BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH: THIẾT KẾ MỒI MỘT ĐOẠN GEN CHƯA BIẾT Nhóm sinh viên thực hiện: Cao Hoàng Minh Hiếu Đỗ Thị Quỳnh Mai Phùng Tuấn Minh MSSV 20174683 20174925 20174944 I - - II - TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Tính trạng quan tâm : ung thư máu Lý chọn tính trạng : Nhóm em cảm thấy hứng thú tìm hiểu bệnh bệnh ung thư mà không tạo khối u Ung thư máu hay gọi bệnh máu trắng, loại ung thư ác tính, xuất thể bắt đầu có tượng bạch cầu gia tăng đột biến Bạch cầu vốn đảm nhiệm nhiệm vụ bảo vệ thể nên tăng số lượng cách đột biến vậy, bị thiếu thức ăn nguồn cấp dinh dưỡng, bạch cầu sau thường ăn hồng cầu - thành phần quan trọng máu Gene định tính trạng : FLT3 Q trình tìm hiểu gene quy định tính trạng: vào www.google.com.vn, tra tính trạng ung thư máu người tìm gene quy định FLT3 QUÁ TRÌNH TÌM VÙNG BẢO THỦ CỦA GENE Vào trang https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, gõ tìm gene “FLT3” mục Nucleotide, tìm người chứa vùng gene Trình tự nucleotide FASTA liệu là: >MT001898.1 Homo sapiens isolate AML_33F/40F/47F FLT3 (FLT3) gene, partial cds CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGTACAGGTGACCGGCTCCTCAGAATAATGAGTACTTCTAC GTTGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTG >MT001897.1 Homo sapiens isolate AML_34F FLT3 (FLT3) gene, partial cds CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGACAGGTGACCGGCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTACGT TGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGAAT GGAATGTGCCAAATGTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACCAT TTGTCTTTGCAGGGAAGGTACTAGGATCAGGTGCTTTTGGAAAAGTGATGAACGCAACAGCTTATGGAAT TAGCAAAACAGGAGTCTCAATCCAGGTTGCCGTCAAAATGCTGAAAG >MT001896.1 Homo sapiens isolate AML_21F FLT3 (FLT3) gene, partial cds CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGTACAGGTGGACCGGCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTAC GTTGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGA ATGGAATGTGCCAAATGTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACC ATTTGTCTTTGCAGGGAAGGTACTAGGATCAGGTGCTTTTGGAAAAGTGATGAACGCAACAGCTTATGGA ATTAGCAAAACAGGAGTCTCAATCCAGGTTGCCGTCAAAATGCTGAAAG - Vào trang http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl, copy vùng gene mà chọn vào để chương trình chạy, tìm Nu tương đồng vùng gene, sau chọn vùng bảo thủ vùng có khoảng 18 – 24 bp dài hơn: “TAATG AGTACTTCTA CGTTGATTTC AGAGAATATG AATATGATCT CAAATGGGAG TTTCCAAGAG AAAATTTAGA” III - YÊU CẦU ĐỐI VỚI CẶP MỒI DÙNG TRONG PHẢN ỨNG PCR Vào trang: http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl copy gen để chương trình chạy , copy tất phần consensus cho vào link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ điền vào  Forward primer from 56 to 135  Reverse primer from 192 to 327  PCR produce size 70 max 1000  Primer melting temperatures ( TM ) 57,0 opt 60,0 max 63,0 max Tm difference  Cho chạy chương trình tìm đoạn mồi đáp ứng đủ yêu cầu sau:  Độ dài từ 18 – 24 bp  Nhiệt độ bắt mồi mồi 4oC (thỏa mãn không chênh lệch 5oC)  Tỉ lệ GC 40 -60 %  nu cuối đầu 3’ có GC Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus primer 24 95 118 59.65 41.67 4.00 2.00 Reverse CCCTGCAAAGACAAATGGTGA primer 19 224 204 59.04 47.62 4.00 1.00 Minus Product 130 length Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus primer 24 95 118 59.65 41.67 4.00 2.00 Reverse TCCCTGCAAAGACAAATGGTG primer 21 225 205 59.04 47.62 4.00 1.00 Product 131 length Minus Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus primer 24 95 Reverse CCTTCCCTGCAAAGACAAATGG primer 22 228 207 60.03 50 Minus 118 59.65 41.67 4.00 4.00 2.00 1.00 Product 134 length Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus primer 24 95 118 59.65 41.67 4.00 2.00 Reverse CCCTGCAAAGACAAATGGTGAG primer 22 224 203 60.03 50.00 4.00 0.00 Minus Product 130 length Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward CTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus primer 23 96 118 58.34 43.48 4.00 2.00 Reverse CCCTGCAAAGACAAATGGTGA primer 21 224 204 59.04 47.62 4.00 1.00 Product 129 length Minus Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward CTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus primer 23 96 118 58.34 43.48 4.00 2.00 Reverse TCCCTGCAAAGACAAATGGTG primer 21 225 205 59.04 47.62 4.00 1.00 Minus Product 130 length Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAG Plus primer 23 95 117 58.34 43.48 4.00 0.00 Reverse CCCTGCAAAGACAAATGGTGA primer 21 224 204 59.04 47.62 4.00 1.00 Minus Product 130 length Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAG Plus primer 23 95 117 58.34 43.48 4.00 0.00 Reverse TCCCTGCAAAGACAAATGGTG primer 21 225 205 59.04 47.62 4.00 1.00 Product 131 length Minus Primer pair Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward CTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGA Plus primer 23 96 118 58.34 43.48 4.00 2.00 Reverse CCTTCCCTGCAAAGACAAATGG primer 22 228 207 60.03 50.00 4.00 1.00 Minus Product 133 length Primer pair 10 Sequence (5'->3') Template Self Self 3' Length Start Stop Tm GC% strand complementarity complementarity Forward TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAG Plus primer 23 95 117 58.34 43.48 4.00 0.00 Reverse CCTTCCCTGCAAAGACAAATGG Minus primer 22 228 207 60.03 50.00 4.00 1.00 Product 134 length Chọn đoạn mồi số 1, vào trang https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.html để tiến hành chạy PCR: Kết chạy PCR: >130 bp product from linear template MT001897.1 Homo sapiens isolate AML_34F FLT3 (FLT3) gene, partial cds, base 95 to base 224 (T7 - T3) TCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGAATGGAATGTGCCAAAT GTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACCATTTGT CTTTGCAGGG IV THÔNG TIN VỀ PROTEIN Trình tự protein mà gene tách dịng mã hóa Vào trang expasy.org, tìm https://web.expasy.org/translate/, copy phần chạy PCR test cho chạy chương trình, ta được: 5'3' Frame SQMGVSKRKFRVW-EWNVPNVSAAFLFHWKIFKMHVLTICLCR 5'3' Frame LKWEFPRENLEFGKNGMCQMFLQHFFSIGKSLKCTYSPFVFAG 5'3' Frame SNGSFQEKI-SLVRMECAKCFCSISFPLENL-NARTHHLSLQ 3'5' Frame PCKDKW-VRAF-RFSNGKEMLQKHLAHSILTKL-IFSWKLPFE 3'5' Frame PAKTNGEYVHFKDFPMEKKCCRNIWHIPFLPNSKFSLGNSHLR 3'5' Frame LQRQMVSTCILKIFQWKRNAAETFGTFHSYQTLNFLLETPI2 Khối lượng phân tử, điểm đẳng điện Mở https://web.expasy.org/, vào phần proteomics, vào phần Compute pI/MW , copy phần 5'3' Frame SQMGVSKRKFRVW-EWNVPNVSAAFLFHWKIFKMHVLTICLCR Vào cho chạy chương trình, ta kết quả: - Điểm đẳng điện: 10.45 Khối lượng phân tử: 5729.90 Vị trí protein tế bào Vào trang https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Chọn “ Nucleotide BLAST” Copy kết PCR test cho chạy chương trình: Ra kết quả: Ta thấy có lồi có mức độ tương đồng 100% với FLT3, ta chọn MT001896.1, click vào, chọn FASTA, ta có trình tự protein: Homo sapiens isolate AML_21F FLT3 (FLT3) gene, partial cds GenBank: MT001896.1 GenPept Identical Proteins Graphics >MT001896.1 Homo sapiens isolate AML_21F FLT3 (FLT3) gene, partial cds CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGTACAGGTGGACCGGCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTAC GTTGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGA ATGGAATGTGCCAAATGTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACC ATTTGTCTTTGCAGGGAAGGTACTAGGATCAGGTGCTTTTGGAAAAGTGATGAACGCAACAGCTTATGGA ATTAGCAAAACAGGAGTCTCAATCCAGGTTGCCGTCAAAATGCTGAAAG - Vào http://phobius.sbc.su.se/, copy trình protein vào chạy chương trình, ta kết quả: Nhận xét: - Từ ảnh, ta thấy đường màu xanh dương biểu diễn nằm tế bào chất, đường xanh câu biểu diễn nằm tế bào chất, đường màu xám biểu diễn xuyên màng - Ta thấy, tỉ lệ aa nằm tế bào chất chiếm khoảng 87%, tỉ lệ aa nằm tế bào chất khoảng 17%, tỉ lệ aa xuyên màng k có => Có thể kết luận protein xét nằm ngồi Tế bào chất Dự đoán chức protein - Vào https://www.expasy.org/, chọn proteomics, chọn protein modifications, chọn UniProtKB/Swiss-Prot, vào BLAST, copy trình tự protein >MT001896.1 Homo sapiens isolate AML_21F FLT3 (FLT3) gene, partial cds CAATTTAGGTATGAAAGCCAGCTACAGATGGTACAGGTGGACCGGCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTAC GTTGATTTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATGGGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGGTAAGA ATGGAATGTGCCAAATGTTTCTGCAGCATTTCTTTTCCATTGGAAAATCTTTAAAATGCACGTACTCACC ATTTGTCTTTGCAGGGAAGGTACTAGGATCAGGTGCTTTTGGAAAAGTGATGAACGCAACAGCTTATGGA ATTAGCAAAACAGGAGTCTCAATCCAGGTTGCCGTCAAAATGCTGAAAG - Vào chạy chương trình, cho kết quả: - Ta chọn protein có tỉ lệ cao 95.8% thu phần dự đoán chức năng: CẤU TRÚC 3D CỦA ĐOẠN PROTEIN V - Vào trang https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastx&PAST_TYPE=Ba stSearch&BLAST_SPEC=&LINK_LOC=blasttad&LAST_PAGE=tblastn copy đoạn protein vào mục: “ Enter accession number(s), gi(s), or FASTA sequence(s)” - Chọn dạng Database Protein Data Bank protein(pdb) => ấn BLAST - Kết quả:  Chọn kết có tương đồng cao => Ấn vào đường link mục Accession -  Vào mục Protein 3D Structure Hoặc vào trang: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ => chọn hộp thư Structure => Copy mã 1RJB vào chạy Kết quả:  Ấn Dowload máy => Sử dụng phần mềm Cn3D 4.3.1 => mở file vừa tải để xem cấu trúc 3D  Vào mục Style => Coloring Shortcuts: Chọn màu để thể cấu trúc 3D  Ngoài ra, vùng khác xác định trang cấu trúc 3D download cấu trúc  Hoặc ấn vào full-featured 3D viewer  Sử dụng công cụ phần mềm Cn3D: - Xác định tính trạng, cấu trúc  Chuỗi α β: Style => Coloring Shortcuts => Secondary Structure  Vùng: Style => Coloring Shortcuts => Domain  Vùng kỵ nước: Style => Coloring Shortcuts => Hydrophobicity  Các phân tử: Style => Coloring Shortcuts => Molecule  Vùng bảo thủ: Style => Coloring Shortcuts => Sequence Conservation  Nhiệt độ: Style => Coloring Shortcuts => Temperature VI - NHẬN XÉT Sản phẩm sau thu có khả biểu tính trang ta thấy có nhiều gene có độ tương đồng từ 90 – 100% Kết ta thu mang tính chất tham khảo nên muốn có kết xác ta cần nghiên cứu kết hợp với thực tế để thu mẫu thử xem biểu tính trạng mà cần hay không ... trọng máu Gene định tính trạng : FLT3 Q trình tìm hiểu gene quy định tính trạng: vào www.google.com.vn, tra tính trạng ung thư máu người tìm gene quy định FLT3 QUÁ TRÌNH TÌM VÙNG BẢO THỦ CỦA GENE... 60,0 max 63,0 max Tm difference  Cho chạy chương trình tìm đoạn mồi đáp ứng đủ yêu cầu sau:  Độ dài từ 18 – 24 bp  Nhiệt độ bắt mồi mồi 4oC (thỏa mãn không chênh lệch 5oC)  Tỉ lệ GC 40 -60... thu có khả biểu tính trang ta thấy có nhiều gene có độ tương đồng từ 90 – 100% Kết ta thu mang tính chất tham khảo nên muốn có kết xác ta cần nghiên cứu kết hợp với thực tế để thu mẫu thử xem biểu