BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TRÍCH LY THÀNH PHẦN FLAVONOID TỪ LÁ CỦ ĐẬU VÀ THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH TRÊN MƠ HÌNH IN VITRO Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : ThS.NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG Sinh viên thực hiện: HUỲNH KIM KHÁNH MSSV: 1211100258 Lớp: 12DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu đồ án trung thực chưa tác giả khác công bố nghiên, đồ án Tôi xin cam đoan giúp đỡ việc hoàn thành luận án cảm ơn thơng tin trích dẫn đồ ghi rõ nguồn gốc Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm số liệu đồ án TP.HCM, ngày tháng Sinh viên năm 2016 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, bên cạnh cố gắng nỗ lực thân, nhận động viên giúp đỡ lớn từ cá nhân tập thể Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giáo viên hướng dẫn ThS Nguyễn Thị Thu Hương, giảng viên Khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, người tận tình giúp đỡ, hướng dẫn, tạo điều kiện tốt cho tơi thực hồn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Phịng thí nghiệm Trường Đại học Cơng nghệ TP HCM tạo điều kiện sở vật chất tốt cho tơi thực hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ bạn nhóm sinh viên làm nghiên cứu khoa học nhiệt tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè động viên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực đề tài hoàn thành luận văn TP.HCM, ngày tháng năm 2016 Sinh viên thực Huỳnh Kim Khánh ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC SƠ ĐỒ DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 Tổng quan củ đậu 14 1.1.1 Nguồn gốc phân loại .14 1.1.2 Đặc điểm sinh thái 15 1.1.3 Tình hình trồng trọt, tiêu thụ kỹ thuật canh tác củ đậu Việt Nam… 16 1.1.4 Thành phần hóa học 21 1.1.5 Tính vị công dụng 21 1.2 Hợp chất Phenol, Flavonoid Rotenone .22 1.2.1 Phenol 22 1.2.2 Flavonoid 25 1.2.3 Rotenone .30 1.3 Các phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp thực vật .33 1.3.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng 33 1.3.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng .35 1.4 Phương pháp đánh giá độc tính xác định giá trị LC50 41 1.5 Phương pháp xác định khả đối kháng với vi sinh vật gây bệnh 45 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 1.6 Sinh vật thí nghiệm 47 1.6.1 Động vật giáp xác - Artemia Nauplii 47 1.6.2 Các chủng vi sinh vật thí nghiệm 49 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 56 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 56 2.2 Vật liệu nghiên cứu 56 2.3 Dụng cụ hóa chất thí nghiệm .56 2.3.1 Dụng cụ 56 2.3.2 Hóa chất .57 2.4 Phương pháp 57 2.5 Nội dung thí nghiệm 58 2.5.1 Phương pháp tách chiết thu cao chiết 59 2.5.2 Phương pháp định tính số hợp chất thứ cấp củ đậu…… 62 2.5.3 Phương pháp định lượng số hợp chất thứ cấp củ đậu 63 2.5.4 Phương pháp đánh giá độc tính 66 2.5.5 Phương pháp đánh giá khả kháng khuẩn 68 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 73 3.1 Thu nhận cao chiết từ củ đậu phương pháp dung môi khác 73 3.2 Định tính số hợp chất thứ cấp củ đậu 74 3.2.1 Định tính flavonoid 74 3.2.2 Định tính rotenone .75 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.3 Định lượng số hợp chất thứ cấp chất khô loại cao chiết .76 3.3.1 Hàm lượng chất khô 76 3.3.2 Định lượng polyphenol tổng số 76 3.3.3 Định lượng Flavonoid tổng số 80 3.4 Khảo sát độc tính .84 3.5 Thử hoạt tính kháng khuẩn loại cao chiết 86 3.5.1 Hoạt tính kháng Enterotoxigenic E.Coli loại cao chiết .86 3.5.2 Hoạt tính kháng Listeria monocytogenes loại cao chiết 88 3.5.3 Hoạt tính kháng Pseudomonas aeruginosa loại cao chiết 89 3.5.4 Khơng có hoạt tính kháng số vi sinh vật loại cao chiết.90 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO 95 PHỤ LỤC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AG: Acid Gallic BVTV: Bảo vệ thực vật db: vật liệu ĐC: Đối chứng DMSO: Dimethyl sulfoxide LC50: Lethal concentration NA: Nutrient Agar NB: Nutrient Broth NĐ: Nồng độ OD: Optical density HTHC: Hợp chất thứ cấp ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Hiệu tác động Nicotin Sulphat (trong dung dịch 1% saponin) ruồi giấm .42 Bảng Phân tích nguồn biến lượng 43 Bảng Bố trí thí nghiệm thử độc tính Artemia Nauplii .67 Bảng Kết định tính số hợp chất thứ cấp cao chiết củ đậu 75 Bảng Kết hàm lượng chất khô loại cao chiết 76 Bảng 3 Kết đường chuẩn Acid Gallic 77 Bảng Kết hàm lượng polyphenol tổng loại cao chiết củ đậu 78 Bảng Bảng kết đường chuẩn Rutin 81 Bảng Bảng kết hàm lượng flavonoid tổng số loại cao chiết 82 Bảng Kết đường chuẩn LC50 tương ứng loại cao chiết 84 Bảng Nồng độ LC50 (mg/L) loại cao chiết 86 Bảng Kết kháng Enterotoxigenic E.Coli loại cao chiết 87 Bảng 10 Kết kháng Listeria monocytogenes loại cao chiết .88 Bảng 11 Kết kháng Pseudomonas aeruginosa loại cao chiết 89 Bảng 12 Kết kháng số loại vi sinh vật loại cao chiết 91 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ Nội dung thí nghiệm .58 Sơ đồ 2 Quá trình tách chiết thu cao chiết từ củ đậu 59 Sơ đồ Quy trình định lượng polyphenol tổng 65 Sơ đồ Quy trình đánh giả khả kháng khuẩn cao chiết củ đậu .69 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cây củ đậu .14 Hình Thương lái thu mua củ đậu đồng ruộng 17 Hình Cây củ đậu trồng theo luống 19 Hình Củ đậu đến thời gian thu hoạch .20 Hình Tephrosin 21 Hình Rotenone 21 Hình Củ đậu tốt cho sức khỏe 22 Hình Một số ăn chế biến từ củ đậu 22 Hình Một số hợp chất phenol 24 Hình 10 Một số Eucoflavonoid 25 Hình 11 Cơng thức cấu tạo cấu trúc 3D rotenone 31 Hình 12 Chuỗi truyền điện tử chế tác động rotenone ty thể 32 Hình 13 Rotenone ngăn cản truyền điện tử đến CoQ .32 Hình 14 Chiết lớp chất lỏng .34 Hình 15 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt .35 Hình 16 Bộ chiết Soxhlet 37 Hình 17 Máy chiết Kumagawa 38 Hình 18 Bộ lơi nước .38 Hình 19 Sơ đồ hệ thống chiết siêu tới hạn 39 Hình 20 Cột chiết pha rắn 40 Hình 21 Ấu trùng trứng Artemia Nauplii .48 Hình 22 Vi khuẩn Salmonella .50 Hình 23 Vi khuẩn Staphylococcus aureus 51 Hình 24 Listeria monocytogenes 52 Hình 25 Vi khuẩn Escherichia coli 53 Hình 26 Pseudomonas aeruginosa .54 Hình Lá củ đậu 56 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Khảo sát độc tính  Cao chiết A Nồng độ cao chiết % Đối chứng Mẫu TN Mẫu TN Mẫu TN Số chết % chết Log10[NĐ%] Probit 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 30 18 22 15 11.67 38.9 - 3.52 4.7181 28 18 11 15.33 51.1 - 3.4 5.0276 28 12 11 11 16.67 55.57 - 3.3 5.1408 29 14 10 11 17.33 57.77 - 3.22 5.1968 30 19 11 18 60 - 3.15 5.2533 30 13 13 20 66.67 - 3.1 5.4316 29 10 20.67 68.9 - 3.05 5.4930 Đường chuẩn Giá trị Probit y = 1.5045x + 10.068 R² = 0.9573 -3.6 -3.5 -3.4 -3.3 -3.2 log10(NĐ) Số chết = Đối chứng – (Mẫu TN + Mẫu TN + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5.0000 Log10(X) = (5 – 10.068)/1,5045 => X = -3,37  LC50 = 0,04% -3.1 5.6 5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 4.9 4.8 4.7 4.6 -3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết B Nồng độ cao chiết % Đối chứng Mẫu TN Mẫu TN Mẫu TN Số chết %chết Log10[NĐ] Probit 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 29 18 19 18 10.67 35.57 -3.3 4.6308 29 15 14 16.67 55.57 -3 5.1408 30 11 14 18.67 62.23 -2.82 5.3107 27 11 18.33 61.1 -2.7 5.2819 29 24 80 -2.6 5.8416 28 22.67 75.57 -2.52 5.6935 30 3 26.33 87.77 -2.46 6.1650 Đường chuẩn y = 1.6067x + 9.8907 R² = 0.8879 Giá trị Probit -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 log10(NĐ) Số chết = Đối chứng – (Mẫu TN + Mẫu TN + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 9,8907)/1,6067 = -3,04  LC50 = 0,09% -0.5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết C Nồng độ cao chiết % Đối chứng Mẫu TN Mẫu TN Mẫu TN Số chết %chết Log10[NĐ] Probit 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 29 14 15 18.33 61.1 -3.52 5.2819 30 16 11 19 63.33 -3.4 5.3398 28 10 19.67 65.57 -3.3 5.4016 30 10 11 20.67 68.9 -3.22 5.493 30 10 21.33 71.1 -3.15 5.5563 29 7 22.67 75.57 -3.1 5.6935 29 23.33 77.77 -3.05 5.7655 Đường chuẩn 5.8 y = 1.0237x + 8.8299 R² = 0.9255 5.7 Giá trị pronit 5.6 5.5 5.4 5.3 5.2 5.1 -3.6 -3.5 -3.4 -3.3 -3.2 Log10(NĐ) Số chết = Đối chứng – (Mẫu TN + Mẫu TN + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 8,8299)/1,0237 = - 3,74  LC50 = 0,02% -3.1 -3 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Cao chiết D Nồng độ cao chiết % Đối chứng Mẫu TN Mẫu TN Mẫu TN Số chết %chết Log10[NĐ] Probit 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 28 19 12 14 13 43.33 -3.3 4.8313 29 13 19.67 65.57 -3 5.4016 28 22.67 75.57 -2.82 5.6935 27 25 83.33 -2.7 5.9661 29 25.67 85.57 -2.6 6.0626 29 26.67 88.9 -2.52 6.2212 30 2 28.33 94.43 -2.46 6.5893 Đường chuẩn y = 1.9234x + 11.154 R² = 0.9772 Giá trị Probit -3.5 -3 -2.5 -2 -1.5 -1 log10(NĐ) Số chết = Đối chứng – (Mẫu TN + Mẫu TN + Mẫu TN 3)/3 % chết = (Số chết.100)/30 => Giá trị Probit Tra bảng Probit tỉ lệ chết 50% = 5,0000 Log10(X) = (5 – 11,154)/1.9234 = -3,2  LC50 = 0,06% -0.5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP  Bảng giá trị Probit ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 10 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 11 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 12 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Kháng khuẩn 3.1 Môi trường  NB - 1,5g cao thịt - 1,5 g cao nấm men - g pepton - g NaCl - 1000 ml nước cất - pH 7,4 ± 0,2  NA - 1,5 g cao thịt - 1,5 g cao nấm men - g pepton - g NaCl - 15 g agar - 1000 ml nước cất - pH 7,4 ± 0,2 13 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.2 Enterotoxigenic E.Coli Đường kính vịng kháng khuẩn L1 (mm) L2 (mm) L3 (mm) Độ lệch chuẩn A B 10 10 11 0.58 The SAS System C 13 15 17 11 12 1.53 D E 13 12 12 0.58 01:00 Friday, August 18, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels KKETEC Values ABCDE Number of Observations Read Number of Observations Used The SAS System 15 15 01:00 Friday, August 18, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Sum of Squares Source DF Model 77.73333333 19.43333333 10 14.00000000 1.40000000 Error Corrected Total Source KKETEC 14 Mean Square F Value 0.0004 91.73333333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.847384 9.195979 1.183216 DF 13.88 Pr > F Anova SS Y Mean 12.86667 Mean Square 77.73333333 The SAS System F Value Pr > F 19.43333333 13.88 0.0004 01:00 Friday, August 18, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 14 16 16 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 1.4 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 2.1526 Means with the same letter are not significantly different t Grouping 3.3 Mean N KKETEC A A A 16.0000 E 15.0000 B B B B B B 12.3333 D 10.6667 C 10.3333 A Listeria monocytogenes Đường kính vịng kháng khuẩn L1 (mm) L2 (mm) L3 (mm) Độ lệch chuẩn The SAS System A B 13 10 11 1.53 12 12 11 0.58 C D 13 13 13.5 0.29 01:07 Friday, August 18, 2016 15 13 12 11 E 14.5 14.5 14.5 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels KKLIS Values ABCDE Number of Observations Read Number of Observations Used The SAS System 15 15 01:07 Friday, August 18, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Model Error KKLIS Mean Square F Value 20.23333333 10 5.05833333 7.50000000 Corrected Total Source Sum of Squares 14 0.0067 0.75000000 27.73333333 R-Square Coeff Var Root MSE 0.729567 6.909777 0.866025 DF 6.74 Pr > F Anova SS Y Mean 12.53333 Mean Square 20.23333333 The SAS System F Value Pr > F 5.05833333 6.74 0.0067 01:07 Friday, August 18, 2016 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for Y NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.75 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 1.5755 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N KKLIS 16 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP A A B A B B C B C B C C C 14.5000 E 13.1667 C 12.0000 D 11.6667 B 11.3333 A 17 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP 3.4 Pseudomonas aeruginosa Đường kính vịng kháng khuẩn L1 (mm) L2 (mm) L3 (mm) Độ lệch chuẩn A B C 11 11 12 0.58 The SAS System 11 10.5 13 1.32 D 9 0.58 E 10 10 11 0.58 15 15 15 01:07 Friday, August 18, 2016 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels KKPSEU Values ABCDE Number of Observations Read Number of Observations Used The SAS System 15 15 01:07 Friday, August 18, 2016 The ANOVA Procedure Dependent Variable: Y Source DF Model Error 10 Corrected Total Source KKPSEU Sum of Squares Mean Square F Value 64.73333333 16.18333333 5.50000000 0.55000000 14 F Anova SS Y Mean 11.36667 Mean Square 64.73333333 The SAS System F Value Pr > F 16.18333333 29.42