ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC (NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT VÀ IVF) NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Thu nhận mơ có chứa tế bào sống NI CẤY SƠ CẤP Tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào Ni cấy CẤY CHUYỀN VÀ NI CẤY THỨ CẤP THU NHẬN MÔ XƯƠNG ĐÙI,XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT Nguyên tắc -Thu nhận xương đùi chuột có chứa tế bào sống tủy xương chuột cách mổ thu nhận trực tiếp chuột THU NHẬN MÔ XƯƠNG ĐÙI CHUỘT Kết -Thu nhận thành công xương đùi chuột nguyên vẹn, vị trí THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG THU XƯƠNG ĐÙI CHUỘT RỬA PBS 5X RỬA PBS 2X DỘI RỬA TỦY XƯƠNG ĐẾM MẬT ĐỘ TẾ BÀO NUÔI CẤY THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG Nguyên tắc -Thu nhận quần tế bào tủy xương cách dội rửa với dung dịch nuôi tế bào (DMEM/F12 bổ sung 10% FBS,kháng sinh 1%) THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG Kết -Sau tiến hành dội rửa tủy xương, đoạn xương màu đỏ bên trong, tế bào dội rửa tỉ lệ cao -Tuy nhiên, trình thao tác rơi xương nên có khả gây nhiễm q trình nuôi cấy ĐẾM TẾ BÀO Nguyên tắc -Đếm tế bào cách đếm buồng đếm hồng cầu với thuốc nhuộm trypan blue(bắt màu với tế bào chết) ĐẾM TẾ BÀO 10 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) • Kết đạt - Khơng có đoạn bóng, mơ đệm có trứng non 30 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 2.2 Thu giao tử đực 2.2.1 Thu mào tinh ống dẫn tinh - Mổ bìu chuột đực để tiến hành thu mào tinh ống dẫn tinh Xác định vị trí mào tinh đoạn phình lên ống dẫn tinh Cắt mào tinh ống dẫn tinh cho vào Eppendorf chứa sẵn dung dịch PBS 31 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) • Kết thu - Tinh hồn chuột bị rút lên ổ bụng, khơng tìm thấy khơng thu nhận mào tinh ống dẫn trứng ⇒ Xin tinh trùng nhóm khác (nhóm 11) 32 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 2.2.2 Thu tinh dịch tiến hành swim-up 2.2.2.1 Thu tinh dịch - Thu tinh dịch từ mào tinh ống dẫn tinh Dùng kẹp vuốt dọc ống dẫn tinh để tinh dịch tràn dính mép ống dẫn tinh Dùng kim tiêm quệt tinh dịch cho vào dung dịch swim-up Tinh dịch chổ đoạn phình ống dẫn tinh ta dùng kẹp vuốt cho căng lên Dùng kim tiêm đâm vào để tinh dịch tràn ra, dùng kim tiêm quệt tinh dịch cho vào dung dịch swim-up 33 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 2.2.2 Thu tinh dịch tiến hành swim-up(tt) 2.2.2.2 Swim-up   - Cho eppendorf chứa dung dịch swim-up có tinh trùng vào tủ ni cấy sơ cấy 30p, để tiến hành swim-up - Sau swim-up, hút phần dịch sang eppendorf khác, hút 20 đem đếm để xác định mật độ, phần cịn lại đem ly tâm để đặc tinh trùng 34 • Kết đạt   - Thể tích hút sau swim-up 450 (của nhóm 11) Đếm tinh trùng + Tổng tinh trùng đếm 396 + Tính mật độ tinh trùng dựa vào công thức N(tinh trùng/ml) = x 10 x độ pha loãng ⇒ Mật độ tinh trùng là: 7.92x10 (tt/ml) ⇒ Số lượng tinh trùng ta có 7.92x10 x 0.43 = 3405600 (tinh trùng) Mật độ tinh trùng cần để thụ tinh 2.5 x 10 (tinh trùng/ml) ⇒ Thêm vào 3,16ml dung dịch thụ tinh   35 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 2.3 Thụ tinh ống nghiệm 2.3.1 Tạo vi giọt   - Tạo vi giọt thụ tinh: Dùng pipite nhỏ 10 dung dịch để tạo giọt đĩa, tạo vi giọt ⇒ thêm nhẹ nhàng khoảng 3.5ml dầu khống vào - Tạo vi giọt ni phơi: Dùng pipite nhỏ 10l dung dịch để tạo giọt đĩa, tạo vi giọt ⇒ thêm nhẹ nhàng khoảng 3.5ml dầu khoáng vào ⇒ thêm tiếp 30l vào giọt ⇒ Chuyển nhẹ nhàng cẩn thận vào tủ nuôi cấy sơ cấy 36 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 2.3.2 Thụ tinh   - Hút chuyển trứng vào vi giọt thụ tinh - Thêm 30l huyền phù tinh trùng vào o - Cho vi giọt thụ tinh vào tủ nuôi tế bào từ 4-6h, 37 C, 5% CO2 37 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) Kết nhuộm phơi Hình ảnh phôi nhuộm với hoechst PI THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) Biện luận-giải thích - Ta thấy trứng bắt màu xanh chứng tỏ trứng nhuộm với Hoechst Do trứng cịn sống • Kết đạt - Đã tạo vi giọt, chuyển huyền phù tinh trùng vào vi giọt, khơng có trứng nên khơng thể tạo phôi 20um 40 THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM (IVF) 2.3.3 Nuôi phôi   - Hút chuyển trứng sang vi giọt ni phơi, quan sát hình thái phơi - Tỉ lệ phơi tạo thành tính theo cơng thức sau: 41 KIẾN NGHỊ -Nếu tạo phơi thất bại, có phơi mẫu để quan sát -Có thể thêm xếp chương trình thực tế ứng dụng nuôi cấy tế bào - Phần thực tập kĩ thuật mổ thu trứng tinh chuột bọn em tập huấn nhiều để thao tác khơng q bỡ ngỡ 42 CÁM ƠN THẦY CƠ ĐÃ LẮNG NGHE ! 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO • • • Culture of Animal Cells R Ian Freshney General Guide for Cryogenically Storing Animal Cell Cultures John Ryan, Ph.D Cryogenic Preservation and Storage of Animal Cells John A Ryan, Ph.D 44 ...NUÔI C? ?Y TẾ BÀO ĐỘNG VẬT NUÔI C? ?Y TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Thu nhận mơ có chứa tế bào sống NUÔI C? ?Y SƠ CẤP Tách rời tế bào, xác định mật độ tế bào Nuôi c? ?y C? ?Y CHUYỀN VÀ NUÔI C? ?Y THỨ CẤP THU... pháp tách tế bào: Cơ học hóa học y? ??u tố ảnh hưởng c? ?y chuyền: pH (6.0 – 6.5, giảm 0.4/ng? ?y) ; mật độ tế bào (70% tế bào) ; loại tế bào; đánh giá hình thái tế bào 16 C? ?Y CHUYỀN Quy trình Ly tâm 2000... có khả g? ?y nhiễm q trình ni c? ?y ĐẾM TẾ BÀO Nguyên tắc -Đếm tế bào cách đếm buồng đếm hồng cầu với thuốc nhuộm trypan blue(bắt màu với tế bào chết) ĐẾM TẾ BÀO 10 ĐẾM TẾ BÀO 11 ĐẾM TẾ BÀO Kết 23