Đang tải... (xem toàn văn)
Lúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam
MỞ ĐẦULúa là một trong những cây lương thực chính của hơn một nửa dân số trên thế giới (IRRI, 1994). Sản xuất lúa gạo chủ yếu tập trung ở các nước châu Á. Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng là cái nôi của nền văn minh lúa nước. Đã từ lâu cây lúa trở thành cây lương thực chủ yếu, có ý nghĩa đáng kể trong nền kinh tế và xã hội nước ta. Năm 2003, sản lượng xuất khẩu gạo Việt Nam đạt 4,2 triệu tấn, tăng 11% so với năm 2000 [12]. Tuy nhiên, thực tế cho thấy có nhiều yếu tố làm giảm năng suất và chất lượng lúa gạo. Trong số đó, bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên là một trong những yếu tố hạn chế sự phát triển của lúa, bệnh có khả năng lây nhiễm mạnh và rất khó khống chế. Ở những nơi bệnh phát triển mạnh, năng suất lúa có thể giảm đến 60%. Để phòng trừ bệnh bạc lá vi khuẩn người ta thường sử dụng thuốc hoá học, song việc dùng thuốc gây độc hại cho người sử dụng và làm ô nhiễm môi trường. Hạn chế những độc hại trên thì việc gieo trồng các giống lúa kháng bệnh là có triển vọng nhất. Nhưng thực tế, giống kháng chỉ tồn tại vài năm trong sản xuất sau đó nông dân phải thay thế bằng giống mới hoặc phun thuốc diệt bệnh, vì nòi bệnh có độc tính cao hơn phát triển [10]. Để khắc phục được bệnh bạc lá vi khuẩn một cách hiệu quả, các nhà chọn giống đang sử dụng các giống kháng bệnh lai với các giống có năng suất, chất lượng cao nhằm thu được các giống vừa kháng bệnh, năng suất cao và có chất lượng tốt. Hiện nay, các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được các giống lúa mang các gen kháng với các nòi khác nhau của bệnh bạc lá vi khuẩn. Đây là những nguồn gen quí trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cũng như các trong nghiên cứu đa dạng di truyền [4], [10]. Trong những năm 90, kỹ thuật sinh học phân tử đã trở thành công cụ rất có hiệu quả trong phân tích đa dạng, bảo tồn và tiến hóa giống loài ở sinh vật. Nghiên cứu đa dạng trên đối tượng lúa là vấn đề được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và kết quả là có rất nhiều công trình chỉ ra mức độ đa hình ở lúa khi sử dụng chỉ thị RAPD [14], [29] và RELP [18], [25]. Trong các loại chỉ thị, thì chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) đơn giản, ít tốn kém nên được sử dụng rộng rãi hơn các chỉ thị AFLP, RFLP, SSR. Sử dụng chỉ thị RAPD, các nhà khoa học có thể đánh giá và phân loại tập đoàn giống cây trồng một cách nhanh chóng và chính xác. Trên thực tế, chỉ thị RAPD cho kết quả đặc trưng đối với từng cá thể và 1 có thể ứng dụng chỉ thị này để phân tích tính đa hình ADN nhờ sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên. Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi thực hiện đề tài: ‘‘Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD” với mục tiêu: đánh giá đa dạng phân tử của 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn, nhằm phục vụ việc xác định bố mẹ trong nghiên cứu lập bản đồ và chọn tạo giống lúa kháng bệnh.2 Chơng 1. TổNG QUAN TàI LIệU1.1. giới thiệu về cây lúa Cây lúa thuộc họ hòa thảo (Poaceae), thân bụi, lá mềm. Lúa trồng thuộc chi Oryzae với nhiều loài khác nhau. Trong số 23 loài đã đợc phân loại thì chỉ có hai loài là O. glaberrima và O. sativa đợc trồng cấy. Loài O. glaberrima đợc trồng chủ yếu ở một số nớc miền Tây châu Phi. Còn loài O. sativa có ở khắp thế giới và tập trung phần lớn ở châu á. Loài O. sativa đợc chia làm 3 loài phụ: Indica, Japonica, Javanica. Lúa Indica đợc trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới; Japonica đợc trồng chủ yếu ở các vùng ôn đới và cận ôn đới; Javanica chỉ đợc trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia (Khush, 1997). Loài Oryza sativa có số nhiễm sắc thể là 2n = 24. Tám trong số 23 loài lúa dại có bộ gen ở thể tứ bội, còn lại đa số các loại lúa dại và lúa trồng hiện nay có bộ gen là thể lỡng bội (Khush, 1997) [7], [21]. Lúa phân bố khắp thế giới, trải từ vĩ độ 550 Bắc thuộc Trung Quốc đến 36 0 Nam thuộc Chi Lê. Theo FAO (1999) diện tích đất canh tác lúa trên toàn thế giới khoảng 150 triệu ha. Riêng Trung Quốc và ấn độ chiếm khoảng 50% diện tích trồng lúa và 56% sản lợng lúa toàn cầu. Châu Phi có diện tích trồng lúa gần bằng diện tích trồng lúa của Việt Nam, nhng sản lợng lúa lại thấp hơn từ 2 đến 3 lần [2], [7]. 1.2. Bệnh bạc lá vi khuẩn ở lúa (Xanthomonas oryzae)Bệnh bạc lá (còn gọi là bệnh cháy bìa lá) là một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây nên. là một trong những bệnh hại lúa nguy hiểm. Bệnh xuất hiện lần đầu tiên ở Nhật Bản năm 1884. Năm 1960, bệnh lan truyền sang, sau nguồn bệnh đợc tìm thấy ở các vùng khác ở châu Phi, Australia, Mỹ và một số nớc Mỹ La Tinh. ở Việt Nam, bệnh phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trong cả nớc, từ vùng núi cao đến ven biển. Bệnh có thể làm giảm năng suất từ 6 - 60%. Bệnh phá hại trong cả vụ Đđông xuân, hè Hè thu và vụ mMùa., đặc biệt, bệnh gây hại nặng trong các tháng nhiệt độ cao. Ma bão là điều kiện để Hình1: Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa vi khuẩn do Xathomonas oryzae gây ra3 bệnh lây lan và phát triển mạnh. Trong những năm 1970 - 1975, bệnh phát triển và gây thiệt hại nặng cho ở lúa ở khắp các tỉnh phía Bắc [2].1.2.1. Vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa (Xanthomonas aryzae)Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có hình gậy ngắn, hai đầu tròn, là vi khuẩn Gram (-) và không hình thành bào tử. Các tế bào vi khuẩn đợc bọc trong màng nhầy và liên kết với nhau thành một khối tơng đối vững chắc ngay cả trong nớc. Trên môi trờng nhân tạo, khuẩn lạc có màu vàng nhạt và có thể sống trong phạm vi pH 4,0 - 8,8. Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trởng là 260C - 300C, nhiệt độ tối thiểu là 550 C - 100C và nhiệt độ tối đa là 400C [9], [11]. Vi khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động và có thể xâm nhiễm qua thủy khổng, lỗ khí ở trên mép lá, đặc biệt qua vết thơng xây xát trên lá. Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nớc, vi khuẩn dễ dàng di động và xâm nhập vào bên trong qua các lỗ khí, qua vết thơng để nhân lên về mặt số lợng, sau đó theo các bó mạch dẫn lan rộng đi. Trong điều kiện ma ẩm, trên bề mặt vết bệnh sẽ tiết ra những giọt dịch vi khuẩn và thông qua sự va chạm giữa các lá lúa, bệnh có thể lan truyền từ lá này sang lá khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều lần trong thời kỳ sinh trởng của cây lúa [6], [9].Hiện nay, có rất nhiều nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá, phân bố ở nhiều nớc trên thế giới. Các nhà khoa học có thể phân loại các nòi X. oryzae theo tính gây bệnh của chúng. Nhìn chung, các nòi vi khuẩn khá khác nhau về tính gây bệnh và trở nên độc hơn khi truyền lặp đi lặp lại qua các thế hệ của giống kháng bệnh, nhng tính gây bệnh vẫn không thay đổi hoặc giảm đi khi xâm nhiễm qua các giống lúa mẫn cảm [11].1.2.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá vi khuẩnBệnh bạc lá vi khuẩn thờng phát sinh dới dạng các sọc vàng kéo dài từ mép lá cách đỉnh vài cm. Trên phiến lá, vết bệnh lan rộng theo cả chiều dài và rộng, có mép viền hình sóng rồi trở nên vàng sau vài ngày. Khi bệnh tiến triển, vết bệnh lan rộng phủ kín cả mặt lá, chuyển từ trắng sang xám nhạt do sự sinh trởng của các nấm hoại sinh. Đối với các giống cảm nhiễm, vết bệnh lan rộng tới bẹ lá và có thể phát triển xuống tận phần dới của bẹ lá, làm phiến lá bị héo và cuộn lại trong khi lá vẫn còn xanh, sau đó toàn bộ phiến lá có thể bị héo rồi khô đi. ở các ruộng lúa bị bệnh nghiêm trọng, hạt cũng có thể bị nhiễm bệnh. Trên vỏ hạt xuất hiện các đốm màu nhạt, xung quanh có mép viền dạng giọt dầu. Khi hạt 4 còn non và xanh các vết bệnh lộ rõ, khi bông chín vết bệnh sẽ có màu xám,, hoặc trắng hoặc vàng nhạt [6], [19].1.2.3. các yếu tố ảnh hởng đến sự phát triển của bệnhTrong dự báo bệnh bạc lá, yếu tố khí hậu là đối tợng để phân tích. Các nhà khoa học phát hiện thấy rằng mức độ nhiễm bệnh tơng quan với tổng lợng ma, mức độ ngập lụt, gió mạnh và độ sâu nớc tới. Nhiệt độ tơng đối cao trong thời kỳ lúa sinh trởng có thể làm tăng bệnh, song mùa hè quá nóng và khô là điều kiện hạn chế bệnh.Kỹ thuật trồng trọt cũng là một trong những điều kiện quan trọng ảnh hởng đến sự phát sinh, phát triển bệnh, song cũng rất phức tạp vì một mặt nó ảnh hởng tới sự phát sinh phát triển của cây lúa - làm tăng hay làm giảm tính chống chịu, mặt khác nó ảnh hởng tới tiểu khí hậu đồng ruộng. Trong các yếu tố kỹ thuật chăm sóc thì phân bón có ảnh hởng rõ rệt nhất tới sự phát sinh, phát triển của bệnh. Cụ thể là bón đạm quá nhiều, bón thúc muộn, thiếu lân, kali và magie đều làm tăng bệnh. ở những nơi đất chua, úng ngập đặc biệt ở những vùng đất nhiều mùn, hàng lúa bị chắn nắng thì bệnh bạc lá có thể phát triển mạnh hơn [6].Trong tất cả các giai đoạn sinh trởng, cây đều có thể bị nhiễm bệnh nhng ở mức độ khác nhau tuỳ từng giai đoạn sinh trởng. Nói chung, từ thời kì mạ đến khi lúa đẻ nhánh là thời kỳ bệnh tơng đối ít hơn so với giai đoạn cuối đẻ nhánh. Giai đoạn lúa làm đòng - trỗ - chín sữa là giai đoạn rất mẫn cảm với bệnh, hiện tợng này thể hiện khá rõ nét trên các giống lúa ngắn ngày, chịu phân, có năng suất cao, cấy trong vụ Chiêm xuân và vụ Mùa [11].1.2.4. Tác hại của bệnh bạc lá lúa vi khuẩn Bệnh bạc lá vi khuẩn đã làm giảm năng suất lúa gạo hằng năm ở Châu á xuống 60%. Ví dụ ở Nhật những năm gần đây, có khoảng 300.000 - 400.000 hecta lúa bị ảnh hởng bởi bệnh này và năng suất giảm 20 - 50%. ở những cánh đồng nhiễm bệnh ngiêm trọng ở Indonesia, sản lợng lúa còn thấp hơn so với ở Nhật; còn ở ấn độ, hàng triệu hecta lúa nhiễm bệnh nghiêm trọng làm cho năng suất giảm từ 6 - 60%. ở Việt Nam, bệnh bạc lá đợc phát hiện từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, đặc biệt từ năm 1965 trở lại đây bệnh thờng xuyên phá hoại nghiêm trọng ở các vùng trồng lúa [6], [19].thì sao?1.2.5. Các biện pháp phòng trừ5 Căn cứ vào đặc điểm sinh học của vi khuẩn gây bệnh, các nhà khoa học đã đa ra những biện pháp phòng trừ tổng hợp nh: xử lý hạt giống trớc khi gieo nếu lô hạt bị nhiễm bệnh, bón phân đúng kỹ thuật và đúng giai đoạn, ruộng lúa cần điều chỉnh mức nớc thích hợp, chú ý vệ sinh đồng ruộng hoặc có thể sử dụng thuốc hóa học để hạn chế sự phát sinh, phát triển của bệnh . [6].Cho đến nay, việc sử dụng giống chống chịu bệnh vẫn là biện pháp có hiệu quả nhất vì giảm đợc chi phí do sử dụng thuốc hóa học và bảo vệ môi trờng tốt hơn. Chính vì vậy, việc chọn tạo ra những giống lúa kháng bệnh bạc lá luôn là mục tiêu hàng đầu của các nhà tạo giống trên thế giới cũng nh ở Việt Nam [24], [30]. Cùng với sự phát triển của khoa học hiện đại các nhà nghiên cứu tìm thấy khoảng 24 gen kháng bệnh bạc lá ở nhiều loài lúa hoang dại và các giống lúa địa ph-ơng. Gen kháng đợc thống nhất có tên là Xa + số thứ tự, ví dụ nh Xa1, Xa2 . Trong số đó, Xa21 có phổ kháng rộng và đợc chú ý nhiều trong công nghệ chuyển gen hiện nay [20], [27].1.2.6. Một số thành tựu trong chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn Trong 50 năm gần đây, các nhà khoa học đã phát triển nhiều kỹ thuật thanh lọc ngân hàng gen đối với tính trạng chống chịu vi khuẩn, côn trùng gây hại cây trồng, xác định nguồn cung cấp gen kháng. Với phơng pháp chọn giống truyền thống, các nhà khoa học đã tạo ra nhiều giống cây trồng kháng bệnh bạc lá và đợc gieo trồng với diện tích hàng triệu ha. Và c họn giống ngoài đồng ruộng, khảo nghiệm và tạo các giống lúa chống chịu bệnh từ lâu đã đ ợc thực hiện ở nhiều n ớc trên thế giới. Không hiểu ý câu này? ở Nhật Bản, gần đây các nhà khoa học đã chọn đợc nhiều giống lúa kháng bệnh đợc sử dụng để lai tạo ra các giống mới nh giống Sengoku 4, Magatama, Zensho 26, Norin 27 . Tuy nhiên, kết quả kiểm tra ngoài đồng ruộng cho thấy cha chọn đợc giống có tính chống chịu cao với các nòi vi khuẩn gây bệnh bạc lá mới đợc giám định gần đây.Năm 1968, Sakaguchi và CS đã khảo nghiệm 863 giống lúa đợc trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới và phát hiện giống lúa Lead của Miến Điện, TKM6 và Nigeria 5 chống chịu khá với hầu hết các nhóm vi khuẩn gây bệnh bạc lá thuộc các nòi khác nhau [9], [11].ở việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu để chọn tạo giống lúa mang gen kháng bệnh bạc lá. Nh ở Viện Lúa Đồng bằng sông Ccửu lLong, bằng phơng pháp đánh giá kiểu gen nhờ chỉ thị phân tử đối với 148 giống lúa địa phơng có nguồn gốc 6 Duyên hải Trung Bộ cho thấy các giống lúa: Cà Đung, Ba Túc, Thơm Lung, Vệ Phích, Lúa Trắng, Nếp Hoa Vàng, Lúa Thớc, Quinkes 85 và Seraup kechil 30 có gen kháng Xa13; gen kháng Xa5 đợc tìm thấy trên giống Nàng Tri, Trắng Lùn, Be Ren, Giàu Dumont; giống Lúa Sóc, Lúa Mùa 2, Trắng Quãng, Trắng Phớc, Tàu Hơng, Nàng Sậu có gen kháng Xa4 [4].1.3. ứng dụng kỹ thuật RAPD - PCR trong nghiên cứu đa hình ADN1.3.1. Phản ứng PCRKỹ thuật nhân bản ADN đặc hiệu dựa vào phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction) đợc Karry Mullis hoàn thiện vào giữa những năm 80 đã góp phần tạo ra một cuộc cách mạng trong sinh học phân tử. Kỹ thuật PCR là một phơng pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu và phân tích các gen. Sử dụng kỹ thuật PCR có thể tạo ra một số lợng lớn các bản sao của đoạn ADN cần tổng hợp mà không phải tách và nhân dòng. Thực chất PCR là một phơng pháp in vitro vi tro cho phép nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó mà chỉ cần một khối lợng mẫu ban đầu hạn chế [8], [5]. Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn:+ Giai đoạn 1 (Biến biến tính): ADN đợc biến tính ở nhiệt độ khoảng 950C trong thời gian khoảng 1 phút, khi đó các liên kết hidro bị đứt và sợi ADN kép tách thành hai sợi đơn.+ Giai đoạn 2 (Ggắn mồi): ở nhiệt độ từ 300C đến 650C trong khoảng 30 giây đến 1 phút thì các mồi bắt cặp với sợi ADN khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở hai đầu đoạn ADN cần nhân. Nhiệt độ của bớc gắn mồi tùy thuộc vào từng loại mồi cụ thể, đợc tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi [3], [5].Công thức tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của đoạn mồi: Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA)Trong đó: {J+}: nồng độ của các cation hóa trị I FA: chất dùng để gây biến tính ADN I: chiều dài của mồi+ Giai đoạn 3 (tổng hợp ADN): ở nhiệt độ khoảng 720C, trong khoảng thời gian từ 30 giây đến nhiều phút (tuỳ thuộc vào chiều dài đoạn ADN cần tổng hợp), khi đó, enzym Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp ADN diễn ra trên những đoạn giữa cặp mồi theo chiều từ 5- 3. 7 Một chu kỳ gồm 3 bớc trên đợc lặp đi lặp lại nhiều lần và qua mỗi lần làm tăng gấp đôi số mẫu lần trớc. Sự tăng lợng mẫu này theo cấp số nhân, nên sau n chu kì số mẫu thu đợc là: A = x.2nTrong đó A: Tổng số bản sao ADN x: Số lợng phân tử ADN làm khuôn ban đầu n: Số chu kỳCác thành phần cơ bản của một phản ứng PCR gồm: ADN khuôn, hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, Taq polymerase, hỗn hợp bốn tiền chất deoxynucleotit, dung dịch đệm chứa một số cation hóa trị 1, ion Mg2+ và dung môi (nớc khử ion khử trùng).- Enzym Taq polymerase: Enzym Taq polymerase là enzym chịu nhiệt, đợc tách từ vi khuẩn suối nớc nóng Thermus aquaticus. Enzym Taq có trọng lợng phân tử là 94 kDa và không mất hoạt tính ở nhiệt độ cao trong giai đoạn gây biến tính ADN, nhng hoạt tính của enzym Taq giảm 50% sau 150 phút ở nhiệt độ 92,50C; sau 40 phút ở nhiệt độ 950C và sau 5 - 6 phút ở nhiệt độ 970C. Nếu nhiệt độ tăng lên tới 950C trong 20 giây để biến tính ADN kép thành sợi đơn thì hoạt tính enzym Taq còn lại 65% sau 50 chu kì phản ứng.Nồng độ enzym Taq tối u cho phản ứng PCR là 0,5 - 2,5 đơn vị; nhng nếu nồng độ enzym quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất xúc tác của phản ứng. Ngoài ra, nồng độ Mg2+ và dNTP cũng ảnh hởng đến hoạt tính của enzym. Hiện nay, có nhiều loại polymerase chịu nhiệt khác có chức năng riêng biệt và hoàn thiện hơn nh Tth polymerase tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động nh một enzym phiên mã ngợc khi có mặt của ARN khuôn và ion Mn2+.- ADN khuôn (template):ADN khuôn là vật liệu khởi đầu cho phản ứng PCR nên đòi hỏi phải có độ tinh sạch cao. ADN khuôn có thể là sợi đơn hoặc sợi đôi của chuỗi ADN hayARN đợc biết trớc trình tự ở hai đầu để thiết kế mồi. Thông thờng, nồng độ của ADN khuôn đợc đa vào phản ứng PCR khoảng 10 - 500 ng.- Đoạn mồi (primer):8 Các đoạn mồi thực chất là các oligonucleotit dài khoảng 4 - 10 bazơ (đối với mồi ngẫu nhiên) hoặc khoảng 12 - 24 bazơ (đối với mồi đặc trng). Nồng độ mồi thích hợp để tiến hành phản ứng PCR là từ 0,1 - 0,5 àM. Lợng mồi đa vào phản ứng PCR phải phù hợp với lợng ADN cần tổng hợp (thờng 106 phân tử ADN cần 108 phân tử primer). Nếu nồng độ mồi quá thấp thì mồi sẽ hết trớc khi số chu kì kết thúc, còn nồng độ mồi quá cao thì sẽ dễ làm tăng sản phẩm không đặc hiệu.Các đoạn mồi cần có tính đặc thù để làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Mồi phải đợc thiết kế sao cho không đợc bổ trợ lẫn nhau, số lợng 4 loại bazơ nitơ trong mồi nên xấp xỉ nhau, lợng G - C giữa hai mồi phải bằng nhau, tránh những vùng trình tự không bình thờng nh polypurin hoặc polyprimidine hay các trình tự lặp. - Các nucleotit (dNTPs):Là hỗn hợp của bốn loại deoxyribonucleotit (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp ADN. Tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu, các nhà khoa học còn có thể sử dụng một số nucleotit đã đợc thay đổi nh gắn thêm biotin hoặc digoxigenin . Nồng độ phản ứng của các dNTP thờng dùng vào khoảng 200 mM mỗi loại, tuy nhiên ở nồng độ dNTP thấp (10 - 100 mM) Taq ADN polymerase hoạt động chính xác hơn. Hơn nữa, nồng độ tối u của chúng phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nh: + Nồng độ Mg2+ + Nồng độ chất mồi + Độ dài của sản phẩm đợc khuyếch đại + Số chu kỳ của phản ứng- Dung dịch đệm (buffer) Thành phần của dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzym polymerase đợc sử dụng. Trong dung dịch đệm quan trọng nhất là ion Mg2+. Ion Mg2+ làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của ADN mạch đôi, tạo ra phức chất tan với dNTPs để hình thành cơ chất mà enzym polymerase có thể nhận ra, điều này rất cần thiết cho quá trình liên kết của các dNTP. Nồng độ Mg2+ trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng biến đổi từ 0,5 - 5,0 mM (nồng độ này có thể thay đổi khi cần thiết). Nồng độ ion Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm khả năng tổng hợp của enzym polymerase, còn nếu nồng độ quá cao sẽ tạo ra những phân đoạn không đặc hiệu.9 Nhìn chung nồng độ MgCl2 có ảnh hởng nhiều tới hiệu quả và tính đặc thù của phản ứng. Ngoài Mg2+ còn một số chất khác trong dung dịch đệm nh AMSO, DMSO, formamide đợc thêm vào nh các chất phụ gia nhằm tạo ra các sản phẩm PCR có kính thớc lớn [3]. Kỹ thuật PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen của sinh vật vì nó có khả năng tạo ra một lợng lớn trình tự ANDN đặc hiệu từ bất cứ cơ thể nào. PCR đợc sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau nh: xác định trình tự trực tiếp từ đoạn đợc nhân, nhân bản quần thể mARN để làm mẫu lai, xác định các trình tự đặc hiệu từ cADN hay th viện gen, xác định sinh vật chuyển gen, tạo đột biến định hớng [1].1.3.2. Kỹ thuật RAPD và ứng dụngTrong những năm gần đây, nhiều kỹ thuật mới ra đời dựa trên nguyên tắc của PCR cho phép ta xác định đợc tính đa dạng của hệ gen với nhiều u điểm nh kỹ thuật AFLP, SSR, RFLP, RAPD . - Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) cho phép ta phát hiện đợc tính đa dạng về chiều dài các đoạn ADN đợc nhân bản chọn lọc - cắt ra bởi enzym giới hạn. Sử dụng kỹ thuật này có thể nhân cùng một lúc một cách đặc trng với số lợng lớn các đoạn ADN có kích thớc giới hạn. Kỹ thuật AFLP kết hợp đ-ợc những u điểm của RFLP và RAPD nên nó có hiệu quả trong việc phát hiện đa hình ADN. Ngoài ra, kỹ thuật này có thể phân tích tính đa hình một cách nhanh chóng, ổn định và đáng tin cậy [3]. - Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphic ADN - đa hình về chiều dài của các đoạn ADN đợc cắt ngẫu nhiên bởi các enzym giới hạn): Sử dụng kỹ thuật RFLP có thể tạo nên các đoạn cắt khác nhau đợc phân biệt bằng ph-ơng pháp điện di. Nhợc điểm của kỹ thuật này là quy trình phức tạp, cồng kềnh, khó tự động hoá, tốn kém và sử dụng chất đồng vị phóng xạ gây nguy hiểm cho ngời thao tác [3], [8].- Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) hay còn gọi là vi vệ tinh (microsatellites), là một đoạn ADN có sự lặp lại của một trật tự nucleotit đơn giản nào đó. Kỹ thuật SSR cho phép phát hiện đợc tính đa hình về độ dài các trật tự nucleotit đơn giản. Nhợc điểm của kỹ thuật SSR là tốn kém về tiền của, công sức trong việc xây dựng cặp mồi đặc hiệu cho mỗi locus đa hình (để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và đọc trình tự một số lợng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa đoạn lặp lại) [8], [3].10 [...]... nguồn gốc, tính kháng khác nhau với kháng bệnh bạc lá vi khuẩn có nguồn gốc và tính kháng bệnh khác nhau do do Bộ môn Di truyền Miễn dịch, Vi n Khoa học Kkỹ thuật Nnông nghiệp Vi t Nam cung cấp (trình bày nh trong bảng 1, điểm đánh giá tính khángchỉ mới d/nhiễm của các giống lúa chỉ với một nòi vi khuẩn phổ biến ở vùng Đồng bằng sông Hồng) Bảng 1 Danh sách tập đoàn giống lúa kháng bệnh bạc lá vi khuẩn STT... chỉ có giống Tẻ tép, có nguồn gốc Vi t Nam và nhiễm với bệnh bạc lá vi khuẩn Hệ số sai khác so với các giống là 40% 29 Nhóm 4 gồm 2 giống là MILYANG42, BL89 Hai giống này có tính kháng với bệnh bạc lá vi khuẩn (điểm bệnh 3) và có hệ số sai khác với các giống là 38% Nhóm 5 gồm 4 giống BJ1, IRRI346, SUWION290, MILYANG23 Các giống có nguồn gốc từ ấn độ, IRRI và Hàn Quốc, nhiễm vừa, nặng với bệnh bạc lá. .. kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Mức độ khác nhau đợc biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các giống Các giống có hệ số di truyền giống nhau tơng tự sẽ đợc xếp vào một nhóm, giữa các nhóm lại có sự liên hệ với nhau Phân tích sơ đồ hình cây cho thấy 36 giống lúa đợc chia ra hai nhóm chính: - Nhóm I (a) chỉ có một giống KB1 có nguồn gốc Vi t Nam và nhiễm với bệnh bạc lá vi khuẩn (điểm bệnh 7,7), có. .. nhận thấy rằng tính đa hình của 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn khi phân tích với 21 mồi RAPD rõ ràng có sự sai khác ở mức độ phân tử Ngay ở Vi t Nam, Bùi Văn Thắng (2002), Phan Trọng Hoàng (2003) (Vi n Công nghệ Sinh học) đã sử dụng mồi các mồi RA để đánh giá đa dạng các giống lúa Tám nhằm lu giữ, bảo tồn các giống lúa đặc sản và góp phần tạo ra các giống lúa mới Tơng tự... Coefficient Hình 7 So sánh sự khác nhau của các giống ở mức độ phân tử 32 d c b a d c b a Hình 8: Biểu đồ đa chiều (MDS) của tập đoàn kháng/ nhiễm bệnh bạc lá vi khuẩn c d b c a Hình 9: Biểu đồ không gian PCA của tập đoàn lúa kháng/ nhiễm bệnh bạc lá vi khuẩn Kết luận và đề nghị 1 Bằng kỹ thuật RAPD đã nhận đợc tổng số 392 allen nhân bản Tất cả 21 mồi RAPD đều cho tính đa hình với giá trị PIC từ 0,25 (RA143,... trừ giống DV85 (điểm kháng bệnh 1) Hệ sai di truyền sai khác từ 18% đến 46% + Nhánh phụ 2 (c) gồm 17 giống và đợc chia làm 6 nhóm nhỏ : Nhóm 1: chỉ có giống TN1, có nguồn gốc Vi t Nam và nhiễm bệnh bạc lá vi khuẩn, hệ số sai khác so với các giống là 45% Nhóm 2 gồm hai giống Q5, Chiêm hơng Có nguồn gốc Trung Quốc, nhiễm bệnh bạc lá vi khuẩn (điểm bệnh từ 7,7 đến 9), hệ số sai khác so với các giống. .. OM3499-5 Các giống này chủ yếu có nguồn gốc ở Vi t Nam (là các giống có năng suất và chất lợng cao), kháng vừa với bệnh bạc lá vi khuẩn (điểm bệnh từ 3,0 đến 5,0) Tuy nhiên, trong đó có hai giống là N87, HT1 có nguồn gốc ở Trung Quốc, Đài Loan là nhiễm bệnh bạc lá vi khuẩn (điểm bệnh 7,7) và hình thành một nhánh phụ Hai giống này có hệ số di truyền khác với các giống khác là 29% (1- 0,71) Từ kết quả... phân tích với tập đoàn 36 giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh 33 bạc lá vi khuẩn Trong đó 3/21 (RA36, RA45, O18) mồi cho đa hình phong phú nhất với giá trị PIC 0,5 2 Sơ đồ hình cây thu đợc chia làm ba nhóm chính, có sự sai khác về hệ số tơng đồng di truyền từ 22% (Tám Tiêu và Tám Xuân Bắc) đến 64% (KB1 với 35 giống còn lại) Nhóm 1(b) gồm 9 giống, các giống này hầu hết đều có nguồn gốc Vi t Nam... đều có khả năng kháng bệnh (điểm bệnh từ 1 đến 5,5) Nhóm 2(c) gồm 19 giống có nguồn gốc ở nhiều nớc khác nhau Trong đó các giống nhiễm bệnh nằm cùng một nhóm Nhóm 3 (d) gồm 9 giống, chủ yếu có nguồn gốc Vi t Nam và là giống năng suất và chất lợng Chỉ có hai giống có nguồn gốc Trung Quốc và Đài Loan là nhiễm với bệnh và có hệ số di truyền sai khác với các giống là 29% Đề nghị: 1 Sử dụng giống lúa kháng. .. bạc lá vi khuẩn (điểm bệnh từ 7 đến 9), hệ số sai khác với các giống khác từ 24% đến 36% Nhóm 6 gồm 7 giống Khang dân, DÔ115, KBL53-99, KBL75-99, BBL72-99, BL31-97, BL28 Các giống có tính kháng đối với bệnh bạc lá vi khuẩn (điểm bệnh từ 1 đến 5), hệ số sai khác với giống khác là 39% + Nhánh phụ 3 (d) gồm 9 giống IRRI8, IRRI20, NTCD1-16, IRRI1545, N87, HT1, NTCD1-12, OM3242-50, OM3499-5 Các giống này . ‘ Đánh giá đa dạng tập đoàn giống lúa có tính kháng khác nhau với bệnh bạc lá vi khuẩn Xanthomonas oryzae bằng kỹ thuật RAPD với mục tiêu: đánh giá đa. nghiên cứu tính đa dạng ADN là 36 giống lúa có nguồn gốc, tính kháng khác nhau với kháng bệnh bạc lá vi khuẩn có nguồn gốc và tính kháng bệnh khác nhau do