Đang tải... (xem toàn văn)
HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 19671968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển . Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích .Hiện nay nó áp dụng rất lớn trong nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc . Và nó hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng
HPLC ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Sắc ký lỏng hiệu cao High performance liquid chromatography-HPLC ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com HPLC chữ viết tắt 04 chữ đầu tiếng Anh phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao ( High Performance Liquid Chromatography) ,trước gọi phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp đời từ năm 1967-1968 sở phát triển cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện phương pháp HPLC ngày phát triển đại hoá cao nhờ phát triển nhanh chóng ngành chế tạo máy phân tích Hiện áp dụng lớn nhiều nghành kiểm nghiệm đặc biệt ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Và cơng cụ đắc lực phân tích thuốc đa thành phần cho phép định tính định lượng ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com - Khái niệm : Sắc ký lỏng hiệu cao phương pháp chia tách pha động chất lỏng pha tĩnh chứa cột chất rắn phân chia dạng tiểu phân chất lỏng phủ lên chất mang rắn ,hay chất mang biến đổi liên kết hố học với nhóm chức hữu Q trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) 2- Nguyên tắc trình sắc ký cột : Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất q trình sắc ký lọai sắc ký • Nếu pha tĩnh chất hấp phụ ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận pha đảo • Nếu pha tĩnh chất trao đổi Ion ta có Sắc ký trao đổi ion • Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết • Nếu pha tĩnh Gel ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Cùng với pha tĩnh để rửa rải chất phân tích khỏi cột ,chúng ta cần có pha động Như nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A,B,C Vào cột phân tích ,kết chất A,B,C Sẽ tách khỏi sau qua cột Quyết định hiệu tách sắc ký tổng hợp tương tác Chất phân tích A+B+C F1 Pha tĩnh F2 F3 Pha động ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Tổng 03 tương tác định chất rửa rải khỏi cột trước tiên lực lưu giữ cột nhỏ ( F1) ngược lại Đối với chất ,sự lưu giữ qui định 03 lực F1,F2,F3 Trong F1 F2 giữ vai trò định F3 yếu tố ảnh hưởng không lớn Ở F1 lực giữ chất phân tích cột F2 lực kéo pha động chất phân tích khỏi cột ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Như với chất khác F1 F2 khác ,Kết chất khác di chuyển cột với tốc độ khác tách khỏi khỏi cột (như hình ) Pha động Thời gian A B ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com - Phân loại sắc ký : Theo chế tách sắc ký người ta phân loại sau : Sắc ký hấp phụ : Quá trình sắc ký dựa hấp phụ mạnh ,yếu khác pha tĩnh chất tan rửa giải ( phản hấp phụ ) pha động để kéo chất tan khỏi cột Sự tách hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học chất hấp phụ Trong trường loại có 02 loại hấp phụ : + Sắc ký hấp phụ pha thuận ( NP - HPLC) : Pha tĩnh phân cực ,pha động không phân cực + Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC) : Pha tĩnh không phân cực ,pha động phân cực Loại sắc ký áp dụng thành công để tách hỗn hợp chất có tính chất gần tương tự thuộc loại không phân cực,phân cực yếu hay trung bình Vitamin,thuốc hạ nhiệt giảm đau Hiện sử dụng có loại sắc ký mà thơi ThS.Trần Hồng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Chủ yếu sử dụng lọai sắc ký hấp phụ pha đảo ( RP ) Trong dược điển USP tra cứu cột có giá trị tương ứng sau : L1 : RP 18 L7 : RP L3 : Si 60 Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m Kích thước hạt tương ứng từ - 10 m Và số loại cột khác cột Diol , Cột NH2,CN vv ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Kết trinh tách chất Detector phát ghi thành sắc ký đồ ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com Các phương pháp định lượng HPLC I Phương pháp chuẩn nội II Phương pháp chuẩn ngoại III Phương pháp thêm chuẩn IV Phương pháp chuẩn hóa điện tích ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN NGOẠI Phương pháp chuẩn ngoại phương pháp định lượng bản, mẫu chuẩn thử tiên hành sắc ký điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn tính nồng độ chất mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hố điểm nhiều điểm ThS.Trần Hồng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN NGOẠI ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN NGOẠI * Chuẩn hoá nhiều điểm: Tiến hành qua bước sau : Chuẩn bị dãy chuẩn với nồng độ tăng dần tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu diện tích chiều cao pic điểm chuẩn H) Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn tương quan diện tích S (hoặc chiều cao pic với nồng độ chất chuẩn (C), xem hình 3.12 Sử dụng đoạn tuyến tính đường chuẩn để tính tốn nồng độ chất cần xác định Có thể thực việc tính tốn theo cách : Áp kiện diện tích (hoặc chiều cao) pic chất thử vào đường chuẩn suy nồng độ ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN NGOẠI ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN NỘI Phương pháp chuẩn nội (ISTD) giúp khắc phục nhược điểm ESTD Ngồi ra, cịn giúp cực tiểu hóa sai số gây nên máy móc kỹ thuật Kỹ thuật chuẩn nội tóm tắt sau: Người ta thêm vào mẫu chuẩn lẫn mẫu thử lượng chất tinh khiết, tiến hành sắc ký điều kiện Chất thêm gọi chuẩn nội Từ kiện về: diện tích (hoặc chiều cao) pic lượng (hoặc nồng độ) chuẩn, chuẩn nội mẫu thử, xác định hàm lượng thành phần cần định lượng mẫu thử cách xác ThS.Trần Hồng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN NỘI Có số yêu cầu đặt với chất chuẩn nội: Trong điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải tách hồn tồn có thời gian lưu gần với thời gian lưu chất cần phân tích mẫu thử Có cấu trúc hố học tương tự chất thử Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ chất thử Không phản ứng với thành phần mẫu thử Phải có độ tinh khiết cao dễ kiếm ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN NỘI Vì đáp ứng (response) chất chuẩn chuẩn nội với detector không độ nhạy, nên trước hết cần phải xác định hệ số đáp ứng (response factors) để hiệu tính kết * Xác định hệ số đáp ứng FX : Chuẩn bị hỗn hợp có chứa lượng (hoặc nồng độ) biết chất chuẩn chuẩn nội chạy sắc ký Sắc đồ thu cho ta biết liệu diện tích pic Trong phương pháp chuẩn nội, người ta thấy có mối tương quan tỷ số khối lượng (hoặc nồng độ) chuẩn chuẩn nội với tỷ số diện tích pic Và hệ số đáp ứng tính theo phương trình sau: ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com đây: - mC , mIS khối lượng chất chuẩn chuẩn nội CC , CIS nồng độ chuẩn chuẩn nội SC , SIS diện tích pic chuẩn chuẩn nội ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP THÊM CHUẨN ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com PHƯƠNG PHÁP CHUẨN HĨA DIỆN TÍCH Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm chất hỗn hợp nhiều thành phần tính tỷ lệ phần trăm diện tích pic so với tổng diện tích tất pic thành phần sắc đồ Phương pháp yêu cầu tất thành phần rửa giải đươc phát Tất thành phần có đáp ứng detector (response) Kỹ thuật sử dụng nhiều sắc ký khí thường có đáp ứng detector ion hố lửa (FID) Trong lợi ích kỹ thuật HPLC bị hạn chế đáp ứng điều thiếu chắn ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ThS.Trần Hoàng Thịnh Tel: 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com ... có Sắc ký hấp phụ pha thuận pha đảo • Nếu pha tĩnh chất trao đổi Ion ta có Sắc ký trao đổi ion • Nếu pha tĩnh chất lỏng ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết • Nếu pha tĩnh Gel ta có Sắc ký. .. trình sắc ký lỏng dựa chế hấp phụ,phân bố ,trao đổi Ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử ) 2- Nguyên tắc trình sắc ký cột : Pha tĩnh yếu tố quan trọng định chất q trình sắc ký lọai sắc ký. .. 0902 902 064 Email: hoangthinh6@gmail.com - Phân loại sắc ký : Theo chế tách sắc ký người ta phân loại sau : Sắc ký hấp phụ : Quá trình sắc ký dựa hấp phụ mạnh ,yếu khác pha tĩnh chất tan rửa giải