HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TUYỂN CHỌN VÀ ĐỊNH DANH CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI HISTAMINE Người thực : Lớp : Người hướng dẫn : Nguyễn Minh Huệ K59CNSTHB PGS.TS Nguyễn Hoàng Anh 1Hà Nội, 6/2018 NỘI DUNG TRÌNH BÀY MỞ ĐẦU ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề NƯỚC MẮM - Là loại gia vị truyền thống, có giá trị dinh dưỡng cao Là mặt hàng ngành thủy sản Bộ tiêu chuẩn codex quy định hàm lượng histamine khơng vượt 400mg/l Nước mắm Việt Nam có hàm lượng từ 1000 – 3000 mg/l Cản trở đường xuất nước I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề HISTAMINE SỰ PHÂN GIẢI HISTAMINE Histamine oxidase Histamine dehydrogenase Histamine - Imidazol acetaldehyde Bacillus amyloliquefacians Staphylococus carnosus phân giải 59,9% 29,1% ( Zaman cs, 2010) L.sakei phân giải 40-50% (Aishath Naila cs, 2012) Bacillus polymyxa có khả phân giải histamine (Lee cs, 2015,2016) “ Tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine” I MỞ ĐẦU 1.2 Mục đích yêu cầu Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả chịu mặn cao từ sưu tập giống Phòng TNTT Tuyển chọn định Định danh sơ chủng vi khuẩn có khả chịu mặn cao danh chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine Định danh phương pháp sinh học phân tử II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng 23 chủng vi khuẩn sưu tập giống Phịng thí nghiệm Trung tâm, khoa Cơng nghệ Thực Phẩm 2.2 Nội dung Test khả chịu mặn 23 chủng vi khuẩn sưu tập giống phịng TNTT Định danh sơ chủng có khả chịu mặn (khảo sát phản ứng hóa sinh, quan sát hình thái kính hiển vi) Xác định khả phân giải histamine chủng vi khuẩn chịu mặn cao Định danh phương pháp sinh học phân tử chủng vi khuẩn phân giải histamine II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP 2.3 Phương pháp nghiên cứu • Test khả chịu mặn: phương pháp đếm khuẩn lạc (theo TCVN 4884-1:2015): Ria Nuôi lỏng Cấy chang Đếm khuẩn lạc MT HA MT HA Nuôi tủ 37ºC Nuôi tủ lắc 37ºC ngày Trong ngày Nuôi tủ 37ºC ngày II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP 2.3 Phương pháp nghiên cứu • Định danh sơ chủng vi khuẩn Gram âm Test catalase: (theo TCVN 4884- Test KOH: (theo Buck JD, 1982) 2005) Nhuộm Gram: (theo Buck JD, 1982) Gram dương II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP 2.3 Phương pháp nghiên cứu • Tuyển chọn chủng có khả phân giải histamine: Xác định hàm lượng histamine hệ thống HPLC Chuẩn bị mẫu: 250µl dịch ni 5ml mt HA 5% histamin ngày hấp khử trùng 5mM Ly tâm, thu dịch 0h, ngày,7 ngày Chiết Bơm vào hệ Tạo dẫn xuất Methanol: nước thống HPLC OPA (75%:25%) Tiến hành phân tích hệ thống HPLC chạy sắc ký với detector huỳnh quang, bước sóng: Ex 230nm Em 450 nm II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP 2.3 Phương pháp nghiên cứu • Tuyển chọn chủng có khả phân giải histamine: Xác định hàm lượng histamine hệ thống HPLC FLD1 A, Ex=230, Em=450 (Histamine_25052018\Histamine_25052018b 2018-05-25 16-16-47\his0000010.D) LU 7.774 8000 f(x) = 65.14x + 74.05 R² = 60 6000 50 5000 40 4000 3000 30 2000 20 1000 0 20 40 60 80 100 120 10 2.278 Diện tích peak 7000 Hàm lượng histamine (ppm) Hình Đồ thị đường chuẩn histamine 10 12 14 Hình Hình ảnh sắc ký đồ chuẩn histamine 10 II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP 2.3 Phương pháp nghiên cứu • Định danh phương pháp PCR: (theo Đào Thị Thu Ngà, 2012) Tách chiết DNA tổng số Khuếch đại gen mã hóa Chạy PCR 16rDNA Giải trình tự DNA Mẫu gửi phân tích PTN Proteomics, Trung tâm NC PT CNSH, Viện CN sinh học–CN Thực Phẩm, Trường Blast ngân hàng Gen ĐH Bách Khoa HN 11 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn vi khuẩn có khả chịu mặn Bảng Kết tuyển chọn vi khuẩn có khả chịu mặn Mật độ khuẩn lạc TT Mật độ khuẩn lạc (CFU/ml) Tên chủng TT 15% 20% 25% (CFU/ml) Tên chủng 15% 20% 25% DC0001 1208775 650761 13 HH0005 1520765 789110 DC0002 1090503 681510 14 HH0006 1372973 814559 DC0003 1743551 1005110 15 HH0007 1607521 889050 21 DC0004 1371077 511220 16 BL0001 1330632 670210 DC0005 1935691 983973 97 17 BL0002 1490068 769032 DC0006 1312157 521001 18 BL0003 1445455 793752 DC0007 1161546 545716 19 BL0004 1241921 657865 DC0008 1103260 612052 20 BL0005 1002798 541260 HH0001 1136776 579962 21 BL0006 1108484 594569 10 HH0002 1278294 660016 22 BL0007 1805914 1021092 205 11 HH0003 1401459 721580 23 BL0008 1570969 609904 12 HH0004 1890994 1019010 147   12 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tuyển chọn vi khuẩn có khả chịu mặn Hình Hình ảnh ria chủng HH0004 đĩa thạch Hình Hình ảnh cấy trang chủng HH0004 đĩa thạch 13 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2 Định danh sơ chủng vi khuẩn Bảng Kết định danh sơ chủng vi khuẩn STT Tên chủng Đặc điểm khuẩn lạc Test KOH Test catalase Đặc điểm hình thái BL0001 Trịn, trắng đục - + Gram âm, trực khuẩn BL0002 Trịn, bóng, trắng - + Gram âm, cầu khuẩn BL0003 Trịn, bóng, trắng đục - + Gram âm, cầu khuẩn BL0007 Trịn, trắng đục, bóng + + Gram dương, trực khuẩn HH0004 Trịn, bóng, trắng đục + + Gram dương, trực khuẩn HH0005 Tròn to, trắng đục + + Gram dương, trực khuẩn HH0006 Tròn, trắng đục + + Gram dương, cầu khuẩn HH0007 Tròn, trắng đục + + Gram dương, cầu khuẩn DC0003 Trịn, bóng, trắng đục + + Gram dương, cầu khuẩn 10 DC0005 Trịn, bóng, trắng đục + + Gram dương, cầu khuẩn “ + ”: có phản ứng “ - ”: khơng phản ứng 14 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.2 Định danh sơ chủng vi khuẩn Chủng BL0007 Chủng HH0004 Hình Hình ảnh soi kính hiển vi quang học vài chủng vi khuẩn 15 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine Bảng Bảng hàm lượng tỉ lệ phân giải histamine thời điểm 0h, ngày ngày Hàm lượng TT Tên chủng histamine 0h (ppm) Hàm lượng histamine Tỉ lệ phân giải so với 0h Hàm lượng histamine Tỉ lệ phân giải so với (ppm) (%) (ppm) 0h (%) BL0007 20.741 18.0929 12.77 14.5157 30.01 HH0005 20.741 15.9589 23.05 15.836 23.65 DC0005 20.741 18.4767 10.92 16.9568 18.25 HH0004 20.741 13.5485 34.68 10.9539 47.19 16 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine 25 HL histamine (ppm) 20 15 BL0007 HH0005 DC0005 HH0004 10 0 Thời gian (ngày) Hình Biểu đồ thể hàm lượng histamine thời điểm 0h, ngày, ngày 17 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.3 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine Hình Hình ảnh sắc kí đồ chủng HH0004 thời điểm giờ, ngày ngày 18 III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.4 Định danh PCR Hình Kết tách chiết DNA tổng Hình Kết PCR với cặp mồi đặc hiệu số Kết giải trình tự chủng HH0004, blast genbank cho kết chủng Virgibacillus campisalis Đây vi khuẩn gram dương, kị khí, hình que 19 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Từ 23 chủng vi khuẩn, tuyển chọn đc 10 chủng có khả phát triển tốt nồng độ muối 20% - Định danh sơ chủng vi khuẩn có khả chịu mặn nồng độ muối 20%, xác định hình thái vi khuẩn, đặc tính sinh hóa chúng - 10 chủng vi khuẩn có khả chịu mặn nồng độ muối 20% đem phân tích khả phân giải histamine thấy có 4/10 chủng có khả phân giải histamine chủng HH0004 có khả phân giải tốt với tỉ lệ phân giải sau ngày 47,19% so với thời điểm 0h - Chọn chủng HH0004 có khả phân giải histamine cao đưa định danh kết là: chủng vi khuẩn HH0004 có tên Virgibacillus campisalis 20 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục tiến hành thí nghiệm với chủng BL0007, HH0004, DC0005, HH0005 với thời gian nuôi lâu để kiểm tra khả phân giải histamine tối đa chúng - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả phân giải histamine chủng vi khuẩn tìm để tối ưu hóa yếu tố 21 22 ... Phòng TNTT Tuyển chọn định Định danh sơ chủng vi khuẩn có khả chịu mặn cao danh chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine Định danh phương... polymyxa có khả phân giải histamine (Lee cs, 2015,2016) “ Tuyển chọn định danh chủng vi khuẩn có khả phân giải histamine? ?? I MỞ ĐẦU 1.2 Mục đích yêu cầu Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả chịu mặn... chủng vi khuẩn có khả chịu mặn nồng độ muối 20% đem phân tích khả phân giải histamine thấy có 4/10 chủng có khả phân giải histamine chủng HH0004 có khả phân giải tốt với tỉ lệ phân giải sau ngày