc thùc tiƯn ph¶n øng ghÐp nèi plasmit (ph¶n øng tự đóng vòng) 4) Biến nạp plasmit vào tế bào E.coli DH5 5) Tách dòng xác định trình tự 2.2.10 Phơng pháp xử lý trình tự gen thu đợc Sử dụng chơng trình phần mềm DNAstar để phân tích, so sánh trình tự gen thu đợc Các bớc tiến hành nh sau: + So sánh trình tự gen đợc đọc từ hai đầu xuôi đầu ngợc để xác định trình tự đầy đủ gen + Xác định đợc vị trí, số lợng enzym hạn chế trình tự ADN + Giải mà trình tự nucleotit sang trình tự axit amin theo khung đọc mở, xác định vị trí mở đầu kết thúc dịch mà + Lập phân loại bảng hệ số đồng dạng so sánh mức độ tơng ®ång di trun cđa tr×nh tù nucleotit cđa dòng gen NIb thu đợc với với trình tù gen NIb cđa c¸c PRSV tõ nhiỊu khu vùc khác giới đà đợc công bố ngân hàng liệu gen (NCBI) (bảng 5) Chơng Kết thảo luận 3.1 kết Thiết kế mồi Để nhân đợc đoạn gen NIb kỹ thuật RT-PCR điều quan trọng phải có cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gen 16 trình tự gen Nib đà đợc khai thác NCBI Các trình tự đợc so sánh với nhờ chơng trình phần mềm DNAstar Với mục đích sử dụng cặp mồi nhân đợc nhiều dòng virus khác nhau, đà chọn vùng trình tự có độ bảo thủ cao kết đà thiết kế đợc cặp mồi NIb-F1 CP-R3 Bảng Trình tự thông số cần thiết hai mồi NIb-F1 CP-R3 Måi NIbF1 Tr×nh tù måi 5’-GAGCTCTCAAAGTGTGGGA-3’ Tm (0C) % GC 58 52 20 ... dòng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thông qua tách dòng, xác định so sánh trình tự gen mà hoá protein vỏ (CP) cho thấy 16 dòng PRSV phân lập từ khu vực khác Việt Nam có mức độ giống từ... sánh trình tự gen thu đợc Các bớc tiến hành nh sau: + So sánh trình tự gen đợc đọc từ hai đầu xuôi đầu ngợc để xác định trình tự đầy đủ gen + Xác định đợc vị trí, số lợng enzym hạn chế trình tự. .. BƯnh ë đu đủ - Bệnh đốm vòng: Còn gọi bệnh đốm hình nhẫn bệnh phổ biến đu đủ nớc ta nhiều nớc khác giới, đợc coi trở ngại lín nhÊt cho nghỊ trång ®u ®đ Cã thĨ nãi đâu có trồng đu đủ có bệnh Bệnh