BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC ĐỀ TÀI: TÁCH DÒNG GEN DEFENSIN THỰC VẬT VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DỊNG NGƠ CHUYỂN GEN KHÁNG MỌT  • Cây ngô (Zea mays L.) ngũ cốc có giá trị kinh tế cao, góp phần nuôi sống 1/3 dân số giới Trên giới, ngơ đứng thứ ba diện tích, đứng thứ hai sản lượng đứng đầu suất Đặt vấn đề (Lí chọn đề tài) • Là ngũ cốc giầu tình bột, hạt ngơ đối tượng dễ bị mọt xâm hại Mọt ngô (Sitophilus zeamais Motsch) loại đa thực, ăn hầu hết loại ngũ cốc, loại đậu, hạt có dầu nhiều sản phẩm thực vật khác Thức ăn thích hợp với mọt hạt ngơ gạo • Các mẫu ngơ lai trồng Việt Nam cho suất cao sản lượng, giá thành, chất lượng bị giảm đáng kể hạt mẫu ngô dễ bị mọt xâm hại  Nghiên cứu ứng dụng công nghệ tạo giống ngô kháng mọt nhiều nhà khoa học quan tâm • Là protein đa chức nhỏ bao gồm 45-54 amino acid, giàu cysteine,  ức chế sinh trưởng nấm, chống vi khuẩn, làm thay đổi kênh màng, ức chế hoạt động trypsin, α-amylase Gen Defensi n thực vật • Defensin thực vật có 18 nhóm, nhóm bao gồm defensin có khả ức chế enzyme α-amylase trypsin • Trong ruột mọt ăn ngơ, defensin liên kết với trung tâm hoạt động α-amylase ruột mọt, dẫn đến ức chế q trình tiêu hóa tinh bột của mọt Thiết kế vector chuyển gen mang gen defensin1 phục vụ việc phát triển mẫu ngô chuyển gen có khả kháng mọt cao Xác định gene cần tách: - Xác định tính trạng quan tâm - Xác định gen quy định tính trạng báo cáo khoa học - Tìm kiếm số gen mã hóa protein quan tâm ngân hàng liệu Các bước tiến hành 2.Thiết kế mồi: - Align trình tự mã hóa protein Clustal Omega - Xác định vùng bảo thủ (mồi thiết kế nằm vùng bảo thủ này) - Thiết kế mồi: sử dụng chương trình như: Primer Blast, Primer3Plus, Primer3 3.Kiểm tra mồi: Sử dụng PCR ảo SMS Xem xét đoạn kết sau chạy SMS xem có tương đương (kích thước, ) với đoạn mà định nhân lên không, cho vào Blast của NCBI để xem có gen mã hóa tính trạng cần nghiên cứu khơng 4.Phân tích cấu trúc 3D, dự đốn sản phẩm tách dòng biểu protein 5.Xây dựng phương án tách dòng gen Truy cập sở liệu NCBI  theo link https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, nhập từ khóa "Defensin Zea may" 1.Xác định gen cần tách Lựa chọn (ít nhất) trình tự gen defensin thực vật quan tâm ngô 1.Xác định gen cần tách 1.Xác định gen cần tách Nhấn vào FASTA, thu trình tự nucleotit đoạn gen lựa chọn, sao chép vào file word dạng FASTA Nhấn vào ''GenBank" để đọc, tìm hiểu thơng tin đối tượng cần nghiên cứu ngày công bố, nơi thực hiện, nguồn gốc, tác giả, dựa báo; vào để chọn đoạn gen làm khn 1.Xác định gen cần tách Truy cập phần mềm Clustal Omega theo link:  https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ để so sánh độ tương đồng gen chọn tìm vùng bảo thủ để thiết kế mồi Giao diện Clustal Omega: 1.Xác định  gen cần tách Đưa trình tự nu vừa thu từ NCBI vào bên dưới, thiết lập thông số mong muốn nhấn vào ô "Submit" để kết 1.Xác định  gen cần tách Sau chạy chương trình, thu cặp mồi: 2.Thiết kế mồi Dựa vào tiêu chí chọn mồi, chọn cặp mồi số 1  -Forward primer: TCCTCGTCCTCATGCTCCTC -Reverse primer:  CGGTCTGGCACACGTTGG Truy cập phần mềm PCR Test theo link: https://www.bioinformatics.org/sms2/pcr_products.htmlfbclid=I wAR3EKOp97MhS3l0DisH_XyQNg8GZWJp-UIDT6efgShXRd83wTwT7p3zjJ0k   để thực PCR đoạn gen của HG792392.1 với cặp mồi số vừa chọn Gen HG7 923 92.1 3.Kiểm tra mồi uôi Mồi x Mồi n gược Nhấn Submit để kết Kết sau chạy PCR ảo Nhận xét: đoạn kết có kích thước gần tương đương với đoạn gen định nhân lên =>Đoạn bảo thủ chọn tương đối phù hợp 3.Kiểm tra mồi Đối chiếu lên Blast: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Chọn Nucleotide => Protein 3.Kiểm tra  mồi 3.Kiểm tra mồi Thu kết quả: 3.Kiểm tra  mồi *Lựa chọn protein tương đồng cao với mục tiêu: CEJ09690.1  FASTA: > CEJ09690.1 D efensin protein [Zea m ays] M APSRRM A APVLVLM LLPVATELG TTKVAEARH CLSQ SH RFKG LCM SSN N C AN VCQ TEN FG G ECKAEG ATRKCFCKKIC\ *Chọn vào mục Accession để xem số thông tin protein Phân tích cấu trúc 3D, dự đốn sản phẩm tách dịng biểu protein Truy cập link: https://www.uniprot.org/uniref/ để dự đoán chức protein =>Vào mục Blast, nhập vào trình tự PCR ảo Chọn protein có độ tương đồng cao vào mục Funtion: Phân tích  cấu trúc 3D, dự đốn sản phẩm tách dịng và biểu protein Truy cập link: http://phobius.sbc.su.se/index.html để tìm vị trí  => Nhập vào trình tự protein thu kết quả: Phân tích  cấu trúc 3D, dự đốn sản phẩm tách dị ng và biểu hiện protein Truy cập trang Blast protein NCBI để tìm cấu trúc khơng gian chiều 4.Phân tích cấu trúc 3D, dự đốn sản phẩm tách dịn g và biểu hiện protein Ta thấy region name protein "Gamma-thionin" Tra Structure với từ khóa ''Gamma-thionin" 4.Phân tích  cấu trúc 3D, dự đốn sản phẩm tách dịng biểu protein Vật liệu: 5.Xây dựng  phương án  tách dịng g en • Mẫu ngô địa phương thu thập tỉnh Sơn La mẫu ngô lai LVN99 Trung tâm mẫu trồng Sơn La cung cấp • Các chủng vi khuẩn E coli DH5α; A tumefaciens CV58 loại vector pBT, p201-SLHEP, pBetaPhaso-dest sử dụng trình nhân dòng, thiết kế vector chuyển gen chuyển vào thực vật    Phương pháp nghiên cứu • Tách chiết RNA tổng số; tổng hợp cDNA 5.Xây dựng  phương án  tách dòng g en • Gen defensin1 phân lập từ ngô (ZmDEF1) khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu ZmDEF-F/ZmDEF-R (ZmDEF-F: 5’- ACGCG TCGACATGGCGCCGTCTCGACGCA0 -3’ ZmDEF-R: 5’CCCAAGCTTGCAGATCTTCTTGCAGA AGCAC -3’) chu kỳ nhiệt 94oC/4 phút, 30 chu kỳ 94o C/45 giây – 58o C/30 giây – 72o C/60 giây) 72o C/10 phút •  Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 0,8%, tinh theo GeneJET PCR Purification KIT, gắn vào vector tách dịng pBT • Vector tách dịng biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α sốc nhiệt (42o C phút 30 giây) E coli DH5α mang vector tách dòng chọn lọc môi trường LB đặc bổ sung Xgal, IPTG, kháng sinh carbenicilin Xác định khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu Plasmid tái tổ hợp thu nhận cách tách chiết theo phương pháp tách dòng phân tử Sambrook Russell (2001)  Phương pháp nghiên cứu 5.Xây dựng  phương án  tách dòng g en Vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 thiết kế cách gắn gen ZmDEF1 vào khung vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso theo chế trao đổi chéo đặc hiệu vị trí phage λ mô tả Karimi đồng tác giả (2002) Thank for watching ... ruột mọt, dẫn đến ức chế trình tiêu hóa tinh bột của? ?mọt Thiết kế vector chuyển gen mang gen defensin1 phục vụ việc phát triển mẫu ngô chuyển gen có khả kháng mọt cao 1 Xác định gene cần tách: ... pháp nghiên cứu 5.Xây dựng  phương án  tách? ?dòng? ?g en Vector chuyển gen pBetaPhaso-ZmDEF1 thiết kế cách gắn gen ZmDEF1 vào khung vector chuyển gen thực vật pBetaPhaso theo chế trao đổi chéo đặc... trình nhân dịng, thiết kế vector chuyển gen chuyển vào thực vật    Phương pháp nghiên cứu • Tách chiết RNA tổng số; tổng hợp cDNA 5.Xây dựng  phương án  tách? ?dịng g en • Gen defensin1 phân lập