ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ======= NGUYỄN THỊ NHUNG XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI MỘT SỐ ĐỘC TỐ GÂY LIỆT CƠ TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS/MS Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Bản khóa luận thực hoàn thành Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc Gia với hướng dẫn PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thị Hồng Hảo định hướng nghiên cứu, hướng dẫn góp ý giúp em hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn tới ThS Nguyễn Thị Hà Bình hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, TS Trần Cao Sơn cán khoa Độc học dị nguyên, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện giúp hồn thành đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cô giáo giảng dạy khoa Hố, đặc biệt thầy mơn Hố Phân tích, cho tơi kiến thức q giá trình học tập thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn anh chị, bạn bè tập thể lớp cao học hố K24, đặc biệt người bạn nhóm hố phân tích K24 giúp đỡ, chia sẻ khó khăn suốt q trình tơi học tập thực đề tài Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè ln bên tơi, chia sẻ khó khăn, động viên giúp đỡ học tập sống Do thời gian thực đề tài có hạn nên khơng tránh thiếu sót Tơi mong nhận ý kiến đóng góp thầy bạn sinh viên Hà Nội, ngày 07 tháng 11 năm 2016 Nguyễn Thị Nhung Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu độc tố nhuyễn thể gây liệt 1.1.1 Giới thiệu STX 1.1.2 Giới thiệu NEO 1.1.3 Giới thiệu GTX-1 1.1.4 Giới hạn tối đa cho phép (ML) .6 1.1.5 Những tác hại độc tố nhuyễn thể gây liệt 1.2 Các phương pháp xác định độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ 1.2.1 Các phương pháp thử sinh học 1.2.2 Phương pháp xét nghiệm miễn dịch ELISA 10 1.2.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) .10 1.2.4 Kỹ thuật điện di .12 1.2.5 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS), (LC-MS/MS) 13 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng nội dung nghiên cứu 16 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu .16 2.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 16 2.2.2 Phương phápsắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) 17 2.2.3 Thẩm định phương pháp 23 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26 2.3 Phương tiện nghiên cứu 26 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 26 2.3.2 Dung mơi, hóa chất 27 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy thiết bị LC-MS/MS 29 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện chạy thiết bị khối phổ MS/MS 29 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 33 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu .35 3.2.1 Chọn qui trình xử lí mẫu .35 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu 40 3.2.3 Khảo sát trình pha loãng dịch chiết .42 3.2.4 Khảo sát thể tích dung mơi chiết 43 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích 46 3.3.1 Tính đặc hiệu / chọn lọc 46 3.3.2 Giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) .49 3.3.3 Xác định khoảng tuyến tính 50 3.3.4 Độ xác (accuracy) phương pháp phân tích (độ độ chụm) 52 3.4 Áp dụng phân tích mẫu thực tế 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH SÁCH BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học độc tính vài độc tố PSP Bảng 1.2: Một số nước đưa qui định giới hạn tối đa cho phép (ML) PSP Bảng 1.3: Một số nghiên cứu sử dụng phương pháp HPLC-FLD để xác định PSP 11 Bảng 2.1: Bảng pha dung dịch chuẩn làm việc 28 Bảng 3.1: Ion mẹ chất 29 Bảng 3.2: Điều kiện tối ưu cho ESI-MS/MS 30 Bảng 3.3: Các thông số tối ưu MS/MS 32 Bảng 3.4: Chương trình gradient 34 Bảng 3.5: Lựa chọn quy trình chiết mẫu 39 Bảng 3.6: Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên trình chiết mẫu 40 Bảng 3.7: Khảo sát q trình pha lỗng dịch chiết 42 Bảng 3.8: Khảo sát thể tích dung mơi chiết 43 Bảng 3.9: Ion mẹ ion STX, GTX-1, NEO 46 Bảng 3.10: LOD LOQ STX, GTX-1, NEO 50 Bảng 3.11: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PSP 51 Bảng 3.12: Độ lặp lại độ thu hồi STX, GTX-1, NEO mẫu Ngao 53 Bảng 3.13: Độ lặp lại độ thu hồi STX, GTX-1, NEO mẫu Hàu 53 Bảng 3.14: Kết phân tích mẫu thực tế địa bàn Hà Nội 54 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH SÁCH H NH Hình 1.1: Cơng thức cấu tạo tổng quát độc tố PSP Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo STX Hình 1.3: Cơng thức cấu tạo Neo Hình 1.4: Cơng thức cấu tạo GTX-1 Hình 2.1: Sơ đồ đơn giản hệ thống sắc ký lỏng 18 Hình 2.2: Bộ kết nối phun điện tử 20 Hình 2.3: Bộ phân tích tứ cực 22 Hình 2.4: Bộ phân tích khối ba tứ cực 22 Hình 3.1: Sắc kí đồ mix PSP chuẩn 100 ng/mL chạy chương trình gradient 35 Hình 3.2: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 1Tiến hành xử lý mẫu theo quy trình theo tác giả Van De Riet 36 Hình 3.3: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 37 Hình 3.4: Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 38 Hình 3.5:Sắc kí đồ PSP 100 ng/mL quy trình 39 Hình 3.6: Sắc kí đồ quy trình khơng gia nhiệt thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL 41 Hình 3.7: Sắc kí đồ quy trình gia nhiệt thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL 41 Hình 3.8: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng q trình pha lỗng đến hiệu suất thu hồi 42 Hình 3.9: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng thể tích chiết đến hiệu suất thu hồi 44 Hình 3.10: Quy trình xử lí mẫu tối ưu 45 Hình 3.11: Phổ khối PSP 47 Hình 3.12: Sắc đồ mẫu trắng khơng có tín hiệu chất phân tích 47 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Hình 3.13: Sắc đồ mẫu chuẩn mức 200 ng/mL 48 Hình 3.14: Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn mức 200 ng/mL 48 Hình 3.15: Sắc kí đồ STX LOD 10 ng/mL (tương đương 100 µg/kg mẫu) 49 Hình 3.16: Sắc kí đồ NEO LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg mẫu) 49 Hình 3.17: Sắc kí đồ GTX-1 LOD 15 ng/mL (tương đương 150 µg/kg mẫu) 50 Hình 3.18: Đường chuẩn STX theo diện tích pic 51 Hình 3.19: Đường chuẩn GTX-1 theo diện tích pic 52 Hình 3.20: Đường chuẩn NEO theo diện tích pic 52 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu CAN AOAC Tiếng Anh Acetonitrile Association of Official Analytical Communities Tiếng Việt Acetonitril Hiệp hội nhà phân tích Độc tố nhuyễn thể gây trí ASP Amnesic Shellfish Poisoning CAD Collision Gas Pressure Áp suất khí va chạm CE Collision Energy Năng lượng va chạm CUR Curtain Gas Khí màng CXP Collision Cell Exit Potential Thế đầu DP Declustering Potential Thế phân mảnh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning Độc tố nhuyễn thể gây tiêu chảy d-SPE Dispersive solid phase extraction nhớ Chiết phân tán pha rắn Eq Equivalents Tương đương ESI Electronspray ionization Ion hóa phun điện tử FLD Fluoroscence detector Detector huỳnh quang GCB Graphitized carbon black Than hoạt tính GS1 Ion Source Gas Khí nguồn ion GS2 Ion Source Gas Khí nguồn ion GTX-1 Gonyautoxins-1 Độc tố gonyautoxins-1 HPLC High performance liquid chromatography Nguyễn Thị Nhung Sắc ký lỏng hiệu cao Trường ĐHKH Tự Nhiên HILIC IS LC-MS/MS Hydrophilic interaction liquid chromatography Ionspray Voltage Liquid chromatography tandem mass spectrometry Sắc kí lỏng tương tác thân nước Thế phun ion Sắc ký lỏng ghép khối phổ lần LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MBA Mouse bioassay Thử nghiệm sinh học chuột ML Maximum level Giới hạn tối đa cho phép MS Mass spectrometry Khối phổ NEO Neosaxitoxin Độc tố neosaxitoxin PSP Paralytic Shellfish poisoning Độc tố nhuyễn thể gây liệt R(%) Recovery Hiệu suất thu hồi RSD(%) Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn STX Saxitoxin Độc tố saxitoxin TEM Ion source temperature Nhiệt độ nguồn Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần việc ni trồng thủy sản nói chung việc ni lồi hai mảnh vỏ nói riêng phát triển rầm rộ nhiều địa phương ven biển nước ta Điều góp phần vào việc phát triển ngành kinh tế biển, phục vụ cho nhu cầu thị trường tiêu thụ nước, tăng thêm thu nhập, cải thiện đời sống cho nhiều hộ dân cư ven biển Đơ thị hóa, nhiễm môi trường làm môi trường biển ngày bị suy thoái tạo điều kiện cho xuất bùng nổ loài vi tảo biển độc hại Các loài thân mềm hai mảnh vỏ đối tượng trung gian để gây tượng ngộ độc người sinh vật bậc cao chim biển, thú biển Đặc biệt có mặt nhóm độc tố độc tố gây liệt PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Chính vậy, nghien cứu phát độc tố cần quan tâm để giảm nguy ảnh hưởng đến sức khỏe tính mạng người Trong đề tài tập trung nghiên cứu nhóm độc tố nhuyễn thể gây liệt PSP (Paralytic Shellfish Poisoning) Độc tố gây nguy hiểm đến sức khoẻ tính mạng người động vật nhyễn thể bị nhiễm tích lũy độc tố PSP ăn phải tảo độc nhóm Dinoflagellates bao gồm lồi Dinophysis spp, Aurocentum, prorocentrumlima.Việc xác định số độc tố nhuyễn thể gây liêt cần thiết, công cụ tốt phục vụ cho công tác tra, kiểm tra an tồn thực phẩm Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu phát triển phương pháp “Xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS” Phương pháp đại, có độ tin cậy xác cao Mục tiêu thực đề tài luận văn là: - Xây dựng phương pháp xác định đồng thời số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC - MS/MS - Sơ đánh giá số độc tố gây liệt nhuyễn thể hai mảnh vỏ tiêu thụ Hà Nội Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Sắc kí đồ khảo sát chọn quy trình xử lý mẫu NEO GTX-1 STX Hình 3.12:Sắc kí đồ PSP 100 ng/mL quy trình Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Sắc kí đồ khảo sát thể tích dung môi chiết xử lý mẫu STX NEO GTX-1 Sắc kí đồ quy trình Chiết lần mL thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên STX NEO GTX-1 Sắc kí đồ quy trình Chiết lần mL thêm chuẩn mix PSP 100 ng/mL Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Sắc kí đồ khảo sát độ pha lỗng xử lý mẫu STX NEO GTX-1 Sắc kí đồ quy trình Pha lỗng lần thêm chuẩn dịch cuối mix PSP 200 ng/mL Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên STX NEO GTX-1 Sắc kí đồ quy trình Pha loãng 10 lần thêm chuẩn dịch cuối mix PSP 100 ng/mL Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên STX NEO GTX-1 Sắc kí đồ quy trình Pha loãng 20 lần thêm chuẩn dịch cuối mix PSP 50 ng/mL Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Sắc đồ thêm chuẩn nồng độ khác thẩm định độ lặp lại Spike STX 100 ng/mL Spike STX 200 ng/mL Spike STX 300 ng/mL Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Spike GTX 200 ng/mL Spike GTX 300 ng/mL Spike NeO 100 ng/mL Spike NeO 200 ng/mL Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Spike NeO 300 ng/mL Spike STX 100ng/mL mẫu Hàu Spike STX 200ng/mL mẫu Hàu Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Spike STX 300ng/mL mẫu Hàu Spike GTX 100ng/mL mẫu Hàu Spike GTX 300ng/mL mẫu Hàu Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Spike NEO 300ng/mL mẫu Hàu Sắc đồ dung môi, mẫu trắng Dung môi Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Mẫu trắng Mẫu thực tế Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Mẫu Ngao chợ Cầu Giấy-Hà Nội Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên Mẫu Ngao Chợ Nghĩa Tân-Hà Nội Mẫu Ngao Đống Đa-Hà Nội STX GTX-1 Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên NEO Sắc kí đồ mẫu 16 spike mix PSP 500µg/kg Nguyễn Thị Nhung Trường ĐHKH Tự Nhiên