Đang tải... (xem toàn văn)
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của ngành Công nghệ sinh học hiện đại. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được thực hiện ở nước ta từ những năm 1
Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Nuôi cấy mô tế bào thực vật công nghệ quan trọng ngành Công nghệ sinh học đại Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật thực nước ta từ năm 1960 miền Nam đầu năm 1970 miền Bắc Tuy nhiên cuối năm 1980 trở lại đây, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật phát triển mạnh mẽ đưa vào ứng dụng Trong kĩ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật kĩ tht Những thành cơng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật chứng tỏ khả ứng dụng hiệu nhiều lĩnh vực, có bảo tồn ex situ nguồn gen quý Kĩ thuật nuôi cấy mô cho phép nhân nhanh lượng lớn giống ống nghiệm mà cần số lượng mẫu (thậm chí cần chồi) Ngoài ra, kĩ thuật nhân nhanh ống nghiệm nhằm tạo quần thể có chất lượng đồng mặt di truyền Hiện nay, Ngưu tất trồng mọc chủ yếu Sapa, Tam Đảo, Hà Nội Do chúng sử dụng phổ biến y học cổ truyền với nhu cầu ngày tăng như: làm giảm cholesterol máu, hạ huyết áp, hỗ trợ điều trị ung thư, chữa trị bệnh khớp… Xuất phát từ sở trên, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu phương pháp tạo đa chồi để nhân nhanh Ngưu tất (Achyranthes bidentata blume) kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật” nhằm nhân giống bảo tồn nguồn gen Ngưu tất ống nghiệm Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Mục đích yêu cầu Mục đích Nghiên cứu quy trình nhân nhanh bảo tồn Ngưu tất ống nghiệm kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Yêu cầu Xác định phương pháp khử trùng mẫu để đưa vào ống nghiệm Xác định mơi trường thích hợp để tạo đa chồi Ngưu tất Xác định mơi trường thích hợp để tạo rễ Ngưu tất Xác định giá thể thích hợp để đưa Ngưu tất tự nhiên Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung Ngưu tất 1.1.1 Đặc điểm sinh học Tên việt nam: Cây Ngưu tất Tên khoa học: Achyranthes bidentata Blume Thuộc họ Giền (Amaranthaceae) Đặc điểm hình thái: Ngưu tất thân thảo, sống lâu năm, cao 60-80 cm, rễ củ hình trụ dài, có nhiều rễ phụ Thân phình lên đốt, màu lục nâu tía Cành mọc gần thẳng đứng Lá mọc đối xứng hình mác Gốc thuôn hẹp, đầu nhọn dài từ 5-10 cm, rộng từ 1-4 cm, hai mặt nhẵn, gân mặt thường có màu nâu tía, mép uốn lượn, cuống dài từ 1-1,5 cm Cụm hoa dài từ 2-5 cm, mọc thân kẽ đầu cành, hoa nhiều, thường gập xuống sít vào cuống cụm hoa, sau nở bắc dài 3mm, dài, nhị, bầu hình trứng Hoa mọc hướng lên biến thành mọc quặp xuống Quả nang, hình bầu dục, chứa hạt [29] [30] Cây thường mọc Trung Quốc Đơng Nam Á, có Việt Nam Cây Ngưu tất thích hợp gieo trồng điều kiện nước ta phát triển tốt, trồng nhiều vùng núi cao, trung du đồng Đồng Bằng Bắc Bộ: Hưng Yên; Hà Nội; trung tâm nghiên cứu trồng chế biến thuốc [29] Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn Đất phù sa cao ráo, thoát nước phù hợp với Ngưu tất [32] Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Thành phần hóa học Rễ chứa Saponin, thủy phân cho Sapogenin axit oleanolic Rễ Ngưu tất có chứa axitd oleanolic 0,096%, saponin toàn phần 4,04% axit oleanolic α -L-rhamnopyranosyl - β - D- galactopyranosid Rễ chứa ecdysteron inokosteron Hàm lượng ecdysteron khoảng 0,037% Ngồi cịn có ecdysteron, inokosteron, glucose, galactose, rhamnoza, muối kali số thành phần khác betain, polysaccharide, emodin, physcion [31] 1.1.2 Giá trị Ngưu tất Giá trị y học Ngưu tất vị đắng, chua, tính bình, quy vào hai kinh can, thận Tác dụng hoạt huyết, thông kinh, hoạt lạc, mạnh gân cốt, lợi niệu trừ sỏi, hạ huyết áp, giảm cholesterol máu, giải độc chống viêm [30] Tác dụng dược lý: - Chống viêm rõ rệt giai đoạn cấp tính mạn tính phản ứng viêm - Gây teo tuyến ức chuột cống đực non Tác dụng gây teo tuyến ức đặc tính thuốc ức chế miễn dịch - Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu thỏ gây tăng cholesterol từ vào gây ức chế tổng hợp cholesterol thể thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt mèo, mức độ hạ áp từ từ, thời gian tác dụng kéo dài Có độc tính thấp - Chế phẩm Solamin thành phần có Ngưu tất số dược liệu khác áp dụng để điều trị thấp khớp với kết có tác dụng chống viêm giảm đau rõ rệt lâm sàng Kết tốt tương đối nhanh đau lưng cấp lạnh sang chấn Ðối với viêm đa khớp dạng thấp, chưa có biến dạng khớp chứng đau nhức đơn Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội thuần, tác dụng điều trị tương đối tốt Khi có biến dạng xương, cơ, khớp, kết Thuốc không gây tác dụng phụ đáng kể Công dụng Ngưu tất dạng sống chữa cổ họng sưng đau, mụn nhọt, đái rát buốt, đái máu sỏi, bụng kết hịn cục, đẻ khó đẻ rau thai không ra, sau đẻ ứ huyết gây đau bụng, chấn thương, ứ máu bầm, đầu gối nhức mỏi Ngưu tất tẩm chữa can thận hư, ù tai, đau lưng, mỏi gối, tay chân co quắp bại liệt [30] Giá trị kinh tế Cây Ngưu tất loại dễ trồng, phù hợp với điều kiện nước ta, cần đất pha cát, tơi xốp, nhiều mùn, đất phù sa cao ráo, nước phát triển tốt Nó khơng địi hỏi tốn cơng chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng 1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng 1.2.1 Lược sử phát triển Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trải qua 100 năm phát triển Ngày có nhiều ứng dụng làm sáng tỏ lý thuyết tính tồn tế bào Có thể thấy phát triển kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật song song với lịch sử ngành khoa học sống khác Các giai đoạn kĩ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật [1] [3] [9] [15] - Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức Schleiden Schwann đề xướng học thuyết sinh học gọi thuyết tế bào nêu rõ: + Mọi thể sống cấu tạo từ nhiều tế bào + Tế bào đơn vị cấu trúc chức thể sống, hình thức nhỏ sống + Tế bào tạo từ tế bào trước Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội - Người Haberlandt (1898) đề xuất lý thuyết tính tồn tế bào, ơng người đưa giả thuyết Schleiden Schwann vào thực nghiệm Ông đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ơng, tế bào thể sinh vật mang tồn lượng thơng tin di truyền cần thiết đủ thể sinh vật Vì vậy, gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Haberlandt nuôi cấy mô mầm chưa thành công - Đến năm 1922, Robbins Kotte thành cơng ni cấy đầu rễ hịa thảo kéo dài 12 ngày môi trường lỏng gồm có muối khống, glucose - Năm 1934, White (Mỹ) nuôi cấy thành công thời gian dài đầu rễ cà chua với môi trường lỏng chứa muối khống, glucose nước chiết nấm men Sau lâu White chứng minh thay nước chiết nấm men hỗn hợp loại vitamin nhóm B: Thiamin (B1), Piridoxin (B6), axit nicotinic Cùng năm, Gautheret thành công việc nuôi cấy mô tách từ mô tượng tầng Salic apraea Populus nigra Mô nuôi cấy phân chia liên tục môi trường Knop bổ sung glucose cysteinhyochloride - Went Thimann (1937) phát chất sinh trưởng thực vật axit β-indolaxetic (IAA) tác động lên trình phân chia tế bào hình thành rễ - Năm 1938 Gautheret thành công việc trì sinh trưởng với thời gian vơ hạn mô sẹo cà rốt môi trường thạch cách cấy chuyển đặn tuần/lần - Năm 1941, Overbeck (Mỹ) chứng minh tác dụng kích thích sinh trưởng nước dừa nuôi cấy phôi họ cà Trong thời gian này, Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội nhiều chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm Auxin nghiên cứu tổng hợp hóa học thành công như: α-napthyl axetic axit (NAA), 2,4 Dichlorophenoxy axetic axit (2,4-D) Nhiều tác giả nhận thấy với nước dừa, 2,4-D NAA giúp tạo mô sẹo, gây phân chia tế bào thành công nhiều đối tượng thực vật mà trước khó nuôi cấy - Năm 1954, Skoog phát Kinetin (6 furfuryl-amino-purin) chất điều khiển trình phân bào phân hóa chồi Sau người ta tìm thấy Zeatin tách từ mầm ngơ có hoạt tính tương tự Kinetin Cả chất thuộc nhóm Cytokinin - Năm 1960, Bergman phát triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên bước tạo khối mô sẹo từ tế bào đơn kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật đĩa thạch trải tế bào vi sinh vật Cũng năm 1960, Cooking dùng men cellulase để phân hủy cellulose tế bào thực vật thu tế bào trần (protoplast) - Guha Maheswari (1964) công bố tạo thành công đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cà độc dược - Bourgin Nitsch (1967), Nakata (1968) tạo thành công cấy đơn bội từ bao phấn thuốc lá, mở nhiều triển vọng ứng dụng tạo đơn bội vào công tác giống nghiên cưu di truyền - Đến năm 1971, Takebe tái sinh thuốc hoàn chỉnh từ protoplast thuốc giống Xanthi - Melchers (1977) lai soma thành công cà chua khoai tây - Năm 1985 thuốc mang gen biến nạp công bố - Năm 1994 năm đánh dấu cà chua (cà chua Flav’rSav’r) có mặt thị trường thực phẩm Hoa Kì Cùng năm 1994 giống củ cải đường mang gen kháng bệnh virus biến nạp đưa vào sản xuất đại trà Na Uy Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Đến có hàng trăm lồi ni cấy mơ thành cơng với nhiều mục đích khác nhân nhanh, bảo tồn in vitro, nuôi cấy bao phấn… Đặc biệt, nhờ kĩ thuật nuôi cấy mô chuyển gen thông qua giai đoạn mô sẹo tái sinh tạo chồi mà nhiều giống trồng chuyển gen tạo (cà chua, lúa, đậu tương, khoai tây, bông, đu đủ…) [15] 1.2.2 Cơ sở khoa học kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật tính tồn tế bào Haberlandt nêu vào năm 1902 Theo quan điểm sinh học đại tính tồn tế bào tế bào riêng rẽ phân hóa, mang tồn thơng tin di truyền cần thiết đủ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Q trình phát sinh hình thái ni cấy mơ tế bào thực vật kết trình phân hóa phản phân hóa tế bào Như vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật kĩ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời điều kiện nhân tạo vô trùng) cách định hướng Đây điểm quan trọng sở đơn vị mô, tế bào, nhà sinh vật học thực kĩ thuật tiên tiến cho việc lựa chọn, cải thiện lai tạo giống trồng [1] [13] 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro Mẫu nuôi cấy Muashige (1974) ghi nhận quan trọng việc lựa chọn mẫu cấy thích hợp, điều quan trọng cho thấy số nhân tố chọn lọc mẫu bao gồm: kiểu gen, quan chọn, tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe mẫu nguồn mẫu + Kiểu gen: Kiểu gen ảnh hưởng sâu sắc đến q trình ni cấy Với lồi thuốc sử dụng kiểu mẫu, Cheng Smith (1973) ghi nhận khác genom qua nuôi cấy sinh trưởng mô lồi Hơn Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội nữa, Jaramillo Summers (1990) ghi nhận kiểu di truyền ảnh hưởng đến số lượng đường kính mô sẹo qua nuôi cấy hạt phấn cà chua + Cơ quan: Muashige (1974) cho hầu hết loại quan mơ có khả sử dụng để nuôi cấy invitro Mẫu nuôi cấy in vitro khác loài khác nhau, Petunia dùng chồi đỉnh để nuôi cấy Theo Doerschung Miller (1976) cho rằng: chồi mầm thích hợp làm mẫu ni cấy nảy mầm từ hạt + Tuổi sinh lý: Tuổi thực mẫu nuôi cấy tuổi theo mùa năm mẫu nuôi cấy cho thấy có ảnh hưởng quan trọng đến biệt hóa tuổi sinh lý Có nhiều nghiên cứu khác ảnh hưởng tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy Pierik (1970) ghi nhận rễ phát sinh non không phát sinh già + Mẫu in vitro: Trong năm gần đây, nhiều kết nghiên cứu cho thấy mẫu in vitro có khả tái sinh cao mẫu lấy từ mẹ đồng ruộng hay vườn ươm Azalea + Sức sống mẫu: Điều cần nhận thấy mẫu mẹ có ảnh hưởng quan trọng đến ni cấy in vitro, cần phải cẩn thận chọn mẫu nuôi cấy bị bệnh,nếu nuôi cấy bị bệnh có số lượng lớn mẫu bị bệnh nhân lên [13] Điều kiện ni cấy Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy mô từ 20-27oC Theo Murashige (1974) nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến sinh trưởng phát triển q trình ni cấy in vitro qua tiến trình sinh lý hơ hấp hay hình thành tế bào quan Cường độ ánh sáng: Cường độ ánh sáng nhân tố quan trọng quang hợp, ảnh hưởng đến khả nuôi cấy in vitro xanh Ảnh hưởng ánh sáng có liên hệ đến lồi, có lồi chịu ánh sáng cao, Nguyễn Trần Dinh Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội có lồi chịu ánh sáng thấp hay tối, có lồi chịu ánh sáng trung bình Việc ni cấy in vitro tốt điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux [12] Môi trường ni cấy Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp nuôi cấy mô tế bào cần thiết Vì loại trồng khác cần hàm lượng chất dinh dưỡng khác Mặt khác môi trường thay đổi tùy thuộc vào phân hóa cua mơ cấy, tùy theo trường hợp trì mơ trạng thái mô sẹo, tạo rễ, tạo chồi hay tái sinh hồn chỉnh Việc lựa chọn mơi trường cần dựa vào tài liệu cho đối tượng ni cấy thăm dị số mơi trường cho để xác định môi trường cho mẫu nuôi cấy Chất kích thích sinh trưởng thực vật (KTSTTV) Các chất kích thích sinh trưởng có vai trị quan trọng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Bằng cách cung cấp chất kích thích mức hợp lý điều khiển q trình phát sinh hình thái mẫu ni cấy Auxin Cytokinin hai nhóm chất kích thích sinh trưởng sử dụng phổ biến Auxin chất kích thích sinh trưởng thực vật sử dụng thường xuyên nuôi cấy mô tế bào thực vật Auxin kết hợp chặt chẽ với thành phần khác mơi trường dinh dưỡng để kích thích tăng trưởng mơ sẹo, huyền phù tế bào điều hịa phát sinh hình thái, đặc biệt phối hợp sử dụng với nhóm Cytokinin Sự áp dụng loại nồng độ Auxin môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào: + Kiểu tăng trưởng phát triển mẫu cần nghiên cứu + Hàm lượng Auxin nội sinh có mẫu ni cấy + Sự tác động qua lại Auxin nội sinh Auxin ngoại sinh Đặc tính Auxin Auxin có vai trị kích thích tăng trưởng kéo dài tế bào Đặc điểm chung Auxin kích thích phân chia tế bào Các hoocmon Nguyễn Trần Dinh 10 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Theo bảng thấy số chồi/mẫu cao môi trường NTC4 (MS + 0,6mg/l BAP 0,1mg/l NAA) 4,84 chồi mơ sẹo hình thành mức trung bình, chồi phát triển bình thường Các mơi trường cịn lại có số chồi thấp hơn, đặc biệt mơi trường NTD3 có 3,73 chồi / mẫu Qua lựa chọn môi trường NTC4 (MS + 0,6mg/l BAP 0,1mg/l NAA) mơi trường thích hợp để tạo đa chồi Ngưu tất 3.3 Tạo hoàn chỉnh Ra rễ khâu cuối giai đoạn nghiên cứu in vitro Chất kích thích sinh trưởng dùng chủ yếu giai đoạn thuộc nhóm Auxin IBA NAA chất kích thích chủ yếu tác động lên trình phân chia tế bào hình thành rễ 3.3.1 Ảnh hưởng NAA đến khả hình thành rễ Ngưu tất Các chồi đỉnh Ngưu tất nuôi cấy mơi trường có chứa NAA nồng độ khác để nghiên cứu ảnh hưởng đến hình thành rễ Kết thu được thể bảng hình Bảng 6: Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Ngưu tất CTMT NAA ( mg/l ) Tỷ lệ chồi rễ ( % ) Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ ĐC 100 5,59 + NTE1 0,1 100 6,35 ++ NTE2 0,2 100 6,84 ++ NTE3 0,3 100 7,98 +++ NTE4 0,4 100 7,31 +++ NTE5 0,5 100 6,67 ++ Ghi chú: +: Rễ mảnh, ngắn; + + : Rễ mảnh, dài; + + +: Rễ mảnh, dài nhiều Nguyễn Trần Dinh 40 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Tất môi trường rễ đạt 100% khơng có tượng xuất mơ sẹo quanh gốc Trên môi trường NTE1, NTE2, NTE5 có tỷ lệ rễ tạo thành 6,35; 6,84; 6,67 (rễ/mẫu), rễ mảnh dài Còn mơi trường NTE3, NTE4 rễ hình thành nhiều, mảnh dài Nhưng mơi trường NTE3 có số rễ hình thành nhiều 7,98 (rễ) Do lựa chọn môi trường NTE3 môi trường tạo rễ thích hợp cho Ngưu tất 3.3.2 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Ngưu tất Cũng thí nghiệm chúng tơi tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng IBA với nồng độ khác đến khả hình thành rễ Ngưu tất, kết thu bảng hình 10 Bảng 7: Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Ngưu tất CTMT IBA ( mg/l) Tỷ lệ chồi rễ (%) Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ ĐC 100 5,58 ++ NTG1 0,5 100 6,87 ++ NTG2 0,6 100 7,84 ++ NTG3 0,7 100 7,23 ++ NTG4 0,8 100 7,07 ++ NTG5 0,9 100 6,73 ++ Ghi chú: + +: rễ dài, mảnh Kết trình bày bảng cho thấy, tất mơi trường hình thành rễ phát triển bình thường, mơ sẹo hình thành nhỏ Các mơi trường NTG1, NTG3, NTG4, NTG5 có tổng số rễ 6,87; 7,23; 7,07; 6,73 (rễ) Riêng mơi trường NTG2 có tổng số rễ/mẫu lớn 7,84; rễ hình thành nhiều có nhiều rễ phụ xung quanh Vì chúng tơi chọn mơi trường NTG2 (MS + 0,6mg/l IBA) thí nghiệm mơi trường thích hợp để tạo rễ Ngưu tất Nguyễn Trần Dinh 41 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 3.3.3 Ảnh hưởng tổ hợp IBA Kinetin đến khả tạo rễ Ngưu tất Hai nhóm Auxin Cytokinin quan trọng ni cấy invitro Hai nhóm tác động qua lại với ảnh hưởng tới trình hình thành chồi rễ Vì mà chúng tơi tiến hành thí nghiệm với IBA Kinetin đến hình thành rễ Ngưu tất Sau q trình ni cấy chúng tơi quan sát thu thập số liệu kết sau: Bảng 8: Ảnh hưởng IBA Kinetin đến khả tạo rễ Ngưu tất CTMT IBA (mg/l) Kinetin (mg/l) Tỷ lệ chồi rễ (%) Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ ĐC 0 100 5,02 + NTH1 0,2 0,1 100 5,07 ++ NTH2 0,3 0,1 100 5,12 ++ NTH3 0,4 0,1 100 5,53 +++ NTH4 0,5 0,1 100 5,23 ++ NTH5 0,6 0,1 100 5,10 ++ Ghi chú: +: Rễ mảnh dài; + +: Rễ ngắn, to; + + +: Rễ ngắn, to, nhiều Theo kết bảng cho ta thấy, tất môi trường hình thành rễ, phát triển bình thường Các mơi trường NTH1, NTH2, NTH4, NTH5 có tổng số rễ trung bình là: 5,07: 5,12; 5,23; 5,10 (rễ) Riêng mơi trường NTH3 có tổng số rễ tạo thành lớn 5,53 (rễ) rễ hình thành to Chính mà chúng tơi lựa chọn mơi trường NTH3 (MS + 0,4mg/l IBA 0,1mg/l Kinetin) mơi trường thích hợp để tạo rễ Ngưu tất Qua ba thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng chất kích thích lên q trình tạo rễ Ngưu tất kết tổng hợp bảng Bảng 9: Ảnh hưởng chất kích thích lên trình tạo rễ Ngưu tất Nguyễn Trần Dinh 42 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội CTMT Tổng số rễ/mẫu Chất lượng rễ NTE3 7,98 ++ NTG2 7,84 + NTH3 5,53 +++ Ghi chú: +: Rễ mảnh, dài; + +: Rễ mảnh, dài nhiều; + + +: Rễ to, ngắn Theo bảng kết bảng cho thấy mơi trường NTE3 NTG2 có số lượng rễ tạo thành nhiều dạng sợi mảnh, dài Còn mơi trường NTH3 có số lượng rễ rễ tạo thành lại to tốt cho q trình vườn ươm Chính mà định chọn môi trường NTH3 (MS + 0,1mg/l Kinetin 0,4mg/l IBA) mơi trường thích hợp cho trình tạo rễ Ngưu tất 3.4 Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống trồng bầu Đây giai đoạn quan trọng q trình nhân giống vơ tính Cây in vitro nuôi điều kiện ổn định nguồn dinh dưỡng, ánh sánh, nhiệt độ… Khi chuyển ngồi mơi trường tự nhiên hồn tồn khác nên dễ bị chết nước, nhiệt độ cao… Vì ta phải tiến hành làm cho thích nghi dần với điều kiện ngồi tự nhiên Q trình thích nghi thay đổi đặc điểm sinh lý hình thái Thời gian tối thiểu để thích nghi với điều kiện bên khoảng 2-3 tuần Trong thời gian cần chăm sóc bảo vệ cẩn thận Tiến hành trồng bầu thử nghiệm năm loại giá thể khác nhau: Đất trồng Đất trồng : Trấu hun Cát đen Cát đen : Trấu hun Nguyễn Trần Dinh 43 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Trấu hun Sau tạo hoàn chỉnh ta tiến hành trồng vào loại giá thể Các bầu cho vào khay phủ kín túi nilon tuần đầu tiên, đặt nơi có ánh sáng khuyếch tán, thống mát, tưới đủ ẩm ngày để dần thích nghi với điều kiện bên Tỷ lệ sống sau tháng loại giá thể khác thu bảng 10 Bảng 10: Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống TT Công thức Tỷ lệ Số trồng Số sống Tỷ lệ Cây sống (%) Đất trồng 40 26 65 Đất trồng : Trấu hun 1:1 40 30 75 Cát đen 40 34 85 Cát đen : Trấu hun 1:1 40 38 95 Trấu hun 40 18 45 Kết bảng 10 cho ta thấy rõ ảnh hưởng loại giá thể đến sống nuôi cấy invitro tự nhiên Trong loại giá thể giá thể trấu hun cho tỷ lệ sống thấp 45% Còn giá thể Đất trồng cho tỷ lệ sống cao 65% Trên giá thể Đất trồng : Trấu hun (1:1) giá thể Cát đen có tỷ lệ sống 75% 85% Riêng giá thể Cát đen : Trấu hun (1:1) có tỷ lệ sống cao 95% Cây phát triển tốt, đồng Dựa vào kết lựa chọn giá thể thích hợp để trồng Ngưu tất ngồi mơi trường tự nhiên giá thể Cát Nguyễn Trần Dinh 44 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Bước đầu nhân giống thành công Ngưu tất phương pháp nuôi cấy in vitro Nồng độ khử trùng mẫu thích hợp là: dung dịch javen nồng độ 75%, khoảng 10 phút - Mơi trường thích hợp để tạo chồi Ngưu tất là: NTC4 (MS + 20g/ l đường Saccharose + 8g/l agar + 0,6mg/l BAP 0,1mg/l NAA) - Mơi trường thích hợp để tạo rễ Ngưu tất là: NTH3 (MS + 20g/l đường saccharose + 8g/l agar + 0,4mg/l IBA 0,1mg/l Kinetin) - Giá thể thích hợp để trồng bầu là: Giá thể Cát đen : Trấu hun (1:1) với tỷ lệ sống 95% 4.2 Đề nghị Nguyễn Trần Dinh 45 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Tiếp tục nghiên cứu hồn thiện điều kiện ni trồng Ngưu tất từ nuôi cấy in vitro ngồi mơi trường tự nhiên để đạt hiệu kinh tế cao Nguyễn Trần Dinh 46 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội PHỤ LỤC Các thành phần môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) Thành phần khoáng đa lượng Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Thành phần khoáng vi lượng Nồng độ (mg/l) MnSO4.H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3BO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2EDTA 37,3 FeSO47H2O 27,8 Vitamin Nồng độ (mg/l) Thiamin HCl 0,1 Nicotinic Axit 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Glyxine 2,0 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Thanh Danh, Lê Xuân Đắc, Lê Thị Xuân (2005), Kết bước đầu nhân giống in vitro Vù hương kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt Nguyễn Trần Dinh 47 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội xanh góp phần bảo tồn đa dạng sinh học Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 03/11/2005, NXB Khoa học Kỹ thuật, 450-453 Lê Văn Hoàng (2007), Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Huỳnh Văn Kéo, Ngô Viết Nhơn (2006), Nghiên cứu bảo tồn nguồn gen thực vật vườn quốc gia Bạch Mã Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, 1(2): 127-129 Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB ĐH Quốc Gia TPHCM Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài gỗ quý Giá tỵ Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học Kỹ thuật, 352-357 Trần Văn Minh, Bùi Thị Tường Thu (2003), Ứng dụng công nghệ tế bào thực vật phục hồi loài đặc sản Trầm hương Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học Kỹ thuật, 358-361 Hồng Thị Nga (2011), Ứng dụng Cơng nghệ tế bào thực vật vào quy trình nhân nhanh hoa Đồng tiền, NXB Nơng Nghiệp, Hà Nội Nguyễn Hồng Nghĩa (1997), Bảo tồn nguồn gen trồng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội 10.Nguyễn Thị Quỳnh, Phan Vũ Tiên, Trịnh Việt Nga (2003), Nuôi cấy mô quang tự dưỡng Lõi thọ (Gmelina arbrea Roxb) Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc lần thứ 2, 25-26/7/2003, NXB Khoa học Kỹ thuật, 394-397 11.Lưu Trường Sinh, Hoàng Văn Lương (2005), Nghiên cứu hồn thiện quy trình nhân nhanh Trinh nữ hoàng cung phương pháp in vitro Những vấn đề sống khoa học sống, Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc 2005, Hà Nội 3/11/2005, NXB Khoa học Kỹ thuật, 722-724 Nguyễn Trần Dinh 48 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 12.Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), Giáo trình Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, NXb Nông Nghiệp Hà Nội 13.Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội 14.Nguyễn Văn Uyển (1996), Những phương Pháp công nghệ sinh học thực vật, NXB Nông nghiệp TPHCM 15.Đỗ Năng Vịnh (2005), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp Hà Nội 16.Vũ Văn Vụ, Vũ Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (tập 2), NXB Giáo dục Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 17.Balaraju K, Agastian P, Preetamraj JP, Arokiyaraj S, Ignaciumthu S (2008), Micropropagation of Vitex agnuscatus (Verbenaceae) Avaluable medicinal plant In vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 44(5): 436-411 18.Bedir E, Lata H, Schaneberg B, Khan IA, Morase RM (2003), Micropropagation of Hydrastis canadensis: Goldenseal a North American endangered species, Planta Med, 86-88 19.Catherine AO, Joanne LT (1998), Tissue culture of Grevillea species at mount Annan Botanic Gardens The Grevillea Book (1), Kangaroo Press, Sydney, Australia 20.George EF (1993), Plant propagation by tissueculture, Exegetics Ltd, Edin 21.Havens K, Guerrant E, Maunder M (1999), Strategies for survival: Ex situ Plant conservation Report of a research symposium held at the Chicago Botanic Garden, BG Journal, 3(3) 22.Joshi M, Dhar U (2003), In vitro propagation of Saussurea obvallata Edgew - An endangered ethnoreligious medicinal herb of Himalaya Plant Cell Rep, 21(10): 933-939 23.Mukherjee A, Roy Chowdhury B (2008), The In vitro propagation of a high value medicinal plant: Asparagus racemosus wild In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant, 1(2): 116-119 Nguyễn Trần Dinh 49 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội 24.Murashige T, Skoog F (1962), A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant, 15: 473-497 25 Nandi SK, Kumar A, and Palni L M S (2002), Role of plant tisue culture in biodiversity conservation and economic development, Gyanodaya Prakashan 26.Nishritha B, Sanjay S (2008), In vitro propagation of a high value medicinal plant: Asparagus rasemosus Willd In Vitro Cellular & Developmental Biology-plant, 44(6): 525-532 27.Park SU, Kim YK, Lee SY (2009), Improved in vitro plant regeneration and micropropagation of Rehmannia glutinosa L Journal of Medicial Plants Research, 3(1): 031-034 28.Pereira AM, Amui SF, Bertoni BW, Moraes RM, Franca SC (2003), Micropropagation of Anemopaegma arvense: Conservation of an endangered madicinal plant Plant Med, 69(6): 571-573 Tài liệu Internet: 29.http://www.caythuocquy.info.vn/modules.php? name=News&opcase=detailsnews&mid=1106&mcid=245&pid=&menu id 30.http://duoclieu.net/Dlieuhoc/Duoc%20lieu/Nguutat/Nguutat.htm 31.http://www.thegioisuckhoe.com/y-hoc/y-hoc-dan-toc/nhung-cay-thuocmang-ten-nguu-tat 32.http://www.botanyvn.com/cnt.asp?param=news&catid=8&pg=5 Nguyễn Trần Dinh 50 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Xuân Đắc, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam ln tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn Trung tâm nuôi cấy mô thực vật Thanh Hóa, Sở Khoa học Cơng nghệ Thanh Hóa tạo điều kiện cho tham gia chương trình nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn TS Chu Hồng Hà, Trưởng phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, tồn thể cán phịng Cơng nghệ tế bào thực vật Trại Thực nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đồng thời, xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo môn Công nghệ sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Viện đại học Mở Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu khoa học suốt thời gian học tập Cuối xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln ủng hộ, động viên để tơi có tự tin học tập nghiên cứu khoa học Hà Nội, tháng năm 2011 Sinh viên Nguyễn Trần Dinh Nguyễn Trần Dinh 51 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN 2,4 D 2,4 - Dichlorophenoxy Axetic Axit ADN Axit Deoxyribonucleic ARN Axit Ribonucleic BAP - Benzyl Amino Purin CTMT Công thức môi trường cs Cộng ĐC Đối chứng IAA Indol - 3- Axetic Axit IBA - Indol Butyric Axit K Kinetin KTST Kích thích sinh trưởng MS Môi trường Murashige Skoog NAA α- Napthalen Axetic Axit TB Trung bình DANH MỤC CÁC BẢNG Nguyễn Trần Dinh 52 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Bảng 1: Nồng độ BAP ảnh hưởng đến khả tạo chồi 32 Ngưu tất Bảng 2: Ảnh hưởng Kinetin đến khả tạo chồi 34 Ngưu tất Bảng 3: Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tạo 36 chồi Ngưu tất Bảng 4: Ảnh hưởng Kinetin NAA đến khả 38 tạo chồi Ngưu tất Bảng 5: Tổng hợp khả tạo chồi loại môi trường 39 Bảng 6: Ảnh hưởng NAA đến khả tạo rễ Ngưu 40 tất Bảng 7: Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Ngưu 41 tất Bảng 8: Ảnh hưởng IBA Kinetin đến khả tạo 42 rễ Ngưu tất Bảng 9: Ảnh hưởng chất kích thích lên q trình 43 tạo rễ Ngưu tất Bảng 10: Ảnh hưởng giá thể đến tỷ lệ sống 45 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1: Cây vơ trùng sau 25 ngày ni cấy 31 Hình 2: Tạo đa chồi Ngưu tất công thức môi trường 33 NTA3 Nguyễn Trần Dinh 53 Lớp CNSH 07-02 Khóa Luận Tốt Nghiệp Viện Đại Học Mở Hà Nội Hình 3: Ảnh hưởng BAP đến khả tạo chồi 33 Ngưu tất Hình 4: Tạo chồi Ngưu tất cơng thức mơi trường 34 NTB4 Hình 5: Ảnh hưởng Kinetin đến khả tạo chồi Ngưu 35 tất Hình 6: Tạo chồi Ngưu tất cơng thức mơi trường 36 NTC4 Hình 7: Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tạo chồi 37 Ngưu tất Hình 8: Tạo chồi Ngưu tất mơi trường NTD3 38 Hình 9: Tạo rễ Ngưu tất mơi trường NTE3 40 Hình 10: Tạo rễ Ngưu tất môi trường NTG2 41 Hình 11: Tạo rễ Ngưu tất cơng thức mơi trường 43 NTH3 Hình 12: Cây Ngưu tất in vitro trồng loại giá thể Nguyễn Trần Dinh 54 46 Lớp CNSH 07-02 ... thái nuôi cấy mô tế bào thực vật kết q trình phân hóa phản phân hóa tế bào Như vậy, kĩ thuật ni cấy mô tế bào thực vật kĩ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời... triển kĩ thuật nuôi cấy tế bào đơn lên bước tạo khối mô sẹo từ tế bào đơn kĩ thuật gieo trải tế bào thực vật đĩa thạch trải tế bào vi sinh vật Cũng năm 1960, Cooking dùng men cellulase để phân... chăm sóc, kỹ thuật canh tác cao lại mang giá trị kinh tế cao cho người trồng 1.2 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật ứng dụng 1.2.1 Lược sử phát triển Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trải qua
