ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC Phần I: Nuôi Cấy Tế Bào Đặt vấn đê Nuôi cấy tế bào động vật là một những kĩ thuật bản, được ứng dụng rộng rãi nhiêu lĩnh vực Mục đích: - Làm quen với các thao tác thu nhận tế bào tủy xương chuột , phân lập, nuôi cấy và đánh giá tế bào Nội dung bản Nuôi cấy sơ cấp Nuôi cấy thứ cấp Đông lạnh giải đông Nuôi cấy sơ cấp: Thu nhận tế bào tủy xương chuột Thu nhận đùi Giết chuột Kéo giãn đốt sống cổ Mổ chuột Kết quả: Đùi không dính máu, nên hạn chế được việc nhiễm một số tb khác không phải từ tủy xương Thu nhận quần thể tế bào tủy xương chuột Xương đùi chuột + PBS kháng sinh 5X + rửa PBS kháng sinh 1X (2 lần) Chuyển huyên phù vào bình roux ni cấy 37oC, 5%CO2 Loại bỏ hoàn toàn phần lại Tế bào tủy xương được huyên phù Cắt rời các đoạn xương đùi khỏi xương cẳng chân Hút 1ml MTNC (DMEM/F12, 10%FBS, 1% kháng sinh) bơm vào tủy xương để dội rửa (2 lần)  Thu tế bào tủy xương Tế bào tủy xương được huyên phù kỹ Đếm tế bào Xác định tỷ lệ sống chết tế bào tủy xương chuột Trộn huyên phù tế bào: Pha loãng tiếp 10 lần Trypan blue (1:1)  pha loãng lần Pha loãng 20 lần Chuyển mẫu lên buồng đếm và đếm ô 34 31  Tổng số tế bào z = 186 (tế bào) 51 35 35  Số tế bào trung bình buồng đếm a = z/5 = 186/5 = 37.2 (tế bào) Xác định mật độ tế bào: A = a x d / V= 37.2 x 20 x104 = 7,4 x 106 (tế bào/ml) Với: Thể tích buồng đếm V=10-4 ml, độ pha loãng d = 20 lần Thay mơi trường • Đối tượng: hUCB-MSC (tế bào máu rốn) • Mục đích: Loại bỏ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào và cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng cho tế bào phát triển • Vật liệu: dd mơi trường ni cấy, PBS, ống bóp, becher • Các bước thực hiện: Hút bỏ môi trường cũ Bổ sung PBS Lắc nhẹ Bổ sung môi trường mới 3ml, lắc nhẹ Thay mơi trường Hình ảnh sau thay mơi trường các đợ phóng đại 5x 10x Đặt vấn đê Thụ tinh nhân tạo được biết đến là một phương pháp hỗ trợ sinh sản hiệu quả được áp dụng phổ biến điêu trị vô sinh hiếm muộn nhằm mang đến hội được làm cha, làm mẹ cho nhiêu cặp vợ chồng Mục tiêu bài thực tập: Giúp sinh viên hiểu được chế, cách thức và thao tác thụ tinh in vitro cḥt Quy trình tổng quát • Chuẩn bị • Thu nhân giao tử cái/đực • Thụ tinh Chuẩn bị Lọc dầu khoáng: Nguyên tắc: sử dụng màng lọc vô trùng, lỗ lọc nhỏ Mục đích: loại bỏ vi sinh vật, các chất tạp nhiễm Tạo vi giọt: Nguyên tắc: vi giọt đứng và vi giọt nằm tùy vào mục đích Chức Đĩa loại cucumlus Đĩa thụ tinh Đĩa nuôi phôi Thể tích giọt 10ul Fertimed giọt 50ul Fertimed giọt 10ul Fertimed giọt 10ul+40ul Fertimed giọt 10ul+40ul Embryo Chuẩn bị Gây siêu bài noãn Nguyên tắc: sử dụng các hormone kích thích buồng trứng, gây chín và rụng trứng nhiêu Mục đích: thu nhận được nhiêu trứng chín thời điểm Cách tiến hành: - Ngày -3: tiêm 10IU PMSG (thể tích 0.1 ml; nông độ 100IU/ml - Ngày -1: 46-48h sau tiêm PMSG, tiêm 0.1ml hCG 100IU/ml - Ngày 0: 13-14h sau tiêm hCG tiến hành thu nhận trứng Thu nhận giao tử cái Gây mê chuột, thu nhận buồng trứng và một phần ống dẫn trứng, có chứa đoạn bóng Dùng kim, xé đoạn bóng Chuyển trứng vào vi giọt Fertimed+hya để loại cumulus sau rửa trứng giọt Fertimed cịn lại Kết quả: Khơng có đoạn bóng-> khơng thu được trứng-> sử dụng trứng nhóm Biện luận - Đoạn bóng rách thao tác - Khơng thu được đoạn bóng Thu nhận giao tử đực Thu nhận đoạn từ mào tinh đến qua đoạn gập chuột nhóm Cho vào eppendorf chứa môi trường FertiMed Tách mỡ, máu, dùng kẹp kéo từ mào tinh dồn vào đoạn gập thu lấy giọt tinh dịch Mang swim up, tủ ấm 37oC, 5% CO2, 30 phút, nghiêng 45 đô Cho vào eppendorf chứa môi trường S Thu nhận giao tử đực Hút 450ul dung dịch bê mặt đã swim-up ly tâm 800rpm, phút Thu cặn Hòa cặn 50ul dung dịch F Hút 10 ul epp hòa chung 10ul trypan Blue Đánh giá chất lượng tinh trùng Thu nhận giao tử đực Kết quả: Tổng số tinh trùng 275 Tinh trùng di dộng 29 10,5% Tinh trùng chết 1% Mật độ 5,5.106 tinh trùng/ul Mật độ (N): = Thụ tinh ống nghiệm Thêm 30ul tinh trùng vào vi giọt 10ul đĩa môi trường thụ tinh Hút chuyển trứng vào vi giọt chứa tinh trùng Cho vi giọt vào tủ nuôi tế bào, 37oC, 5%CO2 Sau 4-6h hút chuyển trứng sang vị giọt ni phơi, quan sát hình thái phơi Trứng Tinh trùng Trứng được thụ tinh Thụ tinh ống nghiệm •Mật đợ tinh trùng lúc thụ tinh: 4,125.106 tinh trùng/ul •Biện ḷn: tiêm 30ul tinh trùng vào giọt mơi trường thụ tinh 10ul -> đợ pha loãng ¾ => ¾ 5,5.10^6 = 4,125.10^6 Dự đoán: Phôi giai đoạn 2-3 tế bào (khoảng sau 43h), xuất hiện thể cực thứ 2, kích thước đêu thể cực Kết quả thụ tinh ống nghiệm Tế bào chất trứng co lại tách khỏi màng zona Kết quả: Không tạo thành phôi Kết quả thụ tinh ống nghiệm Biện luận: •Sử dụng kính soi truyên thẳng và khơng có bể ổn nhiệt nên trứng quá trình thao tác, quan sát tiếp xúc nhiêu với nhiệt đợ => chết trứng •Tỷ lệ phơi tạo thành phụ thuộc vào nhiêu yếu tố sau: -Khả thụ tinh của trứng/ tinh trùng -Môi trường nuôi phôi phù hợp -Sự ổn định nhiệt độ của môi trường thụ tinh/ nuôi phôi Chuột sau ngày Thank you ... Trứng Tinh trùng Trứng được thụ tinh Thụ tinh ống nghiệm •Mật đợ tinh trùng lúc thụ tinh: 4,125.106 tinh trùng/ul •Biện luận: tiêm 30ul tinh trùng vào giọt môi trường thụ tinh 10ul... Tế bào bám dinh hình dài Tế bào hình cầu Tế bào chuẩn bị bám dính Ni thứ cấp (1) Hút bỏ mơi trường cũ (2) Rửa PBS 1X lần (3) Tách tế bào cell scraper Tế bào mBM-MSC (4) Chụp hình sau nuôi cấy. .. chất lượng tinh trùng Thu nhận giao tử đực Kết quả: Tổng số tinh trùng 275 Tinh trùng di dộng 29 10,5% Tinh trùng chết 1% Mật độ 5,5.106 tinh trùng/ul Mật độ (N): = Thụ tinh ống nghiệm