Đang tải... (xem toàn văn)
Ung thư là bệnh rất nguy hiểm, mỗi năm có hơn 6 triệu người chết vì bệnh ung thư, 1.4 triệu ca ung thư mới được chẩn đoán trên thế giới. Theo đánh giá của Tổ chức y tế thế giới (WHO), trong 20 mươ
Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Thị Liên Trưởng Khoa Công Nghệ Sinh Học - Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang và TS Đỗ Thị Thảo Trưởng Phòng Thử Nghiệm Sinh Học – Viện Khoa Học Công Nghệ VIệt Nam Đó là những người thầy đã tận tâm hướng dẫn chỉ bảo cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thành bài khóa luận này Đồng thời tôi cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn tới sự giúp đỡ nhiệt tình, quý báu của các chị tại Phòng thử nghiệm sinh học – Viện CNSH đã dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi hoàn thành phần lớn nội dung bài khóa luận Nhân dịp này tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới toàn thể các thầy cô giáo Trường Đại Học Nông Lâm – Bắc Giang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu và bổ ích trong suốt 3 năm học vừa qua Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này Bắc Giang , ngày 23 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Triệu Đinh Tâm Khóa Luận Tốt Nghiệp i Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 DANH MỤC VIẾT TẮT AFP Alpha-fetoprotein ATCC America type culture collection BSA Bovine Serum Albumin CFA Complete Freund’s Adjuvant CEA CarcinoEmbryonic Antigen DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’ Medium ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay FBS Fetal Bovine Serium GTD Gestational Trophoblastic Disease HAT Hypoxanthine Aminopterin Thimidine HT Hypoxanthin Thimidine HCG Human Chorionic Gonadotropin IFA Incomplete Freund’s Adjuvant KTĐD Kháng thể đơn dòng LC-MS Liquid Chromatography – Mass Spectrophotometer OD Optical desnity PBS Phosphat buffer PSA Prostate Specific Antigen PEG Polythylen Glycol WHO Tổ chức y tế thế giới Khóa Luận Tốt Nghiệp ii Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC VIẾT TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THI .vii PHẦN : MỞ ĐẦU 1 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI .1 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2 3 Ý NGHĨA KHOA HỌC 2 4 Ý NGHĨA THỰC TIỄN 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 3 1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH UNG THƯ NÓI CHUNG VÀ ALPHA- FETOPROTEIN 3 1.1.1 TÌM HIỂU VỀ BỆNH UNG THƯ 3 1.1.1.1 Giai đoạn khởi đầu .5 1.1.1.2.Gai đoạn phát triển 6 1.1.1.3 Giai đoạn ung thư di căn 7 1.1.2.ALPHA – FETOPROTEIN (AFP) 7 1.1.2.1 Dấu ấn ung thư (tumor marker) và AFP 7 1.1.2.2 Bản chất và nguồn gốc của alpha-fetoprotein 9 1.1.2.2.1 Tình hình ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP để chẩn đoán sớm bệnh ung thư gan ở nước ngoài và trong nước 10 1.2 GIỚI THIỆU VỀ MIỄN DỊCH VÀ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 11 1.2.1 MIỄN DỊCH HỌC VÀ KHÁNG NGUYÊN 11 Khóa Luận Tốt Nghiệp iii Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 1.2.1.1 Các khái niệm về miễn dịch học 11 1.2.1.1.1 Đáp ứng miễn dịch tự nhiên (Natural immunity) 11 1.2.1.2 Hệ thống các cơ quan và tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch 14 1.2.1.2.1 các cơ quan dạng lympho 14 1.2.1.2.2 Tế bào miễn dịch 15 1.2.1.3 Giới thiệu về kháng nguyên (Antigen) .16 1.2.1.3.1 khái niệm kháng nguyên 16 1.2.1.3.2 Những đặc tính của kháng nguyên 16 1.2.1.3.3 Phân loại kháng nguyên dựa vào đặc tính và điều kiện kháng nguyên 17 1.2.1.3.4 Điều kiện để kháng nguyên có tính miễn dich 18 1.2.1.4 Kháng thể và phản ứng kháng nguyên – kháng thể 19 1.2.1.4.1 Khái niệm kháng thể (Antibody) 19 1.2.1.4.2 Cấu trúc của kháng thể 19 1.2.1.4.3 Vai trò của kháng thể .21 1.2.1.4.4.Quy lụât hình thành kháng thể dịch thể đặc hiệu 23 1.2.1.4.5 Phản ứng kháng nguyên – kháng thể .23 1.2.2 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 24 1.2.2.1 Vài nét lịch sử 24 1.2.2.2 khái niệm về kháng thể đơn dòng .25 1.2.2.3 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng 26 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28 2.1.1 Động vật thí nghiệm 28 2.1.2 Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma) của người 28 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 28 2.1.4 Hóa chất thí nghiệm 28 Khóa Luận Tốt Nghiệp iv Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 2.1.5 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.3.1.Gây miễn dịch cho chuột 32 2.3.2.Phương pháp lấy đại thực bào 32 2.3.3.Phương pháp đếm tế bào 33 2.3.3.1 Chuẩn bị Trypan blue 0,4% 33 2.3.3.2 Đếm tế bào 33 2.3.4 Phương pháp lấy tế bào LymphoB của tế bào chuột 33 2.3.5 Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp 2/0 và P3X 34 2.3.5.1 Đánh thức và nhân nuôi tế bào Sp 2/0 và P3X 34 2.3.5.2 Bảo quản tế bào trong Nito lỏng 34 2.3.6 Dung hợp Tế bào và tách dòng 35 2.3.6.1 Dung hợp 35 2.3.6.2 Tách dòng 35 2.3.7.Phương pháp ELISA 36 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYÊN AFP 37 3.2 KẾT QUẢ DUNG HỢP TẠO TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ KHÁNG AFP 39 3.3 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG AFP 43 3.4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 3.4.1 Kết Luận .51 3.4.2 Đề Nghị 51 Khóa Luận Tốt Nghiệp v Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết quả gây đáp ứng miễn dịch cho chuột với kháng nguyên AFP37 Bảng 3.2 Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP trên 2 dòng tế bào myeloma 42 Bảng 3.3 Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP .44 Bảng 3.4 Giá trị OD của dịch nổi các giếng có 1 dòng tế bào dương tính 47 Bảng 3.5 Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch nổi của các dòng tế bào 50 Khóa Luận Tốt Nghiệp vi Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ ĐỒ THI Hình 1.1 Sơ đồ giai đoạn khởi đầu 6 Hình 1.2 Các giai đoạn phát triển của ung thư .7 Hình 1.3 a Cấu trúc điển hình của một kháng thể 19 1.3 b Bề mặt của kháng thể IgG 19 Hình 1.4 Sơ đồ các chuỗi của một kháng thể .20 Hình 1.5 Các độc tố của vi khuẩn bên cạnh một tế bào cơ thể 21 Hình 1.6.Các độc tố trên bị trung hòa bởi kháng thể 22 Hình 1.7 Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác nhau .26 Hình 1.8 Kháng thể đơn dòng, liên kết với epitope đặc hiệu .26 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào Sp2/0 và P3X, độ phóng đại 10x20 40 Hình 3.2 Tế bào Lympho B và tế bào Sp2/0 dung hợp và phát triển trên nền tế bào feeder, độ phóng đại 10×20 41 Hình 3.3 Các cụm tế bào lai (clone) đang phát triển, độ phóng đại 10×20 và 10×10 .45 Biểu đồ 3.1 Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của các chuột thí nghiệm bằng phương pháp ELISA 38 Khóa Luận Tốt Nghiệp vii Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 PHẦN : MỞ ĐẦU 1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ung thư là bệnh rất nguy hiểm, mỗi năm có hơn 6 triệu người chết vì bệnh ung thư, 1.4 triệu ca ung thư mới được chẩn đoán trên thế giới Theo đánh giá của Tổ chức y tế thế giới (WHO), trong 20 mươi năm tới các con số trên sẽ gia tăng và lên đến 10 triệu trường hợp tử vong và trên 16 triệu ca ung thư mới Ở Việt Nam, bên cạnh các bệnh nhiễm khuẩn và suy dinh dưỡng ngày càng giảm dần, thì bệnh ung thư, bệnh tim mạch, tâm thần đang có nguy cơ gia tăng Các loại ung thư hay gặp ở nước ta là ung thư phổi, dạ dày, vú, gan, vòm họng, đại trực tràng, hạch bạch huyết, tử cung, buồng trứng… Trong khi ở nhiều nước, chương trình sàng lọc phát hiện sớm ung thư đạt kết quả tốt, đã góp phần chữa khỏi hơn 50% bệnh nhân ung thư thì ở nước ta đa số người bị ung thư khi được chẩn đoán đã ở giai đoạn muộn, tỉ lệ chữa khỏi bệnh còn rất thấp Các loại ung thư thường gặp tính chung cả 2 giới nam và nữ, ước tính hàng năm trên toàn cầu cho thấy khoảng 10,9 triệu ca ung thư mới mắc và khoảng 6,7 triệu người chết vì ung thư (2002) Tại VN, hàng năm có khoảng 100.000-150.000 trường hợp mới mắc ung thư và khoảng 70.000 người chết do ung thư Ở VN, qua nghiên cứu ở TPHCM và Hà Nội cho thấy 10 loại ung thư thường gặp ở nam và nữ là: ung thư gan, ung thư phổi ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng, ung thư cổ tử cung, ung thư vú, ung thư tiền liệt tuyến, ung thư bạch cầu, ung thư buồng trứng, ung thư tuyến giáp…[34] Giai đoạn mắc bệnh ung thư thì người bệnh thường không phát hiện được, đến khi người bệnh phát hiện được thì thường ở giai đoạn nặng và không thể cứu chữa được Đôi khi các bác sĩ còn chẩn đoán sai dẫn đến việc chữa và trị đi sai hướng dẫn tới bệnh nhân chịu hậu quả rất nặng Việc chẩn đoán chính xác và phát hiện sớm là điều rất quan trọng cho việc điều trị Có nhiều Khóa Luận Tốt Nghiệp 1 Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 phương pháp chẩn đoán nhưng mỗi phương pháp lại có hạn chế nhất định trong việc xác định chính xác loại ung thư để điều trị cho thích hợp Hiện nay, để chẩn đoán sớm được bệnh một cách nhanh chóng và chính xác, người ta sử dụng phương pháp chẩn đoán bằng kháng thể đơn dòng Phương pháp này có đặc điểm là rất đặc hiệu với kháng nguyên tức là nó chỉ nhận biêt duy nhất một loại kháng nguyên khi đưa vào cùng một lúc với các kháng nguyên khác Nên kết quả sẽ không bị nhầm lẫn mà ngược lại là độ chính xác lại rất cao Vì vậy, để góp phần vào công tác chẩn đoán kịp thời, nhanh chóng chính xác và đưa ra liệu pháp điều trị thích hợp do đó chúng tôi thực hiện đề tài “nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP hỗ trợ chẩn đoán sớm bệnh ung thư tế bào gan ở người” 2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tạo được dòng tế bào lai lai sinh kháng thể đơn dòng (mAb) kháng đặc hiệu alpha-fetoprotein (AFP) 3 Ý NGHĨA KHOA HỌC Tìm ra tính đặc hiệu của kháng thể ở nồng độ thích hợp trong việc sản xuất kháng thể đơn dòng để tạo bộ kít chẩn đoán bệnh 4 Ý NGHĨA THỰC TIỄN Có ý nghĩa lớn trong việc xác định và chẩn đoán sớm được bệnh ung thư để sớm đưa ra phương pháp điều trị thích hợp Khóa Luận Tốt Nghiệp 2 Triệu Đình Tâm lớp K9K1 Trường Đại Học Nông Lâm Bắc Giang Khoa Công Nghệ Sinh Học K9K1 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1 GIỚI THIỆU VỀ BỆNH UNG THƯ NÓI CHUNG VÀ ALPHA- FETOPROTEIN 1.1.1 TÌM HIỂU VỀ BỆNH UNG THƯ Ung thư là căn bệnh nguy hiểm và khó chữa trị, hơn nữa với số lượng người mắc bệnh ngày một tăng cao, ung thư thực sự là mối nguy hại lớn ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng, tới sự phát triển kinh tế và xã hội theo báo cáo nhiều nhất của bộ y tế thế giới WHO thì ung thư đang dần vượt qua tim mạch để trở thành căn bệnh gây tử vong cao nhất trên toàn thế giới Trong tổng số 58 triệu người chết trong năm 2005 thì số lượng người chết vì căn bệnh ung thư chiếm 7,6 triệu(tức là khoảng 13%) [3] Trong số tử vong này, chiếm hơn 70% là bệnh nhân thuộc về các nước đang phát triển và có mức thu nhập thấp.WHO cũng dự đoán khoảng 9 triệu người sẽ chết vì căn bệnh này trong năm 2005 và số lượng người mắc bệnh mới và chết sẽ tiếp tục tăng trong các năm tiếp theo [32] Việt nam là nước đang phát triển và cũng không phải là ngoại lệ Chúng ta đang phải đối mặt với căn bệnh nguy hiểm này Bệnh ung thư đang hoành hành khắp mọi miền đất nước bà ngày càng phổ biến, với ước tính mỗi năm có 150 ngàn ca mắc mới và 75 ngàn ca tử vong, gấp 7 lần số người chết do tai nạn giao thông Riêng với căn bệnh ung thư gan thì các số liệu thống kê cho thấy Việt Nam là nước có tỷ lệ người mắc ung thư gan đứng thứ 2 thế giới [1,6] Ung thư là tên dùng chung để gọi một nhóm bệnh gồm khoảng 200 loại khác nhau về nguồn gốc tế bào phát sinh, khả năng di căn, khả năng và cách thức chữa trị nhưng đều có chung một đặc điểm nổ bật là sự tăng sinh vô hạn Khóa Luận Tốt Nghiệp 3 Triệu Đình Tâm lớp K9K1 ... mắc ung thư khoảng 70.000 người chết ung thư Ở VN, qua nghiên cứu TPHCM Hà Nội cho thấy 10 loại ung thư thường gặp nam nữ là: ung thư gan, ung thư phổi ung thư dày, ung thư đại trực tràng, ung thư. .. tác chẩn đốn kịp thời, nhanh chóng xác đưa liệu pháp điều trị thích hợp chúng tơi thực đề tài ? ?nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dịng kháng AFP hỗ trợ chẩn đốn sớm bệnh ung thư tế. .. NGUYÊN AFP 37 3.2 KẾT QUẢ DUNG HỢP TẠO TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ KHÁNG AFP 39 3.3 KẾT QUẢ TÁCH DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG AFP 43 3.4 KẾT LUẬN VÀ
