Đang tải... (xem toàn văn)
Bệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiều người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Cho đến nay bệnh truyền nhiễm vẫn chưa có thuốc điều
MỞ ĐẦUBệnh truyền nhiễm là căn bệnh nguy hiểm cướp đi sinh mạng của rất nhiều người trên thế giới, đặc biệt là ở những nước đang phát triển. Cho đến nay bệnh truyền nhiễm vẫn chưa có thuốc điều trị hoặc nếu có thì giá thành vẫn còn cao so với mức thu nhập của người dân ở các nước này. Vì vậy vaccine đã trở thành phương tiện quan trọng và hiệu quả trong việc phòng và chống lại các căn bệnh truyền nhiễm [11].Nằm trong số những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, bệnh dại vẫn còn là vấn đề nghiêm trọng với các nước đang phát triển, gây ra tỷ lệ tử vong cao cho người và gia súc. Hàng năm, có khoảng 50.000 người chết vì những căn bệnh này và có tới 10 triệu liều vaccine được dùng. Hơn 99% người chết do bệnh dại là ở châu Phi, châu Á và Nam Mỹ trong đó chỉ tính riêng Ấn Độ mỗi năm có tới 30.000 người chết (Theo báo cáo của tổ chức y tế thế giới). Hiện nay, có hơn 2,5 tỷ người đang sống trong vùng có tiềm ẩn bệnh dại, trong đó trẻ em ở vào độ tuổi từ 5 - 15 có nguy cơ mắc bệnh cao nhất [33]. Ở Việt Nam, bệnh dại vẫn đang là vấn đề nan giải. Theo số lượng thống kê của Viện Paster chỉ tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, năm 2001, trên địa bàn Thành phố có 82.000 người bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng tại các cơ quan y tế. Nhưng hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị căn bệnh này, vì vậy việc phòng chống bệnh bằng vaccine là phương pháp tối ưu nhất. Tuy nhiên, những loại vaccine trên thị trường hiện nay phổ biến là loại vaccine bất hoạt. Vaccine này có nhiều hạn chế như phản ứng phụ cao, không an toàn tuyệt đối, virus có thể phục hồi lại khả năng gây bệnh.Sự phát triển của công nghệ sinh học đã cho phép tạo ra những loại vaccine hoàn toàn mới. Những loại vaccine này có thể từ trước tới nay chưa hề có, hoặc đơn giản có thể chỉ là những vaccine có hiệu lực cao hơn và phản ứng phụ ít hơn so với vaccine cổ điển. Hiện nay, sử dụng phương pháp ADN tái tổ hợp trên các đối tượng khác nhau như E. coli, nấm men… người ta đã tạo thành công một số loại vaccine thế hệ mới. Nhưng đối với vaccine dại và một số loại vaccine khác việc biểu hiện trong các tế bào vi sinh vật lại gặp nhiều khó khăn. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất vaccine trên các đối tượng cây trồng (khoai lang, đu đủ, lạc, cà chua, thuốc lá…) đang được nhiều nhà khoa học quan tâm vì tính hiệu quả của nó. Sản xuất vaccine tái tổ hợp trên các đối tượng cây trồng sẽ giảm giá thành xuống rất nhiều so với vaccine đang được sản xuất trên tế bào động vật. Vì vaccine thực vật có thể sản xuất được một lượng lớn, kỹ thuật đơn giản phù 1 hợp với trình độ các nước nghèo và đang phát triển. Hơn thế nữa, vì là vaccine ăn hoặc uống được, nên vaccine thực vật đơn giản hoá các bước khi sử dụng và bảo quản [1, 13].Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen” với mục đích tạo ra vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá kháng nguyên vỏ của virus dại có khả năng gây đáp ứng miễn dịch để chuyển vào thực vật, nhằm tạo ra cây trồng chuyển gen có khả năng sản xuất vaccine tái tổ hợp ăn, uống được.2 Chơng 1. Tổng quan tài liệu1.1. Giới thiệu chung về Vaccine 1.1.1. Vaccine và hiệu quả phòng chống bệnh truyền nhiễmKể từ khi Edward Jenner (1749-1823) tìm ra phơng pháp tiêm chủng mủ đậu mùa bò cho ngời để phòng bệnh đậu mùa đến nay đã hơn 200 năm. Cho đến nay vaccine vẫn đợc coi là thành tựu vĩ đại nhất của y học hiện đại. Công tác tiêm chủng đã đợc thực hiện ở tất cả các quốc gia trên thế giới và trở thành một tấm lá chắn hữu hiệu chống lại nhiều bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do virus gây ra. Nhờ có vaccine mà hàng trăm triệu ngời trên thế giới đã thoát khỏi bệnh tật và thần chết. Vaccine là chế phẩm kháng nguyên chỉ gây phản ứng miễn dịch mà không gây bệnh. Vaccine dùng để kích thích đáp ứng miễn dịch nguyên phát làm tăng tế bào ghi nhớ và khả năng đáp ứng miễn dịch ghi nhớ khi tiếp xúc với kháng nguyên ấy trong tơng lai. Kháng nguyên không nhất thiết phải là toàn bộ hạt virus, chúng có thể chỉ là một bộ phận của virus có khả năng kích thích cơ thể sản xuất kháng thể hoặc xytokin trung hoà virus [2]. Đối với các nớc đang phát triển, vaccine đợc coi là biện pháp phòng và chữa bệnh hiệu quả nhất, do tại đây bệnh truyền nhiễm vẫn còn là căn bệnh nguy hiểm, cha có thuốc điều trị đặc hiệu hoặc nếu có thì giá thành lại quá cao so với thu nhập của ngời dân. Còn với những nớc phát triển, tình hình mắc bệnh truyền nhiễm và tỷ lệ tử vong do bệnh này đã giảm đáng kể, ở một số nớc, tỷ lệ tử vong chỉ còn chiếm 4 - 8% tổng số các trờng hợp tử vong. Điều này không có nghĩa là vaccine không còn quan trọng ở các nớc này nữa. Thực tế cho thấy rằng, tỷ lệ bệnh truyền nhiễm giảm đáng kể là nhờ việc sử dụng một cách rộng rãi vaccine cho việc phòng chống bệnh trong nhiều thập kỷ qua. Ví dụ cụ thể đối với bệnh đậu mùa, năm 1967 có tới hơn mời triệu ngời mắc, bệnh này đã lan truyền trên 30 nớc, nhng đến nay nhờ việc sử dụng vaccine trong nhiều năm mà ngời ta đã loại bỏ đợc hoàn toàn căn bệnh này [2]. ở Việt Nam, sau một thời gian dài thực hiện việc tiêm chủng liên tục, vào năm 2000 chúng ta đã tuyên bố với cả thế giới về việc đã thanh toán xong bệnh bại liệt.Hiệu quả của việc sử dụng vaccine không chỉ giới hạn ở mặt phòng và chữa bệnh mà còn rất có lợi về mặt kinh tế. Chi phí cho tiêm chủng rẻ hơn rất nhiều so với để cho ngời dân mắc bệnh rối mới chữa. Các thuốc kháng sinh cũng nh hoá trị liệu thờng rất đắt tiền, đấy là cha kể tới chi phí về đi lại, giảm năng suất lao động, gây ra tác dụng phụ cũng nh gia tăng chi phí về dịch vụ y tế [9].3 Bên cạnh đó vaccine còn có vai trò quan trọng trong ngành thú y, đặc biệt đối với các cơ sở chăn nuôi có mật độ gia súc cao làm cho khả năng lây nhiễm gia tăng nhanh chóng. Nhất là trong tình trạng hiện nay, chúng ta đang phải đối phó với nhiều loại dịch bệnh gây tổn thất nặng nề cho nên kinh tế quốc dân, điển hình là bệnh cúm gia cầm xuất hiện gần đây ở nớc ta [4].Hiện nay, nhiều loại accine giảm độc lực và vaccine bất hoạt đang đợc sử dụng để dự phòng nhiều loại bệnh khác nhau. Vấn đề đáng lo ngại là các vaccine sống giảm độc lực gặp phải là sự phục hồi trở lại khả năng gây bệnh của chúng. Chẳng hạn nh vaccine Sabin (vaccine giảm độc lực để phòng bệnh bại liệt), trình tự axit nucleic của chủng vaccine và chủng hoang dại chỉ khác nhau có hai nuclêotit vì vậy theo thời gian chúng có thể đột biến ngợc trở lại thành chủng hoang dại có khả năng gây bệnh. Theo thống kê gần đây cho thấy, từ năm 1973 đến năm 1984 khi sử dụng vaccine Sabin để phòng bệnh bại liệt, cứ 520 nghìn trờng hợp sử dụng thì có một trờng hợp mắc bệnh bại liệt do virus đột biến ngợc trở lại. Còn có một điều nguy hiểm nữa là vaccine giảm độc lực là các virus sống, chúng có thể nhân lên hoặc tồn tại dới dạng tiểm ẩn trong cơ thể và có thể gây hậu quả nghiêm trọng trong tơng lai. Một nguy cơ nữa là, tác nhân giảm độc lực dùng trong sản xuất vaccine tuy không có khả năng gây bệnh đối với cơ thể ng-ời khoẻ mạnh nhng lại vẫn có khả năng gây bệnh đối với ngời bị suy giảm miễn dịch. Do đó, đối với một số nớc đang phát triển, vẫn đề sẽ là rất đáng lo ngại nếu có nhiều trẻ em bị suy giảm miễn dịch do suy dinh dỡng đợc dùng loại vaccine này [6].Công nghệ ADN tái tổ hợp và phơng pháp tổng hợp bằng phơng pháp hoá học có vai trò rất lớn trong việc khắc phục những vấn đề trên, cho phép chúng ta sản xuất đợc các vaccine phòng bệnh mà đối với phơng pháp cổ điển không thể tạo ra đợc.1.1.2. Vaccine tái tổ hợpCùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, có rất nhiều loại vaccine mới đợc tạo thành. Những loại vaccine này đã khắc phục đợc những bất lợi của các loại vaccine cổ điển và có hiệu lực cao hơn, chúng đợc gọi là vaccine tái tổ hợp. Vaccine tái tổ hợp không đợc sản xuất theo cách thông thờng, chúng đợc sản xuất ra từ một loại cơ thể sống có thể đợc xem là hoàn toàn vô hại. Để tạo ra đợc một loại vaccine tái tổ hợp trớc hết ngời nghiên cứu phải xác định đợc phân tử nào tạo ra đáp ứng miễn dịch đặc hiệu, những phân tử này có thể là các protein, glycoprotein hoặc thậm chí là một đoạn phân tử ADN (DNA vaccine). Phơng pháp ADN tái tổ hợp có thể 4 đợc sử dụng để tạo ra hàng loạt phân tử này trong những vi sinh vật vô hại nh E. coli, nấm men hoặc tế bào động vật với các vectơ là các virus không gây bệnh nh Baculovirus, Vaccinia virus, Adenovirus [4]. Bằng phơng pháp này, ngời ta có thể tạo ra đợc vaccine ngay cả khi các tác nhân gây bệnh không thể nuôi cấy đợc hoặc các tác nhân có thể nuôi cấy đợc nhng trong điều kiện rất khó khăn đòi hỏi chi phí tốn kém. Không những thế, vaccine tái tổ hợp có khả năng gây đáp ứng miễn dịch định hớng với từng thành phần của virus, ổn định, có thể không cần bảo quản lạnh và rất an toàn vì gen độc đã đợc loại trừ [27]. Các vaccine thế hệ mới bao gồm: Vaccine dới đơn vị (subunit vaccines) chỉ chứa một số phân tử nhất định của tác nhân gây bệnh, ví dụ nhvaccine viêm gan B đợc sản xuất bằng công nghệ ADN tái tổ hợp đang đợc sử dụng rộng rãi trên thế giới, hoặc vaccine ADN là những phân tử ADN có khả năng gây phản ứng miễn dịch. Mặc dù, công nghệ ADN tái tổ hợp và phơng pháp tổng hợp hoá học đã có vai trò rất lớn trong việc khắc phục những bất lợi của các loại vaccine cổ điển, nhng cho đến nay số vaccine tái tổ hợp đợc sản xuất và đa ra thị trờng không nhiều. Đối với một số loại vaccine do cấu trúc của phân tử kháng nguyên nên việc biểu hiện chúng ở đối tợng vi sinh vật gặp rất nhiều khó khăn nh vaccine dại, vaccine viêm não Nhật Bản. Vấn đề đặt ra ở đây là phải tìm ra đợc một hệ thống biểu hiện đầy đủ phân tử kháng nguyên của virus. Trên thế giới, nhiều nhà khoa học đang tập trung nguyên cứu sản xuất vaccine trên các đối tợng cây trồng nh: cây thuốc lá, cây lạc, khoai lang, cà chua, chuối h ớng nghiên cứu này tỏ ra rất có triển vọng. Bởi vì, vaccine đợc sản xuất theo cách này không những đã khắc phục đợc những nhợc điểm của các vaccine cổ điển mà còn làm giảm đáng kể giá thành sản phẩm so với vaccine đợc sản xuất trên tế bào động vật, vaccine thực vật có thể đợc sản xuất một lợng lớn với kỹ thuật đơn giản phù hợp với trình độ của các nớc nghèo. Bên cạnh đó vaccine thực vật còn có giá trị sử dụng và bảo quản, vì nó là loại vaccine ăn đợc hoặc uống đợc (edible vaccine, oral vaccine) [26].1.2. Bệnh dại ( Rabies disease)Virus dại thuộc họ Rhabdoviridae, chi Lysavirrus là loại virus hớng thần kinh gây bệnh rất nặng cho các loài động vật máu nóng vì tế bào thần kinh không thể tái sinh đợc, hơn nữa khi virus nhân lên sẽ làm mất tính gây độc của tế bào [10]. Virus có hình viên đạn, trọng lợng phân tử 3,5 - 4,6 x 106mol wt với chiều dài khoảng 180nm, đ-ờng kính 75nm, chứa genome là ARN sợi đơn âm (-). Virus nhân lên trong tế bào chất và nảy chồi từ màng sinh chất [16]. 5 Hình 1. ảnh chụp virus dại dưới kính hiển vi điện tử Bệnh dại đợc truyền cho ngời thông qua các vết cắn của các loài vật trung gian. Các loài thú ăn thịt hoang dã và súc vật nuôi trong nhà (chó, cáo, chó sói, chồn, mèo, dơi ) đều có thể là ổ chứa virus dại. ở trung Mỹ và Nam Mỹ có những đàn dơi hút máu, dơi ăn quả và dơi ăn côn trùng cũng bị nhiễm virus dại. Còn đối với nớc ta, nguồn truyền virus dại cho ngời chủ yếu là chó, mèo nuôi trong nhà (khoảng gần 97%) [11]. Bệnh dại xảy ra hầu hết các nớc trên thế giới loại trừ một số hòn đảo vùng Caribê, nớc Anh, Ireland, Nhật Bản, Đài Loan, Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha. ở vùng Tây Âu, Canađa, US, và một vài nớc châu Mỹ Latin bệnh dại đã đợc phòng trừ đối với các vật nuôi trong nhà, tuy nhiên virus dại vẫn còn tồn tại ở trong những loài động vật hoang dã [32].Khi ngời bị con vật nhiễm dại cắn, virus từ nớc bọt của con vật sẽ xâm nhập trực tiếp vào hệ thống thần kinh ngoại biên và tấn công vào hệ thống thần kinh trung ơng hoặc chúng cũng có thể nhân lên trong tế bào cơ. Thời gian ủ bệnh trong 2 - 8 tuần lễ (có thể chỉ khoảng 10 ngày nhng cũng có thể kéo dài một năm, thậm chí lâu hơn). Thời gian ủ bệnh tuỳ thuộc vào vị trí vết cắn và số lợng virus xâm nhập vào cơ thể qua vết cắn. Nếu vết cắn gần đầu và cổ thì thời gian ủ bệnh sẽ rất ngắn. Cơn dại bắt đầu với cảm giác sợ hãi, đau đầu, sốt, khó chịu và cảm giác dị thờng liên quan đến vết thơng do súc vật cắn. Mỗi khi nhìn thấy nớc hoặc uống nớc, cơ nuốt co thắt làm cho bệnh nhân sợ hãi. Sau đó bệnh tiến triển đến liệt, co cơn điên cuồng hoặc co giật. Bệnh thờng kéo dài từ 2 đến 6 ngày, đôi khi lâu hơn. Nạn nhân chết do liệt cơ hô hấp. Tất cả những bệnh nhân khi đã lên cơn dại đều dẫn đến tử vong [6].Việt Nam, trớc 1999, mỗi năm có hàng triệu ngời bị chó dại cắn phải tiêm phòng dại, 400 - 500 ngời chết do bệnh này: trong đó 30% là các cháu nhỏ dới 14 tuổi. ớc tính mỗi năm, Việt Nam phải tốn tới vài chục tỷ đồng để mua vaccine cho ngời và chó mèo. Hiện nay, số lợng tử vong do bệnh dại đã giảm 65%. Tuy nhiên, hàng năm vẫn có 50 - 6 60 trờng hợp tử vong do bệnh dại và hơn 650.000 ngời bị súc vật cắn phải đi tiêm phòng. Bệnh dại xảy ra vào tất cả các mùa trong năm, nhất là vào mùa hè, tình hình dịch bệnh càng tăng cao. Hầu hết các địa phơng trên cả nớc đều có ngời và súc vật mắc bệnh dại, trong đó đồng bằng sông Hồng và trung du Bắc Bộ phổ biến hơn cả [11]. Gần đây, nguy cơ này càng tăng cao khi bệnh dại diễn ra phức tạp ở nhiều nớc láng giềng. Từ năm 2001 đến nay số ngời tử vong do bệnh dại tại Trung Quốc liên tục tăng từ 850 ngời lên tới 1.300 ngời nguyên nhân là số chó cảnh và số chó hoang dại gia tăng, tỷ lệ đợc tiêm phòng thấp. Hàn Quốc đã đợc công nhận là thanh toán đợc hoàn toàn bệnh dại nhng trong năm 2003 lại có 2 ngời chết vì bệnh dại. Việt Nam có quan hệ mua bán súc vật với các nớc kể trên lại có khí hậu nóng ẩm nên rất rễ phát triển bệnh dại [11].1.2.1. Gen mã hoá cho kháng nguyên glycoprotein của virus dại Virus dại thuộc họ Rhabdoviridae, chúng là những virus ARN, sợi đơn âm (-). Chính vì thế, dạng ARN anti-sense của nó mang thông tin cần thiết để mã hoá cho những protein virus. Điều này có nghĩa rằng, sợi ARN của hạt virus không trực tiếp tham gia vào quá trình tổng hợp protein mà chúng đợc sao thành sợi dơng có vai trò là ARN thông tin. Để làm đợc điều này, khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus phải mang theo một enzym ARN polymerase phụ thuộc ARN (enzym tổng hợp sợi ARN bổ sung từ sợi khuôn ARN) [30].Giống nh tên gọi của chúng, những virus này có dạng hình que, có một đầu tròn thờng đợc ví với hình viên đạn. Lớp màng ngoài có nguồn gốc từ màng tế bào chất của tế bào vật chủ do chúng nhân lên trong tế bào chất và xuất bào bằng cách nảy chồi ra từ màng sinh chất [10]. Một hạt virus bao gồm một lõi nucleocapsid là ribonucleoprotein có vai trò quyết định đến tính lây nhiễm của virus. Đó là một cấu trúc chuỗi xoắn nằm bên trong lớp màng của virus. Chuỗi ARN của virus dài 12 Kb, mã hoá cho 5 loại protein đó là [33].- Protein G (Glycoprotein): là những glycoprotein có trọng lợng phân tử 67kDa tồn tại dới dạng trime đợc mã hoá bởi đoạn gen dài 1675bp. Glycoprotein tạo thành chồi gai bề mặt dài khoảng 5 - 10nm, mang tính kháng nguyên kích thích cơ thể sản xuất ra kháng thể trung hoà hạt virus.7Hình 2. Cấu trúc virus dại - Protein M (matrix): đây là một protein màng ngoại vi có trọng lợng phân tử 26kDa. Về chức năng của chúng vẫn đang còn là vấn đề gây tranh cãi, cũng có thể nó hoạt động với vai trò là cầu nối giữa nucleocapsid với màng tế bào hoặc lớp gai glycoprotein bề mặt.- Protein N (nucleoprotein) là cấu trúc bao quanh ARN genome virus có trọng l-ợng là 55kDa. Tác dụng của protein này là bảo vệ genome tránh đợc sự phân cắt của nucleases và giữ cho nó có hình dạng thích ứng trong quá trình dịch mã.- Protein L (lagre) và NS (một loại protein phi cấu trúc, nó cũng đợc biết đến nhphosphoprotein có khối lợng phân tử 38 kDa) hai protein này cùng nhau tạo nên dạng ARN polymerase phụ thuộc ARN. Protein L có khối lợng phân tử 110kDa và đoạn gen mã hoá cho nó chiếm khoảng 60% (6475bp) chiều dài của hệ gen [33].Nhờ ứng dụng những tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, đặc biệt là kỹ thuật ADN tái tổ hợp, chúng tôi đang tiến hành thiết kế vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá cho phân tử glycoprotein của virus dại để chuyển vào thực vật và thực vật cải biến di truyền này sẽ sản xuất ra vaccine dại.1.2.2. Phân tử glycoprotein của virus dại và cơ chế gây miễn dịch .Phân tử glycoprotein của virus dại tạo thành một lớp gai bề mặt cắm sâu vào màng của virus, có khối lợng là 65kDa, thờng tồn tại ở dạng cấu trúc trime, là một protein vận chuyển màng (transmembrane). Một hạt virus có khoảng 1200 protein G 8Hình 3. Hệ gen của virus dại tạo thành 400 trime, giữ vai trò nh một kháng nguyên khi liên kết với tế bào đích đồng thời có tác dụng dung hợp virus với màng tế bào vật chủ khi xảy ra quá trình nhập bào [34]. Quá trình xâm nhập của virus xảy ra theo con đờng nhập bào bởi vì phân tử dạng trime có thể chịu đợc pH 6,1. ở pH này cấu trúc trime của phân tử rất bền vững và có thể cho phép một vùng kị nớc trên phân tử đợc bộc lộ và gắn vào màng của tế bào vật chủ khi xâm nhập [18]. Virus dại cũng nh các loại khác thuộc chi lysavirus là một loại virus hớng thần kinh gây ra bệnh viêm thần kinh cấp tính ở nhiều loài động vật có vú. Virus bền vững ở từ pH 3 đến pH 11, và có thể sống nhiều năm ở -70oC hoặc đợc đông khô và giữ ở 0 - 4oC. Nhng nó cũng bị bất hoạt nhanh chóng khi bị sấy khô, dới tác dụng của tia UV, tia X, ánh sáng mặt trời, trypsin, -proplolactone, hoặc các chất tẩy rửa khác [10]. Phân tử glycoprotein liên kết với thụ thể đặc hiệu sẽ gây đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào có sự tham gia của những tế bào T và T- bổ trợ. Khi đợc kích thích, tế bào T sẽ tiết ra lymphokin hoạt hoá các đại thực bào, những đại thực bào này sẽ tới và diệt virus. Còn tế bào T- bổ trợ, chúng sẽ kích thích tế bào B sản xuất ra kháng thể trung hoà virus [9]. Liên kết đặc hiệu của phân tử glycoprotein với các phân tử trên bề mặt tế bào thần kinh là một minh chứng, khẳng định sự tồn tại của thụ thể tế bào thần kinh đặc hiệu cho phân tử glycoprotein. Trong một nghiên cứu gần đây, ngời ta sử dụng glycoprotein dạng hoà tan để kiểm tra trên ngân hàng tế bào thần kinh phôi, và đã chỉ ra đợc sự tồn tại của thụ thể nuerotrophin p75 murine với vai trò là một thụ thể của glycoprotein. Thụ thể p75 nuerotrophin tồn tại bền vững trong động vật có xơng sống và việc biểu hiện của nó tuỳ thuộc vào sự phát triển của bệnh. Trong quá trình phát sinh phôi, p75 tồn tại ở cả tế bào nơron thần kinh và tế bào khác, nhng đến tuổi trởng thành nó chỉ đợc biểu hiện ở tế bào thần kinh ngoại vi và tế bào thần kinh trung ơng. p75 có chứa 4 miền giàu sistein (CRD) ở đầu N, đây là đặc điểm đặc trng của liên họ thụ thể TNF. Nhng khác với cấu trúc trime của họ TNF, họ NGF của ligand neurotrophin lại có cấu trúc dime. ái lực liên kết với p75 dao động trong khoảng vài nanogram, vị trí liên kết đã đợc xác định là một vùng bao gồm cả CRD2 và CRD3. Vai trò sinh lý học của liên kết này trong các nơron thần kinh ngày nay vẫn còn đang là một vấn đề tranh cãi. Một vài hớng nghiên cứu mới đây khám phá ra rằng, tiền neurotrophin cũng có ái lực cao với p75 [25]. 9 1.3. Vi khuẩn agrobacterium timefaciens và hiện tợng biến nạp gen vào thực vật.Trong tự nhiên chúng ta thờng gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm một loại khối u gồm các loại tế bào không phân hoá và phát triển không có tổ chức. Những khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống nh tế bào ung th ác tính ở động vật. Theo cơ chế hình thành ngời ta phân biệt hai loại khối u chính. Đó là khối u di truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thờng xuất hiện ở một vài cặp lai có tính chất hoà hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài khác chi của thuốc là Nicotiana hoặc chi rau cải Brasica. Loại khối u cảm ứng đợc biết đến nhiều nhất là khối u crown gall do loại vi khuẩn đất a. tumefaciens gây nên. Cơ chế chính hình thành khối u cảm ứng này đợc Braun và Schiperoort nghiên cứu kỹ năm 1960 và đa lại những thành tựu quan trọng cho việc phát triển kỹ thuật di truyền tế bào thực vật [4]. Về bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u ở thực vật, trớc hết là quá trình nhiễm vi khuẩn a. tumefaciens ở các vùng tế bào bị thơng của cây. Bởi vì, các tế bào bị thơng ở cây tiết ra những hợp chất polyphenol là acetosingone (AS) có chức năng dẫn dụ tế bào vi khuẩn a. tumefaciens. Các tế bào vi khuẩn không xâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển nạp cho chúng một loại plasmid gây nên tính trạng phát sinh khối u đợc gọi là Ti-plasmid (Tumor inducing). Cho đến nay trình tự nuclêotit của Ti-plasmid đã đợc xác định. Ti plasmid là một phân tử ADN vòng tơng đối lớn gồm 150.000 - 200.000 cặp nuclêotit. Tuy nhiên, chỉ có một đoạn gồm 2000 - 3000 cặp nuclêotit có khả năng gắn vào hẹ gen của tế bào chủ đợc gọi là T-ADN. Những enzym có trách nhiệm chuyển nạp đoạn T-ADN từ plasmid vào hệ gen của tế bào chủ đợc mà hoá bởi các đoạn gen vir [17]. Bên cạnh những gen chức năng vừa kể trên Ti-plasmid có mang gen tổng hợp indolyl acetic axit, một loại auxin tự nhiên, vì thế mà khi nuôi cấy in vitro những tế bào thực vật cảm biến có thể sống trong môi trờng thiếu auxin và cytokinin. Ngoài ra, Ti-plasmid còn mang gen tổng hợp những axit amin hiếm, ví dụ: một loại u tạo octopin và loại khác tạo nopalin vì vậy ngời ta phân biệt 2 loại plasmid là loại nopalin và octopin có trong các chủng a. tumefaciens khác nhau. Về trình tự nuclêotit chúng chỉ khác nhau ở đoạn gen mã hoá cho các enzym tham gia vào quá trình sinh tổng hợp nopalin và octopin [1].10 [...]... đoạn gen GlyP khoảng 1,5Kb Nh vậy có thể kết luận chúng tôi đã thiết kế và biến nạp thành công Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen GlyP vào trong tế bào E coli DH5 Tế bào vi khuẩn đợc giữ chủng trong glycerol ở -85oC 3.4 Kết quả biến nạp Ti-plasmid tái tổ hợp pbi121 mang gen glyP vào tế bào A tumefaciens 3.3.1 Biến nạp Ti-plasmid tái tổ hợp vào tế bào A tumefaciens Có nhiều phơng pháp chuyển gen vào... điện Gene Plulser, cùng với các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học 2.2 Phơng pháp nghiên cứu Sản phẩm PCR-GlyP BamHI pBI121 35S SacI gus NOST pBI121 Bam HI & Sac I Sac I BamH I pBI121 35S gus GlyP NOST pBI121 T4 - ligase BamHI pBI121 35S GlyP SacI NOST pBI121 Hình 5 Sơ đồ thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen GlyP 18 2.2.1 PCR nhân gen đặc... vật nh chuyển gen thông qua A tumefaciens, chuyển gen trực tiếp vào các tế bào trần và thể transient, chuyển gen trực tiếp qua tế bào trần và chuyển nạp gen bằng thiết bị bắn genPh ơng pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens vừa cho hiệu quả cao, đơn giản lại ít tốn kém rất phù hợp với nớc ta nên đợc lựa chọn để chuyển các kết cấu gen thiết kế đợc vào một số cây trồng Chúng ta đã biết, Ti-plasmid. .. invitrogen tổng hợp - Plasmid (vectơ pCRđ2.1+ gen GlyP) mang toàn bộ gen mã hóa cho phân tử glycoprotein của virus dại chủng Vnucovo-32 Các vật liệu trên đợc Viện Công nghệ sinh học cung cấp 2.1.2 Hoá chất, thiết bị * Hóa chất Hoá chất dùng trong nghiên cứu là của hãng: Invitrogen, Amersham Parmacia Biotech, New England Biolabs Bao gồm một số hoá chất sau: - Bộ hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR của hãng... vectơ Ti-plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc 35S/GlyP/NOS vào tế bào khả biến E coli DH5 Vectơ tái tổ hợp đợc đa vào tế bào E coli khả biến bằng phơng pháp sốc nhiệt ( mục2.2.7) Khi biến nạp có các trờng hợp sau xảy ra: 32 - Các tế bào không chứa vectơ tái tổ hợp, chúng sẽ không mọc đợc trên môi trờng có chứa kháng sinh kanamycin vì không có gen npt2 mã hoá cho enzym phân giải kháng sinh - Các tế bào mang. .. chuyển nạp ổn định, các yếu tố đa gen chuyển nạp vào vị trí nhất định trong genome thực vật và các điều kiện nuôi cấy tái sinh cây chuyển gen vẫn là những vấn đề cần thiết trong nghiên cứu chuyển gen ở thực vật Hình 4 Sơ đồ cấu trúc vectơ pBI121 14 1.4.3 Tình hình nghiên cứu vaccine thực vật trên thế giới Cho dù hiện nay phần lớn thuốc chữa bệnh đợc tổng hợp bằng phơng pháp hoá học, tuy nhiên 1/3 tổng... bản bằng PCR, nh vậy về mặt lý thuyết gen GUS có thể bị loại bỏ và đợc thay thế bằng gen GlyP Đồng thời vectơ này đợc thiết kế dựa trên vectơ pBIN19 có kích thớc tơng đối nhỏ khoảng 13kb phù hợp với yêu cầu của một vectơ chuyển gen Với tất cả những u điểm trên vectơ pBI121 đã và đang đợc sử dụng làm nguyên liệu cho rất nhiều nghiên cứu chuyển gen Để thu đợc vectơ pBI121 tinh sạch, chúng tôi tiến hành... 5-GCGGATAACAATTTCACACA-3 Đặc biệt, để phục vụ cho việc thiết kế vectơ chuyển gen sau này, chúng tôi đã thiết kế thêm trên cặp mồi trình tự điểm cắt của hai enzym hạn chế là BamHI và SacI Trình tự nhận biết của hai enzym này bao gồm 6 nuclêotit, trong đó trình tự của BamHI là 5-G GATCC-3 và của SacI là 5-GAGCT C-3 Phản ứng PCR đợc tiến hành tơng tự nh mục 2.1 Mặc dù nhiệt độ bắt mối theo tính toán lý thuyết của mồi RabG-start-BamHI... đoạn gen cha hoàn thiện Vì vậy, công việc tiếp theo chúng tôi là tiến hành thôi gel và tinh sạch sản phẩm PCR để thu đợc đoạn gen GlyP có độ tinh sạch cần thiết cho phản ứng cắt enzym hạn chế Quy trình này đợc thực hiện tơng tự nh mục 2.2.3 Sản phẩm ADN thu đợc đợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho bớc thí nghiệm tiếp theo 3.2 Thiết kế ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 Mang gen GlyP dới sự điều khiển của đoạn... đề án chuyển gen mã hoá cho kháng nguyên của một số virus nh virus dại và virus viêm não Nhật Bản vào cây trồng 16 Chơng 2 Vật liệu v à phơng pháp 2.1.Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Các chủng vi sinh vật và cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu - Vi khuẩn A tumefaciens chủng Cv58C1, pGV2206 và pGV3101 và vi khuẩn E.coli chủng DH5 của hãng Gibco BRL, life Technologies, Mỹ - Chủng E Coli Top 10 mang vectơ pBI121 . “ Thiết kế Ti-plasmid tái tổ hợp pBI121 mang gen mã hóa kháng nguyên glycoprotein của virus dại phục vụ chuyển gen với mục đích tạo ra vectơ tái tổ hợp. là kỹ thuật ADN tái tổ hợp, chúng tôi đang tiến hành thiết kế vectơ tái tổ hợp mang gen mã hoá cho phân tử glycoprotein của virus dại để chuyển vào thực