MỤC LỤC Tổng quan vi sinh vật sản xuất chất tạo màu 2 Nguồn màu từ nấm men 2.1 Tổng quan nấm men sản xuất chất tạo màu .6 2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo màu nấm men 2.3 Cơ chế sinh tổng hợp sắc tố carotenoid vi sinh vật 10 2.4 Phương pháp trích chiết màu từ tế bào nấm men 14 2.4.1 Phương pháp hóa học 14 2.4.2 Phương pháp vật lý: 15 Nguồn màu từ tảo 15 3.1 Dunaliella 16 3.2 Spirulina 18 3.3 Chlorella 19 3.4 Porphyridium 21 3.5 Vi tảo Scenedesmus 22 3.6 Haematococcus 22 Nguồn màu từ vi khuẩn 23 Nguồn màu từ nấm mốc 27 5.1 β-carotene 27 5.2 Màu vàng Riboflavin (vitamin B2) 28 5.3 Phẩm màu Monascus 29 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm men Rhodotorula sp Hình 1.2 Khuẩn lạc Rh mucilaginosa .3 Hình 1.3 Tảo đỏ Hình 1.4 Tảo spirulina Nhật Bản .4 Hình 1.5 Eremothrcium ashbyii Hình 1.6 Flavobacterium akiainvivens Hình 1.7 Brevibacterium .5 Hình 2.1 Nấm men Rhodotorula sp Hình 2.2 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis .6 Hình 2.3.Con đường sinh tổng hợp carotenoid .11 Hình 2.4 Các phản ứng dehydro hóa trình sinh tổng hợp carotenoid .12 Hình 2.5 Tổng hợp carotenoid có vịng từ lycopene 13 Hình 2.6 Một số nghiên cứu sinh tổng hợp carotenoid từ nấm men Rhodototula .13 Hình 3.1 Tảo D.salina Hồ Nước Mặn Lớn (Great Salt Lake) quan sát kính hiển vi 17 Hình 3.2 Tảo Spirulina 18 Hình 3.3 Tảo Chlorella kính hiển vi 19 Hình 3.4 Porphyridium kính hiển vi 21 Hình 3.5 Vi tảo Scenedesmus 22 Hình 3.6 Haematococcus pluvialis 23 Hình 4.1 Janthinobacterium lividum .25 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Nguồn C để sản xuất -carotene Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula lactose Bảng 3.1 Thành phần hóa học Chlorella 20 Bảng 4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon khác lên sinh trưởng tạo màu Gordonia jacobaea 24 Tổng quan vi sinh vật sản xuất chất tạo màu Các nguồn màu từ vi sinh vật đa dạng phong phú, lấy từ nguồn vi khuẩn, nầm men, nấm mốc hay số loại tảo Trong nhóm màu chủ yếu vi sinh vật đến phát chủ yếu nhóm carotenoid Carotenoid nhóm chất màu hịa tan chất béo có lục lạp, rau có màu da cam, màu vàng màu đỏ Carotenoid có nội bào số lồi vi sinh vật vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, tảo Nấm men Rhodotorula gọi nấm men sinh sắc tố carotenoid, giống nấm men có khả tổng hợp tích lũy lượng lớn sắc tố carotenoid chủ yếu β–carotene, torulene, torulahodin… Nấm men Rhodotorula nhóm sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20 OC– 40OC Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi đất, khơng khí, vỏ táo, dưa hấu, dâu tây Hình 1.1 Nấm men Rhodotorula sp Hình 1.2 Khuẩn lạc Rh mucilaginosa Tảo nhóm lớn đa dạng, bao gồm sinh vật thông thường tự dưỡng, gồm hay nhiều tế bào có cấu tạo đơn giản, có màu khác nhau, ln ln có chất diệp lục chưa có rễ, thân, Hầu hết tảo sống nước Đây sinh vật mà vách thân chứa xenluloza, sinh vật tự dưỡng chứa diệp lục, quang hợp nhờ ánh sáng CO2 Tảo đỏ sinh vật quang tự dưỡng thuộc ngành Rhodophyta Phần lớn loài rong thuộc nhóm Các thành viên ngành có đặc điểm chung màu đỏ tươi tía Màu sắc chúng hạt sắc tố phycobilin tạo thành Phycobilin sắc tố đặc trưng cho tảo đỏ vi khuẩn lam Người ta cho lục lạp tảo đỏ có nguồn gốc từ vi khuẩn lam cộng sinh với tảo mà thành Lạp lục tế bào tảo đỏ có phycobilin, chlorophyl a, carotene xanthophyll Hình 1.3 Tảo đỏ Tảo xoắn spirulina chứa sắc tố cryptoxanthine β -caroten màu vàng/cam mà từ vitamin A tạo Sắc tố hữu hình tảo xoắn spirulina diệp lục, phân tử màu xanh phổ biến thực vật, sắc tố làm cho tảo xoắn spirulina có màu xanh đặc trưng phycocyanin Hình 1.4 Tảo spirulina Nhật Bản Có thể thu nhận nguồn màu từ nấm mốc Neuspora crassa, Penicillium sclerotiorum,… Hiện giới nấm Neuspora crassa,… nuôi để thu nhận nguồn β – carotene Màu vàng Riboflavin tổng hợp từ nấm mốc Eremothrcium ashbyii Hình 1.5 Eremothrcium ashbyii Một vài loài vi khuẩn tạo màu carotenoid giống Brevibacterium (tạo canthaxanthin), Flavobacterium (tạo zeaxanthin) Người ta thu nhận carotenoid từ Gordonia jacobaea nguồn cacbon khác Hình 1.6 Flavobacterium akiainvivens Hình 1.7 Brevibacterium Nguồn màu từ nấm men 2.1 Tổng quan nấm men sản xuất chất tạo màu Các nấm men tạo màu carotenoid nấm men Rhodotorula, Cryptococus Sporobomyces,… Riboflavin tổng hợp từ nấm men Saccharomyces cerevisiae (nâm men bánh mì), nấm men bia Hình 2.1 Nấm men Rhodotorula sp Có số nấm men lúc bình thường khơng tạo màu nuối cấy môi trường đặc biệt tạo màu Shizosaccharomyces pombe, Sacchromycodes ludwigii, Saccharomyces carlbergensis Saccharomyces cerevisiae nuôi cấy môi trường chứa 100 -150 DL-methionine D-biotin Tuy vậy, màu tạo khơng thuộc nhóm carotenoid Hiệu suất tạo màu chủng nấm men dại thường không cao so với chủng đột biến, chủng đột biến Rhodotorula glutinis NCIM 3353 sinh lượng -carotene nhiều gấp 76 lần so với chủng ban đầu Hình 2.2 Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis 2.2 Yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo màu nấm men Môi trường nuôi cấy phải giúp vi sinh vật tạo lượng sinh khối lớn, lượng màu carotenoid cao, dễ trích chiết Mơi trường phải gồm nguồn C, N, muối khống số trường hợp cần thêm số chất kích thích để tạo màu a Nguồn C - Glycerol thích hợp cho lồi Rhodotorula rubra tạo -carotene, torulahodin Glucose, maltose, saccharose raffinose thích hợp cho lồi Sporobolomyces roseu Môi trường nuôi cấy cần bổ sung 0.2% succinate natri Saccharose dùng để tạo lượng lớn torulene cho loài Rhodotorula rubra - Phenol, resorcinol acid kojic với nồng độ thích hợp kích thích tạo -carotene với Rhodotorula sp No100 Lồi Rhodotorula fragaria cịn sử dụng 1-propanol hay 1-butanol làm nguồn cung cấp cacbon - Hydrocacbon dầu mỏ dùng cho số loài nấm men phân lập từ đất chứa dầu Rhodotorula glutinis, Rhodotorula fragaria Mơi trường khống parafin lỏng sử dụng cho chủng Rhodotorula mucilaginosa Khi có bổ sung vitamin - Rhodotorula glutinis cho hiệu suất sinh khối tế bào cao lượng carotenoid đạt 360/100g skk lượng đường thay dịch chiết nước cà rốt 10-20% Tương tự Rhodotorula gracilis Lượng sinh khối hàm lượng carotenoid phụ thuộc nhiều vào nguồn cacbon theo bảng sau Bảng 2.1 Nguồn C để sản xuất -carotene Rhodotorula rubra, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula lactosa Nguồn cacbon Saccharose Nồng độ (g/L) Sinh khối (g/Ldlm) -carotene (mg/g skk) 20,0 10,0-12,0 1,7 Xylose 22,5 10,0 1,0 Glycerol 21,5 11,0 2,7 Acetate 28,0 9,5 2,4 b Nguồn Nitơ Nấm men sử dụng nguồn nitơ vô hữu Hiệu suất tạo loại carotenoid thay đổi tùy vào nguồn nitơ Ví dụ histidin tạo lượng lớn torularhodin, asparagine tạo -carotene, NH4NO3 tạo -carotene Tỷ lệ sử dụng C:N tạo màu 50:1 Glycine, valine, proline, asparagine, acid glutamic, arginin với glucose giúp cho loài Sporobolomyces roseus sinh tổng hợp lượng sinh khối carotenoid cao Ngược lại muối NH4 K2NO3 lại khơng thích hợp cho chủng Acid glutamic leucine lại thích hợp cho loài Rhodotorula gracilis Nấm men sinh trưởng tốt tổng hợp nhiều carotenoid môi trường chứa muối amon, tốt (NH4)2HPO4, NH4NO3 lại không thích hợp c Ánh sáng Ánh sáng khơng ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp carotenoid mà cịn ảnh hưởng đến tồn tế bào vi sinh vật số lồi vi sinh vật nhạy cảm với ánh sáng, với xạ có cường độ cao, thành tế bào bị phá vỡ dẫn tới tế bào bị phá hủy Tế bào có chứa nhiều carotenoid bảo vệ tốt tính chất chống oxy hóa chúng Ánh sáng mạnh kích thích tạo thành carotenoid Rhodotorula gracilis, Rhodotorula rubra Tỷ lệ -carotene/torulene tăng từ 1.67 bóng tối đến 2.29 ánh sáng -carotene chuyển sang torularhodin tế bào nấm men Rhodotorula glutilis, Sporobolomyces pararoseus, Sporobolomyces roseus Ánh sáng yếu tăng cường trình sinh tổng hợp carotene -carotene, -carotene, -carotene Vi khuẩn không cần ánh sáng tổng hợp màu carotenoid d Khơng khí Tất lồi nấm men tạo carotenoid hiếu khí bắt buộc Muốn vi sinh vật phát triển sinh khối tốt tạo lượng màu cao cần phải cung cấp oxy liên tục q trình ni cấy e Nhiệt độ Nhiệt độ ni cấy ảnh hưởng đến tổng lượng carotenoid sinh tổng hợp tế bào nấm men, lại làm thay đổi rõ rệt tỷ lệ hợp chất carotenoid taoh thành thay đổi tùy thuộc vào loại nấm men Ở 5oC, hai chủng Rhodotorula glutilis 48 – 23T 48 – 23W tạo màu vàng với thành phần -carotene -carotene chiếm khoảng 92-96% Ở 25 oC chúng tạo màu hồng, thành phần màu lúc có 43-47% -carotene -carotene, cịn lại torularhodin, torulene Rhodotorula peneues lại cho kết ngược lại Ở 25 oC tổng lượng màu đạt 9mg/100g skk, lượng -carotene chiếm 93% lycopene chiếm 3% Ở oC tổng lượng màu đạt 1mg/100g skk, -carotene giảm xuống 66%, lycopene tăng 13% f Thời gian nuôi cấy Thời gian ni cấy thay đổi tùy theo lồi nấm men mục đích thu sinh khối hay carotenoid Với mơi trường có glucose (NH 4)2SO4, sinh khối nấm men Sporobolomyces roseus đạt cực đại sau ngày, trình tạo carotenoid diễn chậm đạt cực đại sau 26 ngày Tế bào Rhodotorula gracilis trẻ chứa tỷ lệ -carotene torulene cao, già lượng torularhodin lại tăng lên Rhodotorula pallida tạo màu -carotene với trình sinh trưởng, nên nồng độ đạt cực đại sớm, khoảng sau ngày, sau nồng độ màu giảm dần Sau ngày lượng màu giảm khoảng 25% g Các chất ức chế tạo carotenoid Có nhiều tác nhân hóa học dùng việc nghiên cứu hình thành carotenoid nấm men 10 bước cải thiện điều kiện, thiết bị nhằm giảm thời gian nâng cao hiệu suất chiết màu Tác nhân nghiền bột thủy tinh, cát thạch anh đường kính khoảng 120m dùng tăng lực ma sát xé rách vỏ tế bào Để tăng cường hiệu suất chiết màu làm lạnh khối nghiền nước đá dùng khí trơ để giảm tổn thất màu phản ứng oxy hóa tránh thất dung mơi Ngồi cịn có phương pháp vật lý khác nghiền với áp suất cao làm tăng hiệu suất chiết màu phương pháp dùng khí nito, làm lạnh CO2 Nguồn màu từ tảo Tảo nhóm thể quang hợp có số lượng lồi lớn Tuy nhiên có 50 lồi vi tảo số lồi tảo biển có kích thước lớn nghiên cứu chi tiết liên quan tới trao đổi chất thành phần hóa học Phần lớn lồi vi tảo nuôi trồng đại trà thuộc hai ngành tảo lam tảo lục Một số lồi tảo có ý nghĩa kinh tế khai thác thuộc ngành tảo đỏ (Rhodophyta), tảo nâu (Phaeophyta) tảo lục (Chlorophyta) Sắc tố quang hợp tảo có nhóm Chlorophyl, Carotenoid Phycobilin Trong carotenoid nhóm lớn sắc tố thể sống, có khoảng 640 loại, đa phần sắc tố định màu sắc vàng, da cam, đỏ sinh vật Carotenoid tảo đa dạng so với thực vật bật cao Ở tảo lam Spirulina carotenoid gồm nhiều sắc tố khác oscilaxanthin, myxoxanthophyl, zeaxanthin, hydroechinenon, β-carotene, epoxy- β-carotene, β-cryptoxanthin, echineon Trong đó, β-carotene có tỷ lệ cao Trong tế bào có nhiều dạng xanthophyl Thực vật bật cao tảo lục giống chứa lutein với hàm lượng cao Rhodophyceae Cryptophyceae chứa nhiều lutein Tảo lam nhiều myxoxanthophyl myxoxanthin Phycobilin ( sắc tố hấp thụ ánh sáng xanh, vàng, da cam) tập trung chủ yếu tảo lam tảo đỏ Hai loại phycobilin điển hình R-phycoerithin tảo đỏ Rhodophyceae C-phycocyanin tảo lam Cyanobacteriaceae Phycobiliprotein sắc tố hịa tan nước có cấu trúc tert-pyrol Sự thích ứng sáng – tối tảo đơn bào đặc trưng thay đổi hàm lượng sắc tố nội bào 16 Sự thích màu số tảo lam biểu thị thay đổi sinh tổng hợp phycobiliprotein carotenoid Chẳng hạn tế bào Lyngbya plectonema, Phormidium sp Sinh trưởng ánh sáng đỏ có hàm lượng carotenoid cao gấp đôi tăng hàm lượng β-carotene zeaxanthin so với nuôi ánh sáng điều kiện thí nghiệm Phổ chịu mặn tảo rộng Để phản ứng với nồng độ muối NaCl cao, thiếu đạm nhiệt độ cao, tảo Dunaliella bradawl tích lũy glycerol β-carotene (glycerol chất điều hòa thẩm thấu, đặc trưng tảo Dunaliella, hàm lượng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ NaCl môi trường) Hàm lượng β-carotene trường hợp tích lũy tới 8% TLK Chính mà vi tảo Dunaliella sử dụng đối tượng để sản xuất đại trà thu β-carotene Hiện nay, Australia nước có sản phẩm β-carotene thương mại lớn thu nhận từ Dunaliella 3.1 Dunaliella Chi Dunaliella thuộc ngành Chlorophyta bao gồm số loài tảo lục đơn bào có khả thích nghi với độ mặn cao Về mặt hình thái, tế bào Dunaliella có roi, có dạng oval, cầu, elip, trứng Chi Dunaliella phân bố rộng: nước (D flagellate, D chlordata, D lateralis, D pauper), nước lợ mặn (D tertiolecta, D.bioculata, D primolecta), nước mặn (D.salina, D.minut, D.parva, D.viridis) Và cát mặn (D.terricola) Dunaliella thích nghi với biên độ pH rộng từ (D.acidophila) đến 11 (D.salina) Chi Dunaliella có lồi nghiên cứu kỹ Dunaliella salina Dunaliella tertiolecta Thành phần hóa học D.tertiolecta sau: protein 50%TLK, cacbonhydrate 20% TLK, lipid 8% TLK Bên cạnh hàm lượng carotenoid cao, lồi thuộc chi Dunaliella cịn chứa nhiều vitamin thiamin, pyridoxine, riboflavin, acid nicotinic, biotin tocopherol Đặc điểm đặc trưng Dunaliella lạp thể chúng có khả tích lũy lượng lớn β-carotene D.salina lồi có hàm lượng β-carotene cao loài tảo biết đến Tùy theo hàm lượng β-carotene tích lũy mà tế bào có màu lục 17 vàng, đỏ sẫm Trong hồ nước mặn,tế bào Dunaliella thường có màu đỏ sẫm việc tích lũy loại sắc tố Hình 3.1 Tảo D.salina Hồ Nước Mặn Lớn (Great Salt Lake) quan sát kính hiển vi Trong số lồi Dunaliella biết có loài khai thác β-carotene glycerol D.salina D.bardawil β-carotene nguồn vitamin A chất màu thực phẩm quý giá cho người Những nghiên cứu cho thấy βcarotene đóng vai trị ngăn ngừa phát triển bệnh ung thư người Năng suất β-carotene nâng cao thơng qua phương pháp sau: - Sản xuất kiểu pha: pha người ta tập trung cho tăng trưởng sinh khối nồng độ muối thấp (15%) nồng độ chất dinh dưỡng tối ưu Trong pha tảo đưa vào mơi trường có nồng độ muối cao dinh dưỡng thấp để tích lũy β-carotene - Sản xuất theo mẻ liên tục nồng độ muối ngưỡng tối ưu cho sinh trưởng tích lũy β-carotene, thu sinh khối cao tính theo thời gian Phương pháp ứng dụng nuôi quảng canh Australia 3.2 Spirulina Spirulina loài tảo lam đa bào, dạng sợi, thuộc Oscillatoriales Spirulina bề mặt dịch lỏng nhờ có mặt khơng bào khí với dạng xoắn 18 sợi Chiều dài sợi từ 50-500µm, chiều rộng từ 3-8µm Hiện có hai lồi mơ tả S platensis S maxima Chi Spirulina gồm số lồi ni trồng để lấy sinh khối Spirulina platensis, Spirulina maxima Spirulina có nhiều ưu điểm nên quan tâm nghiên cứu sử dụng nhiều số loài vi khuẩn lam vi tảo Các đặc điểm đáng lưu ý Spirulina: Hình 3.2 Tảo Spirulina - Cơ thể dạng sợi đa bào, có dạng xoắn lị xo, sống tự nhiên mơi trường nước giàu NaHCO3 - Vịng đời ngắn đơn giản: ngày điều kiện tối ưu phịng thí nghiệm, 3-5 ngày điều kiện bán tự nhiên phụ thuộc vào thơi tiết Vì thu hoạch tảo quanh năm - Sinh sống môi trường nước cho phép ta dễ dàng tạo điều kiện nuôi tối ưu để thu sinh khối đậm đặc - Hiệu suất sử dụng lượng mặt trời cao - Năng suất tính đơn vị diện tích ni trồng cao - Spirulina có xu hướng nỗi lên mặt nước tụ tập sinh khối lại, kích thước chúng lớn, dài 0,25-0,5mm, nên dễ dàng thu hoạch cách vớt, lọc 19 - Spirulina chi tảo phân bố rộng đất, nước ,nước lợ, nước mặn suối nước nóng pH tối ưu cho sinh trưởng Spirulina 8.8- 10.3 Đây ưu giúp cho Spirulina bị lây nhiếm loại tảo khác Trong điều kiện phịng thí nghiệm, sinh trưởng Spirulina đạt điều kiện tối ưu 35-370C - Spirulina giàu sắc tố Chlorophyl a chiếm 0.8% TLK, carotenoid tổng số khoảng 0.3-0.5% TLK - Đặc điểm bật Spirulina hàm lượng protein cao với thành phần acid amin cân Spirulina giàu vitamin, đặc biệt vitamin nhóm B Các lipid chủ yếu Spirulina mono, di-galactosyldiglycerid phosphatidyglycerol Phân đoạn lipid không phân cực chủ yếu acid béo tự do, nhóm lipid phân cực gồm phosphatidyglycerol, digalactosyldiglycerid tetragalactosyldiglycerid 3.3 Chlorella Thuộc ngành tảo lục, tế bào hình cầu hình oval Tốc độ tăng trưởng nhanh, sinh sản vơ tính, tế bào phân chia tạo thành 4,8 16 tự bào tử Hình 3.3 Tảo Chlorella kính hiển vi Chlorella tảo đơn bào, kích thước nhỏ khoảng 0,1µm Chlorella sống phân bố khắp nơi, chi tảo nghiên cứu kĩ Hầu hết loài Chlorella thể tự dưỡng, có số lồi sinh trưởng bóng tối sử dụng nguồn carbon hữu glucose, acetate,… Một số loài Chlorella: Chl elipsoidea,Chl vulgaris, Chl pyẻnoidosa Thành phần hóa học tế bào Chlorella tùy thuộc vào tốc độ sử dụng dinh dưỡng trình phát triển 20 Bảng 3.1 Thành phần hóa học Chlorella Thành phần(% Hàm lượng Thành phần Hàm lượng TLK) Protein tổng số Lipid Sterin Xanthophyl Chlorella b Tro Vitamin C Vitamin B6 Vitamin B12 Acid nicotinic 40 – 60% 10 – 15% 0,1 – 0,5% 3,6 – 6,6% 0,58% 10 – 34% 0,3 – 0,6 mg/g 2,3 mg/100g – mg/100g 145/100g Glucid Sterol Β-carotene Chlorella a Acid nucleic Vitamin B1 Vitamin K Vitamin B2 Niacin 25 – 35% 0,1 – 0,2% 0,16% 2,2% 6,00% 18 mg/g mg/g 3,5 mg/100g 25 mg/100g 3.4 Porphyridium Porphyridium thuộc chi Porphyridiaceace, ngành tảo đỏ Rhodophyta Tế bào khơng có thành, chứa nhiều polysaccharide Hình 3.4 Porphyridium kính hiển vi 21 Giá trị dinh dưỡng thương mại Porphyridium chỗ chúng coi nguồn polysaccharide, acid béo sắc tố phycocyanin, phycoerythrin.Sắc tố Bphycoerythrin (B-PE) P.cruentum đạt tới hàm lượng 5-10% TLK Porphyridium sinh trưởng nhiệt độ tối thích 21-26°C Tế bào chịu lượng muối cao gấp lần lượng muối nước biển pH tối ưu cho sinh trưởng 7,5 Porphyridium ni trồng đại trà ngồi trời bể kiểu ni trồng Spirulina Chlorella Có kiểu bể phản ứng dung cho nuôi Porphyridium: Cố định tế bào Porphyridium uerthan Sau cố định tế bào trải qua giai đoạn sinh lí sau: - Giai đoạn thích ứng kéo dài vài ngày: tảo cung cấp đầy đủ dưỡng chất gần quang hợp huỳnh quang - Giai đoạn phát triển: tế bào sống sót phân chia tích cực làm đầy thể tích vật liệu cố định, sinh trưởng mạnh pha logarit quang hợp mạnh - Giai đoạn ổn định: tế bào không phân chia lien tục, quang hợp mức thấp Nuôi trồng đại trà Porphyridium hệ thống ống thủy tinh nhựa Dịch tảo tuần hoàn qua cột nạp CO2 tự động Quá trình sản xuất tự động hóa cao cho suất khoảng 70 tấn/ha/năm 3.5 Vi tảo Scenedesmus Hình 3.5 Vi tảo Scenedesmus Scenedesmus thuộc họ Scenedesaceae, ngành Chlrophyta Các loài thuộc chi phân bố rộng rãi đất nước Các tế bào hình trụ có đầu vuốt nhọn, liên kết 22 với tạo thành nhóm 4, đơi 16 tế bào Trong Scenedesmus có sắc tố sau (mg/kg khối lượng khô): - Riboflavin: 7,34 - Β-carotene: 45,58 - Carotenoid tổng số: 394,65 3.6 Haematococcus Haematococcus pluvialis đại diện chi Haematococcus (ngành Chlorophytal) Là vi tảo nước có chu trình sống tương đối phức tạp: từ tế bào bất động (aplanospore) chuyển sang tế bào vận động màu đỏ nhạt với hai roi Sau roi, tế bào có màu đỏ đạm lại chuyển sang tế bào bất động Hình 3.6 Haematococcus pluvialis Sản phẩm trao đổi chất quý giá Haematococcus pluvialis asthaxanthin – loại carotenoid dùng thực phẩm với giá bán khoảng 3500 đô la Úc/kg Asthaxanthin tách chiết giai đoạn tảo thời kỳ aplanospore Tảo sinh trưởng tối ưu pH 7-8 Hãng Microbio Resources Ins Nuôi trồng đại trà tảo Haematococcus pluvialis quy mô 500m3 Trước thu hoạch, tế bào tảo chuyển sang dạng aplanospore để tăng tỷ lệ asthaxanthin sinh khối Nguồn màu từ vi khuẩn Các chất màu sử dụng rộng rãi thực phẩm, vải, sơn, mỹ phẩm, dược phẩm nhựa Tuy nhiên, ứng dụng cơng nghiệp khơng kiểm sốt chất 23 màu tổng hợp dẫn đến nghiêm trọng nguy hiểm cho sức khỏe người thảm họa mơi trường tiềm ẩn Do đó, bắt buộc phải tìm sắc tố thay phân hủy sinh học giảm tối thiểu chi phí sản xuất Sắc tố tự nhiên phân hủy sinh học thu từ nhiều nguồn tài nguyên thực vật, vi sinh vật, động vật khoáng chất Trong số này, sắc tố thu từ động vật, thực vật nguồn nấm bị ảnh hưởng khai thác cấu trúc phức tạp mô mang sắc tố khó khăn để thu hoạch sắc tố thường hình thành điểm phát triển quan trọng vòng đời phức tạp Trong số vi sinh vật tạo sắc tố, vi khuẩn cung cấp số lợi dựa tính linh hoạt nó, vịng đời ngắn kỹ thuật nhân giống đơn giản Một vài loài vi khuẩn tạo màu carotenoid giống Brevibacterium ( tạo canthaxanthin), Flavobacterium (tạo zeaxathin) Gần kỹ thuật gen người ta thu carotenoid từ lồi vi khuẩn Escherichia mà trước khơng có khả tạo màu Người thu nhận carotenoid từ Gordonia jacobaea nguồn cacbon khác Giống Xanthomonas thu màu xanthomonadin, nhóm màu vàng tan nước, hợp chất aryl-polyene chứa nhóm brom Các vi khuẩn thường phân lập từ mơ đất Đã có nhiều nghiên cứu màu X.albilineans, X.arboricola, X.campestris, X.fragariae, X.hyacnthi, X.axonopodis, X.ampelia… Vai trò sinh học xanthomonadin giúp tế bào vi khuẩn chống lại phá hủy ánh sáng có mặt oxy Bảng 4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon khác lên sinh trưởng tạo màu Gordonia jacobaea Carbon source Mg d.w/ml Total carot Glycerol D-Fructose D-Raffinose D-Glucose L-Arabinose Xylose liquid culture 12.2 6.3 3.2 2.9 3.9 (µg/g d.w.) 61.8 75.56 113 227 24.14 24.87 24 Tại Nhật cách khoảng 10 năm Kojima khám phá phân lập vi khuẩn Janthinobacterium lividum từ sợi tơ ẩm, gần National Institute of Sericultural and Entomological nghiên cứu giống vi khuẩn Janthinobacterium lividum Loài vi khuẩn sản xuất lượng lớn màu xanh tím mơi trường có chứa acid amin, chẳng hạn mơi trường Wakimoto, môi trường King B, môi trường peptone agar, môi trường agar dịch chiết từ tơ… Hình 4.1 Janthinobacterium lividum Sau nuôi cấy tế bào vi khuẩn chiết tetrahydrofuran, dịch chiết cô áp suất thấp phân tách sắc ký, sau tái kết tinh, hai thành phần màu phân tách Màu chiết xác định hỗn hợp violacein deoxyviolacein Các màu sử dụng để nhuộm sợi tự nhiên lụa, cotton, len mà nhuộm sợi tổng hợp nylon, vinylon tạo tone màu tốt bền Độ bền màu khảo sát theo thử nghiệm giặt rửa, nước nóng, xơng chà xát, khơng bền với ánh sáng mặt trời Tuy nhiên màu có khả sản xuất hàng loạt, khiếm khuyết khắc phục loại thuốc nhuộm đầy hứa hẹn Thêm vào đó, chất màu thể hoạt tính kháng nấm nấm gây 25 bệnh Rosellina necatrix, nên sử dụng loại thuốc diệt nấm sinh học Cầu khuẩn gram (+) trực khuẩn gram (-) Flavobacterium, Cytophaga, Chromobacteria, Serratia Pseudomonas có khả tạo màu vàng, đỏ Giống Micrococcus bao gồm tồn khoảng màu có liên quan với màu carotenoid: từ màu vàng M.luteus M.varians, màu cam M.nishinomiyaensis, màu hồng M.roseus đến màu đỏ M.agilis Các màu thuộc nhóm carotenoid phổ biến vi khuẩn rõ ràng đóng vai trị quan trọng việc bảo vệ chúng khỏi tác động phá hủy ánh sáng môi trường không khí, phá hủy oxy hóa dạng hoạt động oxygen Có vài trăm carotenoids khác biết đến tất chúng có hệ thống mở rộng nối đôi liên hợp β-carotene Một hay hai vòng cyclohexene đầu chuỗi mạch thay vòng thơm (aromatic rings) hay mạch béo (aliphatic chains), thể quy mô kết hợp diện hay vắng mặt nhóm chức oxygen – vốn xác định độ đậm màu phân tử Mặc dù thời gian đầu nghiên cứu vi khuẩn, tên Chromobacterium sử dụng cho nhiều vi sinh vật sản xuất màu tươi vàng, đỏ, tía nhanh chóng bị giới hạn, sinh vật sản sinh cụm màu tía, mà cịn có sinh vật mà màu tía violacein Hiện người ta hiểu vi khuẩn sản sinh violacein tối thiểu kể đến loài Chromobacterium, Janthinobacetinum Jodobacter Nhiều loài số sinh vật phân lập từ đất, nước vai trị thực Violacethin tạo mùi vị khó chịu vi khuẩn thể thực khuẩn: động vật nguyên sinh (protozoa) giun tròn (nematode) Các chất màu thấy đất thường, nước phịng thí nghiệm y khoa có từ pseudomonate màu xanh-lam (blue-green) Pseudomonas aeruginosa hay màu vàng huỳnh quang (yellow fluorescent) từ Ps.fluorescent loài liên quan Một ví dụ chất màu blue-green hấp thụ nước, không phát huỳnh quang sản xuất từ Ps.Aeuginosa pyocyanin kết tinh thành kim đẹp đóng 26 vai trị hơ hấp Chất màu vàng hấp thụ nước sản xuất số loài Pseudomonas, đặc biệt điều kiện có giới hạn sắt, biết khác theo trường hợp pyoverdin, pyofluorescein hay fluorescein đơn giản Có thể hợp chất tiết Pseudomonas fluorescin sau bị oxy hóa thành màu vàng huỳnh quang (yellow fluorescent fluorescein) Nhóm chất pyoverdines nhóm lớn phức hợp sắt (complex siderophores) dẫn xuất dihydroxyquinoline liên kết với peptide mà thân liên kết với cyclic depsipeptide Chúng giữ ion kim loại đặc biệt sắt Nhưng có nhiều màu khác, pyorubins, pyomelanins pseudomonas đem lại thách thức đáng kể cho người nghiên cứu sản phẩm tự nhiên Nguồn màu từ nấm mốc 5.1 β-carotene Có thể thu nhận màu từ nấm mốc Neuspora crassa, Penicillium sclerotiorum, Mucorals choanophoracea, Phycomyces blakesleanus (25mg β-carotene %skk), Blakeslea trispora ( ÷ 35mg β-carotene %skk), Hiện giới nấm Neuspora crassa, Blakeslea trispora nuôi để thu nhận nguồn β-carotene - Blakeslea trispora thuộc ngành Zygomycota Loài nghiên cứu kỹ khả tạo carotenoids, đặc biệt β-carotene lycopene β-carotene lycopene tiền thân vitamin A đóng vai trò quan trọng việc ức chế stress oxy hóa - Blakeslea trispora biết đến nhà sản xuất lycopene hiệu Lycopene xử lý lycopene cyclase dẫn đến việc sản xuất βcarotene Vì vậy, lycopene thu hoạch cơng nghiệp cách sử dụng chất ức chế lycopene cyclase đưa vào trình lên men Blakeslea trispora Trong zygospores Blakeslea trispora có xu hướng chứa lượng lycopene tối đa Lycopene chất trung 27 gian trình sinh tổng hợp tất carotenoid dicyclic bao gồm β-carotene β-carotene thành phần có liên quan cho sức khỏe người bệnh mãn tính β-carotene phân tử có màu đỏ cam Do đó, sử dụng tác nhân tạo màu cho sản phẩm thực phẩm β-carotene thành phần carotenes dẫn xuất isoprene khơng bão hịa cao Vì Blakeslea trispora có khả tạo lượng lớn β-carotene từ lycopene, nên Blakeslea trispora sinh vật sử dụng để sản xuất quy mô công nghiệp β-carotenes biết đến chất kích thích mạnh mẽ hệ thống miễn dịch người đóng vai trị quan trọng cơng tác phịng chống bệnh thối hóavà ung thư 5.2 Màu vàng Riboflavin (vitamin B2) Màu vàng Riboflavin (vitamin B2) dùng tạo màu cho súp, pudding, sản phẩm mứt kẹo Riboflavin thường tổng hợp từ nấm mốc Eremothecium ashbyii Khi tạo điều kiện ni cấy thích hợp, nấm mốc Eremothecium ashbyii tiết môi trường lượng riboflavin cao (1,8 mg riboflavin / 1ml) E ashbyii tạo khuẩn ty phân nhánh Khi cịn non, khuẩn ty có màu trắng, già khuẩn ty chuyển sang màu vàng, chế màu vàng vào mơi trường E ashbyii đồng hóa nguồn nitơ hữu nguồn nitơ vơ cơ, nguồn nitơ từ cazlin globulin có ý nghĩa lớn cho phát triển chúng Các nhà khoa học thấy glyxin có ảnh hưởng lớn đến sinh lý chúng Do đó, sản xuất người ta thường bổ sung glyxin vào môi trường lên men E ashbyii phát triển mạnh tổng hợp nhiều vitamin B bổ sung chất kích thích sinh trưởng tiamin, biotin, inozit Trong trường hợp môi trường thiếu nguồn carbon từ hydratcarbon, đồng hóa lipit để phát triển Người ta thường bổ sung 0,6-1,2% dầu ngô trình lên men Cơng nghệ lên men tạo Riboflavin: Mơi trường dùng sản xuất riboflavin có thành phần sau: Saccharose 5% Dịch thủy phân protein 3% 28 Phơi lúa mì 1% Cao thịt 0,3% KH2PO4 0,3% NaCl pH ban đầu 0,25% Giống nhân phân xưởng riêng Lượng giống ban đầu đưa vào 11,5% Nhiệt độ lên men 28-30oC Điều kiện thổi khí liên tục, thời gian lên men ngày Trong sản xuất Riboflavin, người ta thường áp dụng phương pháp lên men chìm Riboflavin tổng hợp tế bào nấm ngồi mơi trường ni cấy Sự thay đổi pH trình lên men phức tạp: hai ngày đầu pH giảm rõ rệt, sau ngày thứ hai pH tăng nhanh tạo thành riboflavin 5.3 Phẩm màu Monascus Sắc tố Monascus sử dụng làm màu thực phẩm phương Đông, đặc biệt Trung Quốc, Nhật Bản, In-đô-nê-xi-a Phi-lip-pin nhiều kỷ Rượu gạo Trung Quốc màu đỏ, đậy tương đỏ, rau ngâm, cá loại thịt muối số ví dụ thực phẩm màu đỏ Á Đông tạo sắc tố Monascus Các nguồn nguyên liệu sắc tố Monascus nấm Monascus purpureus phương pháp truyền thống sản xuất sắc tố liên quan đến tăng trưởng nấm môi trường rắn cơm trắng Sau sấy khơ nghiền thành bột để sử dụng chất tạo màu 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO https://xemtailieu.com/tai-lieu/cong-nghe-san-xuat-mau-tu-tao-1524216.html Giáo trình ứng dụng cơng nghệ sinh học cơng nghệ thực phẩm https://vi.wikipedia.org/wiki/Trang_Ch%C3%ADnh 30