BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC XÂY DỰNG PHƯƠNG ÁN TÁCH DÒNG GEN SHRUNKEN-2 TỔNG HỢP TINH BỘT TỪ DỊNG NGƠ H14 Hướng lựa chọn đề tài Ngày nay, người ngày phát triển, dân số ngày đơng, nhu cầu lương thực theo mà tăng lên Điều đặt thách thức cho giới nghiên cứu khoa học làm để làm tăng suất trồng đặc biệt lương thực ngơ, lúa, lúa mì v.v Gen Shrunken (Sh2) chứng minh gen mã hóa cho tiểu phần lớn enzyme ADP-glucose pyrophosphorylase nội nhũ, enzyme tham gia vào trình tổng hợp tinh bột nội nhũ Đoạn gen nghiên cứu chuyển thành công vào ngô làm tăng hàm lượng tinh bột lên đáng kể so với đối chứng khơng chuyển gen Thực tách dịng gen shrunken-2 tổng hợp tinh bột từ dịng ngơ h14 01 Tìm kiếm thông tin gen Shrunken-2 sở liệu NCBI 02 04 Thiết kế mồi nhờ chương trình Primer BLAST 05 Tìm trình tự mã hóa tính trạng tăng tổng hợp tinh bột giống NCBI Tiến hành PCR so sánh với sở liệu nhờ chương trình BLAST 03 06 Xác định vùng bảo thủ chương trình Clustal Omega Tạo vector tách dịng gen Tìm kiếm thơng tin gen Shrunken-2 sở liệu NCBI NCBI trung tâm thông tin Ouốc gia Công nghệ sinh học Mỹ thành lập vào năm 1988 Đây sở liệu sinh học lớn giới Đường dẫn: https://www.ncbi.nlm.nih gov/ Tìm kiếm thơng tin gen Shrunken-2 sở liệu NCBI Cơng cụ PubMed- nơi tìm kiếm báo kết nghiên cứu khoa học cơng bố Một báo điển hình nói gen Shrunken-2 tinh bột ngô sản phẩm xếp lại NST phức tạp Tìm trình tự mã hóa tính trạng tăng tổng hợp tinh bột giống NCBI Sử dụng công cụ Nucleotide, tìm kiếm báo gen Shrunken-2 kết Sau cho chạy Run BLAST để tìm chủng hay lồi biểu tính trạng tăng sinh tổng hợp tinh bột mà có độ tương đồng gen cao Tìm trình tự mã hóa tính trạng tăng tổng hợp tinh bột giống NCBI Sau chạy Run BLAST, kết cho báo cơng bố chủng lồi có trình tự gen có mức độ tương đồng xếp từ cao xuống thấp Ta ưu tiên chọn báo với chủng khác có gen hồn thiện, ghi nhận công bố khoa học (comlete CDS) 2 Tìm trình tự mã hóa tính trạng tăng tổng hợp tinh bột giống Ba giống loài thực vật có gen tương đồng lựa chọn là: NCBI Loài 1: Oryza sativa Japonicamột giống lúa lùn có nguồn gốc vùng nhiệt đới cận nhiệt đới khu vực đông nam Á châu Phi cơng bố vào tháng 4/2002 Tìm trình tự mã hóa tính trạng tăng tổng hợp tinh bột giống Ba giống lồi thực vật có gen tương đồng lựa chọn là: NCBI Loài 2:Eleusine coracana, tên Việt Kê Chân Vịt, loài thực vật có hoa họ Thảo 2 Tìm trình tự mã hóa tính trạng tăng tổng hợp tinh bột giống Ba giống lồi thực vật có gen tương đồng lựa chọn là: NCBI Lồi3: Zea mays cultivar H14- giống ngơ H14 với lượng tinh bột tương đối cao so với giống ngô trắng 3 Xác định vùng bảo thủ chươ Clustal Omega Chương trình CLUSTAL OMEGA phần mềm phân tích kết thí nghiệm cấu trúc chuỗi DNA, RNA hay protein, phương pháp so sánh đồng thời chuỗi lựa chọn cung cấp cho chương trình, để tìm kiếm phát đặc điểm đồng nhất, đặc điểm gần gũi hay phân ly chúng Qua đó, chương trình xây dựng tiến hóa cung câp thơng tin liên quan để dự đốn đặc tính chuỗi phân tích Đường dẫn: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ Xác định vùng bảo thủ chương trình Clusta Omega Copy đoạn gen thuộc loài thực vật FASTA vào khung STEP 1, chọn điều kiện chạy RNA ấn Submit Thiết kế mồi nhờ chương trình Primer BLAST Chọn vùng bảo thủ đoạn có nhiều tương đồng ( lựa chọn khoảng từ 30-50 nucleotide) Gen làm khuôn ảo: Zea mays cultivar H14 Mã hiệu: JX462603.1 Chọn vùng bảo thủ: + Vùng bảo thủ đầu từ nucleotit 274- đến nucleotit 314 + Vùng bảo thủ cuối từ nucleotit 1500 đến nucleotit 1540 Thiết kế mồi nhờ chương trình Primer BLAST Sử dụng phần mềm PRIMER BLAST để thiết kế mồi Copy trình tự gen FASTA JX462603.1 vào khung, số vị trí nucleotide vùng bảo thủ chọn Điều chỉnh thông số PRIMER BLAST ( kích thước sản phẩm PCR, nhiệt độ, ) cho phù hợp hình bên: Đường dẫn: https://www.ncbi.nlm nih.gov/tools/primerblast/ Thiết kế mồi nhờ chương trình Primer BLAST Kết chạy PRIMER BLAST tạo 10 đoạn mồi khác hình sau: Tiến hành PCR so sánh với sở liệu nhờ chương trình BLAST Yêu cầu đoạn mồi: + Độ dài từ 18-24bp + Nhiệt độ bắt mồi hai mồi không chênh lệch độ C + Tỉ lệ GC: 40-60%, tối ưu 50-55% + Hạn chế khả tự liên kết mồi liên kết mồi với nhau: hạn chế đoạn lặp đoạn từ nucleotide trùng trở lên + Đặc hiệu gen cần khuếch đại, không đặc hiệu vùng khác gen sinh vật khác Thông thường cặp mồi tối ưu cặp mồi đầu phù hợp với yêu cầu đầu vào, cặp mồi sau hơn, xếp theo thứ tự chất lượng giảm dần Để kiểm tra xem cặp mồi có phù hợp khơng ta thực q trình PCR ảo Ta sử dụng phần mềm SMS PCR 5 Tiến hành PCR so sánh với sở liệu nhờ chương trình BLAST Ta copy trình tự gen FASTA JX462603.1 vào khung cho đoạn mồi xuôi mồi ngược sau: Sử dụng cặp mồi là: T7: 5’ GGCACTGGATCTCAGCT CTT 3’ T3: 5’ GCATTCTTCAAGATCAC CACGA 3’ Tiến hành PCR so sánh với sở liệu nhờ chương trình BLAST Ta kế PCR Tiến hành PCR so sánh với sở liệu nhờ chương trình BLAST Ta tiến hành BLAST sản phẩm PCR thu nhằm so sanh cấu trúc chuỗi DNA phân tích với chuỗi tương ứng lưu giữ ngân hàng giữ liệu, nhằm tìm kiếm chuỗi giống loài khác tương đồng với chuỗi phân tích dự đốn đặc tính sản phẩm dựa vào mối tương quan cấu trúc tính trạng 5 Tiến hành PCR so sánh với sở liệu nhờ chương trình BLAST Copy tồn sản phẩm PCR vào khung ấn BLAST Ta kết sau: Tiến hành PCR so sánh với sở liệu nhờ chương trình BLAST Kết cho thấy sản phẩm PCR có cấu trúc tương đồng với Zea mays shrunken 2, số hiệu NM_001127632.1 với mức độ tương đồng tới 99,12% Như dựa vào NM_001127632.1 để dự đốn tính chất lồi mà nghiên cứu 6 Tạo vector tách dòng gen - Sau tách dòng, gen Sh2-TD gắn với vector biểu pCambia1301 với promoter Ubi để tạo vector chuyển gen mang gen Sh2-TD - Toàn cấu trúc pCambia 1301-Ubi-Sh2 chuyển vào vi khuẩn E Coli DH5α A tumerfaciens cho mục đích chuyển gen vào ngô Thu hoạch kiến thức Nắm cách tra cứu kiến thức Công nghệ sinh học cổng thông tin Quốc tế Nắm quy trình tách dịng gen chưa biết trước cấu trúc gen Nắm quy trình chọn chủng, so sánh, PCR kiểm tra chức gen Biết cách làm khn ảo phù hợp lồi, chủng phải gần gũi, có tính trạng tương đồng với lồi mà nghiên cứu THANK YOU ... công vào ngô làm tăng hàm lượng tinh bột lên đáng kể so với đối chứng không chuyển gen Thực tách dòng gen shrunken- 2 tổng hợp tinh bột từ dịng ngơ h14 01 Tìm kiếm thơng tin gen Shrunken- 2 sở liệu... mays shrunken 2, số hiệu NM_001 127 6 32. 1 với mức độ tương đồng tới 99, 12% Như dựa vào NM_001 127 6 32. 1 để dự đốn tính chất lồi mà nghiên cứu 6 Tạo vector tách dòng gen - Sau tách dòng, gen Sh2-TD... Thảo 2 Tìm trình tự mã hóa tính trạng tăng tổng hợp tinh bột giống Ba giống lồi thực vật có gen tương đồng lựa chọn là: NCBI Loài3: Zea mays cultivar H14- giống ngô H14 với lượng tinh bột tương