TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM KHOA SINH HỌC-CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CNSH Y DƯỢC PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT I Đặt vấn đề II Tổng quan III Vât liệu – phương pháp IV Kết quả- giải thích V Kết luận – Kiến nghị VI Tài liệu tham khảo I ĐẶT VẤN ĐỀ • Kĩ thuật nuôi cấy tế bào công cụ cần thiết mở đường cho nghiên cứu ung thư, phân loại khối u ác tính, mơ hình thực nghiệm để khảo sát tác động hóa chất, xác định tương hợp mô cấy ghép… • Vì việc nắm vững thao tác kĩ thuật nuôi cấy tế bào động vật tảng thiết yếu cho tất nghiên cứu tế bào II TỔNG QUAN Tủy xương: chứa loại tế bào : tế bào gốc trung mô MSC, tế bào gốc tạo máu HSC, tế bào máu trưởng thành • Tế bào gốc trung mơ (MSC) Có khả bám vào bề mặt giá thể ni cấy in vitro có hình dạng giống ngun bào sợi • Có khả biệt hóa thành nhiều dòng tế bào khác xương, mỡ, sụn Hình Tủy xương III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu • Mẫu vật: chuột nhắt trắng Swiss Albino • Hóa chất: - Cồn 70o - Dung dịch PBS (dung dịch kháng sinh 5X, 2X, 1X) - Trypan blue - Trypsin/EDTA (0.25%/1%) - Môi trường DMEM/F12 FBS 10% - Môi trường đông lạnh - Môi trường giải đơng • - Dụng cụ: Erlen - Buồng đếm hồng cầu Becher - Bình flask Falcon - Cryotube Kẹp cong, kẹp thẳng - Kim tiêm Kéo thẳng - Đĩa petri Ống bóp - Khay rác Phương pháp NUÔI CẤY SƠ CẤP Thu nhận xương đùi xương cẳng chân chuột Cắt đầu xương dội rửa Loại bỏ mô thu tuỷ xương Buồng đếm hồng n Bì Ni sơ cấp ou hR x cầu Xác định mật độ tế bào THAY MÔI TRƯỜNG Bổ sung môi trường Hút bỏ môi trường cũ Rửa PBS CẤY CHUYỀN VÀ ĐƠNG LẠNH Hút bỏ mơi trường cũ Thêm trypsin Rửa PBS Ủ Thêm môi trường Cấy chuyền 0,5ml Cho lại vào bình Roux Thêm mơi trường Ly tâm thu cặn Thêm môi trường đông lạnh Đông lạnh C (30’) Đô n gl ạn h0 , 5m l Thêm môi trường nuôi Cryotube -20 C (1h) -80 C GIẢI ĐÔNG Bổ sung môi trường giải o 37 C Cryotube đông Bổ sung môi trường nuôi Ly tâm thu cặn Buồng đếm hồng cầu Xác định tỉ lệ tế bào sống chết Bình Roux 10 TẠO VI GIỌT • Mục đích: lượng mẫu ban đầu ít, tạo vi giọt để tăng khả tiếp xúc trứng tinh trùng • Nguyên tắc: tạo chân đế trước, bổ sung dầu khoáng tạo phần thân để giúp cố định hình dạng vi giọt • - Tạo vi giọt Vi giọt thụ tinh (4 giọt): hút 10µl FertiMed vào đĩa petri nhỏphủ 3ml dầu khống Vi giọt ni phơi (4 giọt): hút 10µl EmbryoCul vào đĩa petri nhỏ tạo chân đế  phủ 3ml dầu khống hút 40µl EmbryoCul vào chân đế tạo phần thân vi giọt Ủ vi giọt: 37 C, 5%CO2 3h  Đánh giá: vi giọt tròn đều, thể tích, khơng nhiễm 28 C I II III QUY TRÌNH IVF Thu giao tử Thu giao tử đực Thụ tinh ống nghiệm 29 I THU GIAO TỬ CÁI QUI TRÌNH: Chuột gây mê  mổ lưng  tìm thu nhận buồng trứng  rửa PBS Khâu lại vết thương cho chuột Xác định đoạn bóng  xé màng ống dẫn trứng  thu nhận cụm trứng  hút chuyển trứng vào đĩa chứa 30 KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH Đoạn bóng Hình 1: Buồng trứng Hình 2: Cụm OCC Kết quả: Thu nhận buồng trứng, không lẫn máu, mảnh mô Thu cụm trứng 31 ĐÁNH GIÁ TRỨNG Hình 5: Trứng sau thu nhận từ buồng trứng Trứng mờ, nhạt màu, có lớp cumulus bao phủ dày đặc bao quanh  trứng trưởng thành (trứng số 2) Một số bất thường hình dạng ( trứng số 3) 32 II THU GIAO TỬ ĐỰC QUI TRÌNH Chuột gây mê  mổ tinh hồn  tìm thu nhận mào tinh, ống dẫn tinh Thu nhận tinh dịch vào eppendorf có mơi trường SWM Swim-up thu dịch 33 KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH Hình 4a Tinh trùng kính hiển vi (Nhóm 11) Hình 4b: Đếm tinh trùng Kết quả: Thu tinh dịch, không lẫn mỡ, máu, mảnh mô Không đánh giá chất lượng tinh trùng Giải thích: Do thao tác sai trình vệ sinh buồng đếm nạp mẫu : cồn chưa khô  trypane blue kết tủa cồn buồng đếm  tinh trùng co cụm lại không quan sát mẫu Hướng giải quyết: xin mẫu nhóm 11 34 Số tinh trùng buồng đếm ( 25 ô ô trung tâm) 30 26 35 16 14 22 10 21 14 50 32 Mật độ tinh trùng mẫu:   N= (tinh trùng/ml) Đánh giá: chất lượng tinh trùng tốt (tinh trùng khỏe, bơi tốt, mật độ cao) 35 •• Lượng tinh trùng có 430àl: 0,43= 2,9 x 106 tinh trựng ã Mật độ tinh trùng để thụ tinh ∼ 2,5.106 tinh trùng/ml  Thể tích mơi trường cần hút để đạt mật độ 2,5.10 tinh trùng/ml: = 1.17 ml 36 III THỤ TINH QUI TRÌNH Hút chuyển trứng + 40µl huyền phù tinh trùng vào vi giọt thụ tinh  ủ tủ nuôi 370C, 5%CO2 KẾT QUẢ VÀ GIẢI THÍCH Kết quả: Khơng tạo phơi, hình dạng trứng bị móp méo, phân mảnh 37 Giải thích: - Thời gian thu nhận thụ tinh lâu làm giao tử bị yếu Tinh trùng yếu, chuyển vào vi giọt tinh trùng di động yếu tiến tới Trứng bất thường, bị phân mảnh  không thu nhiều trứng để thụ tinh Tinh trùng chết  gốc oxy tự ảnh hưởng đến trứng thụ tinh 38 NHUỘM PHƠI Phơi nhuộm với Hoechst PI 10 phút, rửa sạch, sau quan sát kính hiển vi Phơi bắt màu Hoechst Phơi bắt màu PI Hình : Phơi nhuộm với Hoecst PI Nhận xét: Phôi bắt màu thuốc nhuộm Hoechst (màu xanh) PI (màu đỏ) Giải thích: Hoechst liên kết DNA  huỳnh quang màu xanh Phôi chết màng tế bào không hoạt động  PI liên kết với DNA huỳnh quang màu đỏ D KẾT LUẬN • Thực thao tác việc thu nhận xác định đánh gía giao tử đực chuột • • • Tạo vi giọt thụ tinh nuôi phôi Vi giọt không bị nhiễm Chưa xác định hình thái giai đoạn phát triển phơi 40 E KIẾN NGHỊ • • Có thể luyện tập thêm thao tác hút chuyển trứng GVHD thực toàn kĩ thuật trước lần để sinh viên có xem rút kinh nghiệm trước thực • Thụ tinh hệ thống thụ tinh khác 41 VI • • • • TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình thực tập chuyên ngành CNSH Y Dược Công nghệ sinh học người động vật, Phan Kim Ngọc- Phạm Văn Phúc Công nghệ tế bào gốc, Phan Kim Ngọc- Phạm Văn Phúc Công nghệ hỗ trợ sinh sản, Phạm Văn Phúc 42 ... dưỡng cho tế bào bám dính phát triển 17 C? ?Y CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH Trước c? ?y chuyền So sánh trước sau c? ?y chuyền tế bào MCF7 Sau c? ?y chuyền 18 • Mục đích c? ?y chuyền - Cung cấp chất dinh dưỡng không gian... thực • Thụ tinh hệ thống thụ tinh khác 41 VI • • • • TÀI LIỆU THAM KHẢO Giáo trình thực tập chuyên ngành CNSH Y Dược Công nghệ sinh học người động vật, Phan Kim Ngọc- Phạm Văn Phúc Công nghệ tế... khúc xương Sau thu nhận, huyền phù chưa  tế bào tập trung thành cụm 14 So sánh q trình qua ng? ?y ni sơ cấp Ng? ?y Ng? ?y Hình Hình chụp tế bào ni c? ?y sơ cấp • Nhận xét: Sau ng? ?y ni sơ cấp, xuất nhiều