ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Lê Thị Huyền NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội, tháng 12 năm 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Lê Thị Huyền NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Mã số: 8420101.4 Chuyên ngành: sinh học thực nghiệm Cán hƣớng dẫn: TS Nguyễn Xuân Hƣng PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến Đại học Quốc gia Hà Nội tài trợ kinh phí cho đề tài với mã số QG.18.09 để đề tài thực tiến hành tiến độ Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Xuân Hưng PGS TS Hoàng Th Mỹ Nhung người hướng dẫn trực tiếp giúp nhiều q trình hồn thành nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn hai người hướng dẫn tận tình giúp đỡ tơi đ nh hướng nghiên cứu, giải đáp thắc mắc, khó khăn đồng thời dạy tơi học q giá Nếu khơng có hướng dẫn giúp đỡ này, luận văn tơi khơng hồn thành cách trọn vẹn Tôi xin trân trọng cảm ơn GS.TS BS Nguyễn Thanh Liêm - Viện trưởng Viện nghiên cứu Tế bào gốc Công nghệ gen Vinmec, ThS Bùi Việt Anh – Trưởng nhóm Liệu pháp miễn d ch - Trung tâm công nghệ cao - Bệnh viện Đa khoa quốc tế Vinmec tạo điều kiện cho tơi có hội thực tập phịng thí nghiệm đại bậc Việt Nam tiếp cận với kỹ thuật, trang thiết b tiên tiến Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến ThS Trần Th Tuyết Trinh, ThS Chu Th Thảo, TS Thân Th Trang Uyên, ThS Nguyễn Văn Phịng ThS Nguyễn Đắc Tú, CN Hồng Hương Diễm, CN Trần Trung Nghĩa CN Bùi Th Hồng Huế CN Đỗ Th Hoài Thu, CN Phạm Th Cường cán Viện nghiên cứu Tế bào gốc Cơng nghệ gen Vinmec hỗ trợ nhiệt tình cho tơi q trình hồn thành luận văn tốt nghiệp Bên cạnh tơi gửi lời cảm ơn tới ThS Bùi Th Vân Khánh bạn, anh, ch phịng thí nghiệm Ung thư thực nghiệm – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học quốc gia Hà Nội giúp đỡ khuyến khích suốt thời gian làm việc Ngồi ra, tơi xin cảm ơn trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội nơi cho không kiến thức Sinh học mà cịn có tầm nhìn nhận thức Khoa học sống thầy cô môn Sinh học Tế bào, người kiên nhẫn dạy cho kiến thức truyền đạt cho tơi kinh nghiệm, giúp tơi trở thành nhà khoa học thực Cuối cùng, gửi lời biết ơn chân thành tới gia đình bạn bè thân yêu tin tưởng, cho nguồn động lực dồi thúc đẩy vượt qua khó, thử thách Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Lê Th Huyền DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ đầy đủ Từ Tiếng Việt BSA Bovine serum albumin Albumin từ huyết bê BCA Bicinchoninic acid Axit bicinchoninic CBMC Cord blood mononuclear cell Tế bào đơn nhân máu cuống rốn CD Cluster of differeniation Cụm biệt hóa CFSE Carboxyfluorescein succinimidyl ester Thuốc nhuộm huỳnh quang CTL Cytotoxic T lymphocyte Tế bào T gây độc DC Dendritic cell Tế bào tua Dex Dexosome Exosome tiết từ tế bào tua Endosomal sorting complex Phức hệ vận chuyển required for transport yêu cầu Food and Drug Administration Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ Granulocyte-macrophage colony- Yếu tố kích thích tạo cụm stimulating factor dòng hạt-mono iDC Immature dendritic cell Tế bào tua chưa trưởng thành ILVs Intraluminal vesicels IL Interleukin Interleukin mDC Mature dendritic cell Tế bào tua trưởng thành MDSCs Myeloid-derived suppressor cells Tế bào ức chế có nguồn gốc tủy xương moDC Monocyte-derived Dendritic cell Tế bào tua có nguồn gốc từ tế bào mono Major Histocompatibility Phức hệ phù hợp tổ chức Complex Mononuclear cell Tế bào đơn nhân ESCRT FDA GM-CSF MHC MNC Các chồi mọc phía bên Endosome MVBs Multivesicular bodies Thể đa bào NK Natural killer Tế bào giết tự nhiên NSCLC Non small cell lung cancer OD Optical density Mật độ quang PS Performance status Thể trạng bệnh nhân SCLC Small cell lung cancer Ung thư phổi tế bào nhỏ TAP Transporter associated with antigen processing Bộ máy vận chuyển kháng nguyên đặc hiệu Th T helps Tế bào T bổ trợ TNF - α Tumor necrosis factor alpha Yếu tố hoại tử khối u alpha Treg Regulatory T cells Tế bào T điều hòa 7AAD 7-amino-actinomycin D Thuốc nhuộm huỳnh quang 7ADD Ung thư phổi không tế bào nhỏ MỤC LỤC Chƣơng - TỔNG QUAN .3 1.1 Thực trạng ung thƣ phổi 1.1.1 Thực trạng ung thư phổi 1.1.2 Đáp ứng miễn d ch ung thư phổi 1.1.3 Các phương pháp điều tr ung thư phổi a) Điều tr đích b) Liệu pháp miễn d ch 1.2 Tế bào tua 1.2.1 Đ nh nghĩa tế bào tua 1.2.2 Con đường trình diện kháng nguyên tế bào tua 11 1.2.3 Cơ chế biệt hóa tế bào tua in vitro 12 1.3 Exosome 14 1.3.1 Đ nh nghĩa Exosome 14 1.3.2 Cơ chế hình thành Exosome 15 a) Cơ chế hình thành Exosome phụ thuộc ESCRT 16 b) Cơ chế hình thành Exosome khơng phụ thuộc ESCRT 17 1.3.3 Chức trình diện kháng ngun Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua 18 a) Khả trình diện kháng ngun lớp MHC-I Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua 18 b) Khả trình diện kháng nguyên lớp MHC-II Exosome có nguồn gốc từ tế bào tua 19 1.4 Ứng dụng tế bào tua Exosome điều trị ung thƣ 21 1.4.1 Ứng dụng tế bào tua điều tr ung thư Việt Nam 21 1.4.2 Ứng dụng Exosome điều tr ung thư 22 1.5 Máu cuống rốn trữ đông – nguồn cung cấp tế bào mono 24 Chƣơng - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .26 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 26 2.2 Hóa chất thiết bị 28 2.2.1 Hóa chất 28 2.2.2 Thiết b 29 2.2.3 Dụng cụ vật tư tiêu hao 30 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 31 2.3.1 Ni cấy dịng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 31 2.3.2 Tách chiết xác đ nh nồng độ protein tổng số từ dòng tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 31 2.3.3 Rã đông máu cuống rốn trữ đông 33 2.3.4 Phân lập tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn trữ đông 33 2.3.5 Ni cấy, biệt hóa trưởng thành tế bào đơn nhân thành tế bào tua 34 2.3.6 Thu hoạch tế bào tua DC môi trường nuôi cấy tế bào tua DC 35 a) Thu hoạch môi trường nuôi cấy tế bào tua DC 35 b) Thu hoạch tế bào tua 35 2.3.7 Thu nhận Exosome từ môi trường nuôi cấy tế bào tua máu cuống rốn trữ đông 36 2.3.8 Phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi 36 a) Phân lập tế bào đơn nhân máu ngoại vi 36 b) Phân lập tế bào Lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi 37 2.3.9 Đánh giá ảnh hưởng tế bào tua Exsome lên sinh trưởng tế bào lympho T 38 2.3.10 Đánh giá khả gây độc tế bào ung thư biểu mô phế nang phổi A549 tế bào lympho T cảm ứng 40 2.3.11 Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy 41 2.3.12 Phương pháp xử lý số liệu 42 Chƣơng - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 3.1 Kết thu nhận protein tổng số từ dòng tế bào ung thƣ A549 43 3.2 Rã đông máu cuống rốn trữ đông 44 3.3 Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông 44 3.4 Kết biệt hóa tế bào mono thành tế bào DC 47 3.4.1 Hình thái tế bào 47 3.4.2 Các dấu ấn bề mặt tế bào 49 3.5 Kết phân lập tế bào lympho T từ tế bào đơn nhân máu ngoại vi 52 3.6 Kết đánh giá ảnh hƣởng tế bào tua Exsome lên sinh trƣởng tế bào lympho T 53 3.7 Kết đánh giá khả gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi A549 tế bào lympho T cảm ứng 56 Chƣơng - KẾT LUẬN .59 Chƣơng - KIẾN NGHỊ .60 Chƣơng – TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cơ chế ung thư phổi thoát khỏi giám sát miễn d ch [29] Hình 1.2: Vai trị PD1 CTLA-4 đáp ứng miễn d ch kháng khối u Hình 1.3: Các phương pháp điều tr ung thư phổi .8 Hình 1.4: Sự hình thành quần thể tế bào tua [69] 10 Hình 1.5: Con đường trình diện kháng nguyên tế bào tua 12 Hình 1.6 : GM-CFS điều hịa phát triển DC qua tín hiệu phân từ khác [86] 13 Hình 1.7: Qúa trình giải phóng Exosome từ thể đa bào MVEs [24] .15 Hình 1.8: Cơ chế hình thành Exosome theo đường phụ thuộc ESCRT [30] 17 Hình 1.9: Con đường trình diện kháng nguyên Exosome từ tế bào tua [47] 21 Hình 2.1: Mẫu máu cuống rốn trữ đông Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec 26 Hình 2.2: Bản tự nguyện chấp thuận tham gia hiến tặng mẫu sinh học Bệnh viện Đa khoa Quốc tế Vinmec 27 Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm 31 Hình 2.4: Máu cuống rỗn trữ đông chia làm phần sau ly tâm với Ficoll 34 Hình 2.4: Máu ngoại chia làm phần sau ly tâm với Ficoll 37 Hình 3.1: Tế bào buồng đếm hồng cầu nhuộm với thuốc nhuộm Turck 45 Hình 3.2: Tế bào đơn nhân trước sau loa bỏ tế bào trôi sau nuôi cấy 46 Hình 3.3: Quần thể tế bào trước sau phân lập tế bào mono 47 Hình 3.4: Hình thái tế bào mono biệt hóa thành tế bào DC 49 Hình 3.5: Phân tích theo phương pháp dịng chảy tế bào dấu ấn bề mặt tế bào vào ngày D1, D6 D7 50 Hình 3.6: Tỷ lệ trung bình dấu ấn bề mặt .52 bào Lympho T) CD4 CD8 dùng để xác đ nh độ tinh quần thể tế bào T gây độc (CTLs) T bổ trợ (Th) tổng số tế bào thu (Hình 3.7) - Theo kết phân tích từ nghiên cứu, quần thể tế bào lympho T có độ tinh cao với tỷ lệ CD3 chiếm 98,7 ± 0,5% Hình 3.7 Phân tích quần thể tế bào lympho T phƣơng pháp tế bào theo dòng chảy Phân tích tế bào đơn dựa hai số FSA FSH Tỷ lệ tế bào sống sau xác đ nh tế bào dương tính với 7-AAD quần thể tế bào Lympho Các tế bào T CD4+ CD8+ phân biệt với quần thể tế bào T CD3+ Các số hiển th hình ảnh tỷ lệ phần trăm quần thể tế bào 3.6 Kết đánh giá ảnh hƣởng tế bào tua Exsome lên sinh trƣởng tế bào lympho T - Để xác đ nh khả kích thích tăng sinh tế bào lympho T Exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC DCno, tế bào lympho T máu ngoại vi người khỏe mạnh nhuộm với thuốc nhuộm Carboxyfluorescein succinimidyl ester CFSE sau đồng ni cấy với Exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC, 53 DCno máu cuống rốn trữ đông CFSE thuốc nhuộm có tính xun màng, khơng màu khơng phát huỳnh quang nhóm acetate loại bỏ esterases nội bào tế bào sống Khi b phân cắt, CFSE liên kết cộng hóa tr với nhóm amin có tế bào thơng qua nhóm succinimidyl ester phát tín hiệu huỳnh quang bước sóng kích thích 490nm CFSE tồn tế bào sống giảm nửa tín hiệu huỳnh quang thể hệ phân bào Hình 3.8: Sự tăng sinh tế bào lympho T CD3+ nhuộm CSFE Tế bào Lympho T phân chia hai lần thời gian đồng nuôi cấy ngày với DC cảm ứng kháng nguyên A549 phân chia lần với DC không cảm ứng với kháng nguyên (DCno) Exosome phân lập từ DC (Exo) Các tế bào Lympho T không đồng nuôi cấy với DC/Exosome tế bào Lympho T ủ với Exosome phân lập từ môi trường nuôi cấy DC không cảm ứng với kháng nguyên A549 (Exono) không phân chia (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC, T cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exono T cell: tế bào Lympho T nuôi cấy độc lập) - Các phản ứng tăng sinh tế bào lympho T xác đ nh cách đo mật độ tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence intensity FI) CFSE Kết nghiên cứu cho thấy (Hình 3.8) tế bào lympho T đồng nuôi cấy với DC cảm ứng với protein A549 (T cell_DC) có tỷ lệ tăng sinh cao nhất, với phân chia lớn gấp hai lần ngày nuôi cấy so sánh với tế bào lympho T ủ với DC không cảm ứng với protein A549 (Tcell_DCno) Các tế bào lympho T đồng nuôi cấy với Exosome phân lập từ DC (Tcell_Exo) có số lượng tế bào tăng sinh gấp lần 54 Tuy nhiên, không ghi nhận thấy phân chia quan sát tế bào Lympho T nuôi cấy độc lập (Tcell), tế bào Lympho T khơng có khả tăng sinh in vitro khơng có kích thích - Kết tăng sinh tế bào lympho T đồng lồi hai trường hợp đồng ni cấy tế bào Lympho T với DC DCno tương tự báo cáo trước [25] Qing Ge cộng chứng minh tế bào lympho T tăng sinh mạnh tỷ lệ đồng nuôi cấy với DC 2,5: 5:1 Hơn Nowruz el chứng minh DC kích thích tế bào Lympho T đồng lồi khả trình diện kháng nguyên chúng, phù hợp với đặc tính DC trình tiết cytokine đáp ứng miễn d ch [9] Sự tăng sinh gấp lần nhóm tế bào Lympho T đồng ni cấy với DC kích thích kháng nguyên A549 (Tcell_DC) so với nhóm lympho T đồng ni cấy với DC khơng cảm ứng với kháng nguyên A549 (Tcell_DCno) khả trình diện kháng nguyên DC tốt cảm ứng với tác nhân lạ Kết tương tự nghiên cứu cứu Miwa đồng nghiệp [67] - Từ kết tăng sinh gần lần tế bào lympho T đồng nuôi cấy với Exo tiết từ tế bào DC có cảm ứng kháng nguyên (Tcell_Exo) so với tế bào lympho T đồng nuôi cấy với Exo tiết từ tế bào DC không cảm ứng kháng nguyên tế bào Lympho T ni cấy độc lập, có khả Exosome biểu kháng nguyên A549 lên bề mặt kích thích tăng sinh tế bào lympho T trình diện kháng ngun đó, bao gồm tế bào tế bào lympho T CD4+ CD8+ Kết cuả đồng quan điểm với Charlotte Admyre cộng chứng minh tăng sinh tế bào CD8+ kích thích với Exosom tiết từ DC có nguồn gốc từ tế bào mono kích thích tế bào CD4+ tốt Exosome tiết từ tế bào DC trưởng thành DC chưa trưởng thành [1] - Trong nghiên cứu này, DC Exosome tiết từ DC cho thấy khả kích thích tăng sinh tế bào Lympho T, nhiên số lượng Exosome thu đến từ nhiều loại tế bào khác tồn d ch ni cấy tế bào Vì vậy, cần xác đ nh rõ tỷ lệ 55 Exosome có khả trình diện kháng nguyên hỗn hợp thu để xác đ nh cơng suất, tính hiệu kích thích tăng sinh tế bào Lympho T so với DC 3.7 Kết đánh giá khả gây độc tế bào ung thƣ biểu mô phế nang phổi A549 tế bào lympho T cảm ứng Khả gây độc tế bào tế bào Lympho T đánh giá dựa kháng lại - tế bào A549 nhuộm với thuốc nhuộm Calcein - acetoxymethyl ester (Calcein-AM) Khi qua màng tế bào, nhóm acetoxymethyl ester thuốc nhuộm b thủy phân esterases nội bào, kích thích thuốc nhuộm phát hình quang Mật độ huỳnh quang FI Calcein tỷ lệ thuận với tỷ lệ tế bào sống - Kết nghiên cứu có giảm mức độ tín hiệu huỳnh quang đáng kể sau dòng tế bào A549 phản ứng với tế bào Lympho T cảm ứng sau thời gian ủ (Hình 3.9) Trong nghiên cứu này, tế bào A549 đồng nuôi cấy với tế bào lympho T nồng độ khác 1/12,5; 1/25; 1/50 Tỷ lệ gây độc tế bào Lympho T tế bào A549 quy đổi thành biểu đồ tuyến tính từ mức độ tín hiệu huỳnh quang (Hình 3.10) Tại tỷ lệ tế bào Lympho T so với tế bào ung thư A549 (E/T) cao tín hiệu giảm mạnh, chứng tỏ vài trò tiêu diệt tế bào A549 tế bào T gây độc CD8+ tỷ lệ thuận với mật độ tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC có cảm ứng kháng nguyên cho thấy khả gây độc tế bào tế bào A459 cao Trong gần khơng có khác biệt FI tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exosome từ môi trường DC cảm ứng kháng nguyên (Exo) DC không cảm ứng kháng nguyên (DCno) tỷ lệ E/T thấp, ngoại trừ tỷ lệ E/T=50/1 cho thấy Lympho T đồng nuôi cấy với Exosome từ mơi trường DC cảm ứng kháng ngun (Exo) có khả tiêu diệt tế bào cao DC không cảm ứng kháng nguyên (DCno) Cụ thể độc tính tế bào lympho T đồng loài cảm ứng với DCno Exo 37% 50% tỷ lệ E/T=50/1, 31% 26% E/T=25/1 26% 13% E/T=12,5/1 Trong độc tính tế bào lympho T cảm ứng Exono cho 56 tỷ lệ thấp với giá tr 21%, 11%, 9% tỷ lệ E/T 50/1, 25/1 12,5/1 Hình 3.9: Hoạt tính gây độc lên tế bào A54 tế bào Lympho T Tín hiệu huỳnh quang FI tế bào A549 sau đồng nuôi cấy với tế bào lympho T cảm ứng với điều kiện khác (T cell_DC: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DC, T cell_DCno: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với DCno, T cell_Exo: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exo, T cell_Exono: tế bào Lympho T đồng nuôi cấy với Exono, T cell: tế bào Lympho T nuôi cấy độc lập) - Kết từ Casper J E Wahlund (2017) chứng khả kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ đặc hiệu kháng nguyên Exosome tiết từ tế bào tua cảm ứng với Ovalbumin Trong nghiên cứu, exosome thúc đẩy tế bào lách chuột tiết Interferon γ đáp ứng miễn d ch ex vivo [71] Các Exosome thu từ DC kích thích tăng sinh tế bào T CD8+ in vitro in vivo mạnh exosome tiết từ DC chưa trưởng thành, kích thích tế bào CTLs đặc hiệu khối u tăng sinh tăng khả miễn d ch kháng khối u [27, 66] Tuy nhiên, nghiên cứu này, Exosome tiết từ DC có cảm ứng khơng cảm ứng kháng nguyên chưa thể rõ mức độ kích thích tế bào Lympho T tiêu diệt tế bào ung thư A549 hiệu tiêu diệt DC, không loại trừ trường hợp liều lượng Exosome thu cịn thấp chưa đủ để kích thích tăng sinh mạnh khả gây độc tế bào Lympho T 57 Tỷ lệ % hoạt tính gây độc tế bào Khả tiêu diệt tế bào A549 90 80 70 60 50 40 30 20 10 80 75 50 43 26 31 26 13 11 12.5 25 37 21 50 Tỷ lệ E/T T-DC T-DC no T-Exo T-Exo no Hình 3.10: Tỷ lệ hoạt tính gây độc tế bào (mẫu 1) - Gần Gruijl cộng trình bày kết thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I liên quan đến việc cấy ghép DC đồng loài để điều tr bệnh bạch cầu tủy cấp tính [19] Kết luận việc điều tr an tồn, khả thi kich thích mức độ đáp ứng miễn d ch khác nhau, khơng có kết hợp hệ thống kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte antigen-HLA) [68] Tương tự nghiên cứu này, không thực kiểm tra mức độ HLA bốn mẫu máu cuống rốn trữ đông tế bào Lympho T từ máu ngoại vi người khỏe mạnh Tuy nhiên, kết cho thấy DC đồng loài Exosome tiết chúng đáp ứng miễn d ch kháng ung thư biểu mô phế nang phổi A549 in vitro tế bào tua cảm ứng với kháng ngun có khả trình diện kháng ngun tốt so với tế bào tua không cảm ứng kháng nguyên kích thích tắng sinh tế bào Lympho T Với tiềm nghiên cứu từ DC, Dex liệu pháp miễn d ch, máu cuống rỗn trữ đơng nguồn cung cấp lưộng lớn DC, Dex cho liệu pháp miễn d ch đóng vai trị nguồn dự trữ sẵn sàng để sản xuất vắc xin 58 Chƣơng - KẾT LUẬN Từ những kết thu thí nghiệm trên, rút kết luận sau: - Phân lập tế bào mono từ máu cuống rốn trữ đông với hiệu suất xấp xỉ 40% - Biệt hóa trưởng thành thành cơng DC từ tế bào đơn nhân máu cuống rốn trữ đông môi trường KBM 551 có chứa cytokine GM-CFS, IL-4, TNF-α: kích thước lớn, xuất tua dài biểu cao dấu ấn bề mặt điển hình DC, gồm: HLA-DR (41.0 ± 28.4 %), CD11c (40.9 ± 29.6), CD80 (80.4 ± 29.1 %), CD40 (41.9 ± 8.9 %), CD86 (80.6 ± 16.8 %) - Phân lập tế bào Lympho T từ máu ngoại vi có độ tinh cao (CD3+: 98.7±0.5%) - Thu nhận dung d ch có khả cao chứa Exosome tiết từ tế bào tua - DC cảm ứng với kháng nguyên A549, Exosome tiết từ môi trường nuôi cấy DC cảm ứng kháng ngun A549 có khả kích thích tăng sinh tế bào lympho T thông qua việc phân chia tế bào (từ 1-2 hệ), có khả tiêu diệt tế bào ung thư A549 mạnh so với tế bào không cảm ứng 59 Chƣơng - KIẾN NGHỊ - Theo nghiên cứu Phạm Văn Phúc cộng sử dụng MNC từ máu cuống rốn để biệt hóa thành DC cho tỷ lệ sống tế bào cao >90% [69] Thay sử dụng nguồn máu cuống rốn trữ đông thu MNC tế bào MNC nên phân lập thu thập máu cuống rốn trước trữ đông - Kiểm tra chất lượng Exosome thu từ trình siêu ly tâm, kiểm tra nồng độ cytokine tiết từ trình đồng nuôi cấy tế bào Lympho T với Exosome, tế bào tua để đánh giá hiệu kích thích miễn d ch kháng ung thư - Tiến hành thí nghiệm đối chứng với DC biệt hóa từ tế bào đơn nhân máu cuống rốn tươi DC đồng nuôi cấy với tế bào Lympho T tự thân để so sánh khác biệt khả kích thích kháng ung thư - Tiến hành thí nghiệm đối chứng Exosome thu từ môi trường nuôi cấy DC từ máu cuống rốn tươi Exosome thu từ môi trường nuôi cấy DC với tế bào Lympho T tự thân để so sánh khác biệt khả kích thích kháng ung thư 60 Chƣơng – TÀI LIỆU THAM KHẢO Admyre C S.M Johansson S Paulie and S Gabrielsson (2006) ―Direct exosome stimulation of peripheral humanT cells detected by ELISPOT‖ European journal of immunology, 36 (7), pp 1772-1781 Aldahlawi A.M and Ultrastructure (2016) ―Modulation of dendritic cell immune functions by plant components‖ Journal of microscopy, (2), pp 55-62 Allan R.S., J Waithman, S Bedoui, C.M Jones, J.A Villadangos, Y Zhan, A.M Lew, K Shortman W.R Heath and F.R Carbone (2006) ―Migratory dendritic cells transfer antigen to a lymph node-resident dendritic cell population for efficient CTL priming‖ Immunity, 25 (1), pp 153-162 André F., N Chaput, N.E Schartz, C Flament, N Aubert, J Bernard, F Lemonnier, G Raposo, B Escudier, and D.-H Hsu (2004) ―Exosomes as potent cell-free peptide-based vaccine I Dendritic cell-derived exosomes transfer functional MHC class I/peptide complexes to dendritic cells‖ The Journal of Immunology, 172 (4), pp 2126-2136 Andre F., B Escudier, E Angevin, T Tursz and L Zitvogel (2004) ―Exosomes for cancer immunotherapy‖ Ann Oncol, 15 (Suppl 4), pp iv141-144 Antoniewicz‐Papis J E Lachert J Woźniak K Janik and M Łętowska (2014) ―Methods of freezing cord blood hematopoietic stem cells‖ Transfusion, 54 (1), pp 194202 Ballen K F Verter and J Kurtzberg (2015) ―Umbilical cord blood donation: public or private?‖ Bone marrow transplantation, 50 (10), pp 1271 Ballen K.K E Gluckman and H.E Broxmeyer (2013) ―Umbilical cord blood transplantation: the first 25 years and beyond‖ Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 122 (4), pp 491-498 Banchereau J and R.M Steinman (1998) ―Dendritic cells and the control of immunity‖ Nature, 392 (6673), pp 245 10 Beauvillain C., S Ruiz, R Guiton, D Bout, I Dimier-Poisson and Infection (2007) ―A vaccine based on exosomes secreted by a dendritic cell line confers protection against T gondii infection in syngeneic and allogeneic mice‖ Microbes, (14-15), pp 1614-1622 11 Besse B., M Charrier, V Lapierre, E Dansin, O Lantz, D Planchard, T Le Chevalier, A Livartoski F Barlesi and A Laplanche (2016) ―Dendritic cell-derived exosomes as maintenance immunotherapy after first line chemotherapy in NSCLC‖ Oncoimmunology, (4), pp e1071008 12 Brode S and P.A Macary (2004) ―Cross‐presentation: dendritic cells and macrophages bite off more than they can chew!‖ Immunology, 112 (3), pp 345-351 61 13 Buschow S.I., E.N Nolte‐‗T Hoen G Van Niel M.S Pols, T Ten Broeke, M Lauwen, F Ossendorp C.J Melief G Raposo and R Wubbolts (2009) ―MHC II in dendritic cells is targeted to lysosomes or T cell‐induced exosomes via distinct multivesicular body pathways‖ Traffic, 10 (10), pp 1528-1542 14 Carbone D.P., D.R Gandara, S.J Antonia, C Zielinski, and L Paz-Ares (2015) ―Non– small-cell lung cancer: role of the immune system and potential for immunotherapy‖ Journal of Thoracic Oncology, 10 (7), pp 974-984 15 Castell-Rodríguez A., G Piđón-Zárate, M Herrera-Enríquez, K Jarqn-đez, and I Medina-Solares (2017) ―Dendritic cells: Location function and clinical implications‖ Biology of Myelomonocytic Cells, pp 21 16 Chen S M Lv S Fang W Ye Y Gao and Y Xu (2018) ―Poly (I: C) enhanced anticervical cancer immunities induced by dendritic cells-derived exosomes‖ International journal of biological macromolecules, 113, pp 1182-1187 17 Colino J and C.M Snapper (2006) ―Exosomes from bone marrow dendritic cells pulsed with diphtheria toxoid preferentially induce type antigen-specific IgG responses in naive recipients in the absence of free antigen‖ The Journal of Immunology, 177 (6), pp 37573762 18 Collin M N Mcgovern and M Haniffa (2013) ―Human dendritic cell subsets‖ Immunology, 140 (1), pp 22-30 19 De Gruijl T., S Santegoeds, S Van Wetering, S.K Singh, A Hall, A.A Van De Loosdrecht and A Kruisbeek (2013) ―Allogeneic dendritic cell (DC) vaccination as an ―off the shelf‖ treatment to prevent or delay relapse in elderly acute myeloid leukemia patients: results of Phase I/IIa safety and feasibility study‖ Journal for immunotherapy of cancer, (1), pp P205 20 Del Cacho E., M Gallego, S.H Lee, H.S Lillehoj, J Quilez, E.P Lillehoj, and C Sánchez-Acedo (2011) ―Induction of protective immunity against Eimeria tenella infection using antigen-loaded dendritic cells (DC) and DC-derived exosomes‖ Vaccine, 29 (21), pp 3818-3825 21 Delirezh N., S.M Moazzeni, F Shokri, M.A Shokrgozar, M.M Atri, and H Karbassian (2012) ―In vitro analysis of T cell responses induced by breast tumor cell lysate pulsed with autologous dendritic cells‖ Advances in Bioscience Biotechnology, (02), pp 126 22 Domagala-Kulawik J., I Osinska, and G.J.T.L.C.R Hoser (2014) ―Mechanisms of immune response regulation in lung cancer‖ Translational lung cancer research, (1), pp 15 23 Ebrahimi M Z.M Hassan J Hadjati P Hayat and S.M Moazzeni (2009) ―Immediate exposure to TNF-α activates dendritic cells derived from non-purified cord blood mononuclear cells‖ Iranian Journal of Immunology, (3), pp 107-118 62 24 Erfani N., B Khademi, M.R Haghshenas, Z Mojtahedi, B Khademi, and A.J.I.I Ghaderi (2013) ―Intracellular CTLA4 and regulatory T cells in patients with laryngeal squamous cell carcinoma‖ Immunological investigations, 42 (2), pp 81-90 25 Ge Q D Palliser H.N Eisen and J Chen (2002) ―Homeostatic T cell proliferation in a T cell-dendritic cell coculture system‖ Proceedings of the National Academy of Sciences, 99 (5), pp 2983-2988 26 Gluckman E., H.E Broxmeyer, A.D Auerbach, H.S Friedman, G.W Douglas, A Devergie H Esperou D Thierry G Socie and P Lehn (1989) ―Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling‖ New England Journal of Medicine, 321 (17), pp 1174-1178 27 Hao S O Bai F Li J Yuan S Laferte and J Xiang (2007) ―Mature dendritic cells pulsed with exosomes stimulate efficient cytotoxic T‐lymphocyte responses and antitumour immunity‖ Immunology, 120 (1), pp 90-102 28 Herrera O.B., D Golshayan, R Tibbott, F.S Ochoa, M.J James, F.M Marelli-Berg, and R.I Lechler (2004) ―A novel pathway of alloantigen presentation by dendritic cells‖ The Journal of Immunology, 173 (8), pp 4828-4837 29 Holla S M Sharma J Vani S.V Kaveri K.N Balaji and J Bayry (2014) ―GM-CSF along with IL-4 but not alone is indispensable for the differentiation of human dendritic cells from monocytes‖ Journal of Allergy Clinical Immunology, 133 (5), pp 1500-1502 e1501 30 Hwang S.-J., L.S.-C Cheng G Lozano C.I Amos X Gu and L.C Strong (2003) ―Lung cancer risk in germline p53 mutation carriers: association between an inherited cancer predisposition cigarette smoking and cancer risk‖ Human genetics, 113 (3), pp 238-243 31 Inamura K (2017) ―Lung cancer: understanding its molecular pathology and the 2015 WHO classification‖ Frontiers in oncology, 7, pp 193 32 Joshi S.S., U.E Vu, T.R Lovgren, M Lorkovic, W Patel, G.L Todd, C Kuszynski, B.J Joshi and H.P Dave (2002) ―Comparison of phenotypic and functional dendritic cells derived from human umbilical cord blood and peripheral blood mononuclear cells‖ Journal of hematotherapy stem cell research therapy, 11 (2), pp 337-347 33 Klechevsky E., A.-L Flamar, Y Cao, J.-P Blanck, M Liu, A O'bar, O Agouna-Deciat, P Klucar, L Thompson-Snipes and S Zurawski (2010) ―Cross-priming CD8+ T cells by targeting antigens to human dendritic cells through DCIR‖ Blood, 116 (10), pp 16851697 34 Kowanetz M., W Zou, S.N Gettinger, H Koeppen, M Kockx, P Schmid, E.E Kadel, I Wistuba J Chaft and N.A Rizvi (2018) ―Differential regulation of PD-L1 expression by immune and tumor cells in NSCLC and the response to treatment with atezolizumab (anti– PD-L1)‖ Proceedings of the National Academy of Sciences, 115 (43), pp E10119-E10126 63 35 Ladanyi M and W Pao (2008) ―Lung adenocarcinoma: guiding EGFR-targeted therapy and beyond‖ Modern pathology, 21 (S2), pp S16 36 Lindenbergh M.F and W Stoorvogel (2018) ―Antigen presentation by extracellular vesicles from professional antigen-presenting cells‖ Annual review of immunology, 36, pp 435-459 37 Lindenbergh M.F and W Stoorvogel (2018) ―Antigen presentation by extracellular vesicles from professional antigen-presenting cells‖ Annual review of immunology, 36, pp 435-459 38 Liu H., T Zhang, J Ye, H Li, J Huang, X Li, B Wu, X Huang, and J Hou (2012), ―Tumor-infiltrating lymphocytes predict response to chemotherapy in patients with advance non-small cell lung cancer‖ Cancer immunology, immunotherapy, 61 (10), pp 1849-1856 39 Liu J and X Wang (2019) ―Focus on exosomes—From pathogenic mechanisms to the potential clinical application value in lymphoma‖ Journal of cellular biochemistry 40 Liu L., D Ge, L Ma, J Mei, S Liu, Q Zhang, F Ren, H Liao, Q Pu, and T Wang (2012) ―Interleukin-17 and prostaglandin E2 are involved in formation of an M2 macrophage-dominant microenvironment in lung cancer‖ Journal of Thoracic Oncology, (7), pp 1091-1100 41 Ma J L Liu G Che N Yu F Dai and Z You (2010) ―The M1 form of tumorassociated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time‖ BMC cancer, 10 (1), pp 112 42 Mellman I G Coukos and G Dranoff (2011) ―Cancer immunotherapy comes of age‖ Nature, 480 (7378), pp 480 43 Miwa S., H Nishida, Y Tanzawa, M Takata, A Takeuchi, N Yamamoto, T Shirai, K Hayashi H Kimura and K Igarashi (2012) ―TNF-α and tumor lysate promote the maturation of dendritic cells for immunotherapy for advanced malignant bone and soft tissue tumors‖ PloS one, (12), pp e52926 44 Nair S G.E Archer and T.F Tedder (2012) ―Isolation and generation of human dendritic cells‖ Current protocols in immunology, 99 (1), pp 7.32 31-37.32 23 45 Näslund T.I., U Gehrmann, K.R Qazi, M.C Karlsson, and S Gabrielsson (2013), ―Dendritic cell–derived exosomes need to activate both T and B cells to induce antitumor immunity‖ The Journal of Immunology, 190 (6), pp 2712-2719 46 Ostrand-Rosenberg S and P Sinha (2009) ―Myeloid-derived suppressor cells: linking inflammation and cancer‖ The Journal of Immunology, 182 (8), pp 4499-4506 64 47 Paez J.G., P.A Jänne, J.C Lee, S Tracy, H Greulich, S Gabriel, P Herman, F.J Kaye, N Lindeman and T.J Boggon (2004) ―EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy‖ Science, 304 (5676), pp 1497-1500 48 Palucka K and J Banchereau (2013) ―Human dendritic cell subsets in vaccination‖ Current opinion in immunology, 25 (3), pp 396-402 49 Pardoll D.M (2012) ―The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy‖ Nature Reviews Cancer, 12 (4), pp 252 50 Pitt J.M., F André, S Amigorena, J.-C Soria, A Eggermont, G Kroemer, and L Zitvogel (2016) ―Dendritic cell–derived exosomes for cancer therapy‖ The Journal of clinical investigation, 126 (4), pp 1224-1232 51 Ramalingam S.S., T.K Owonikoko and F.R Khuri (2011) ―Lung cancer: New biological insights and recent therapeutic advances‖ CA: a cancer journal for clinicians, 61 (2), pp 91-112 52 Sakamoto S., T Yamada, Y Terazaki, K Yoshiyama, S Sugawara, S Takamori, S Matsueda, S Shichijo A Yamada and M Noguchi (2017) ―Feasibility study of personalized peptide vaccination for advanced small cell lung cancer‖ Clinical lung cancer, 18 (6), pp e385-e394 53 Schott M (2006) ―Immunesurveillance by dendritic cells: potential implication for immunotherapy of endocrine cancers‖ Endocrine-related cancer, 13 (3), pp 779-795 54 Schott M.J.E.-R.C (2006) ―Immunesurveillance by dendritic cells: potential implication for immunotherapy of endocrine cancers‖ 13 (3) pp 779-795 55 Schreiber R.D L.J Old and M.J Smyth (2011) ―Cancer immunoediting: integrating immunity‘s roles in cancer suppression and promotion‖ Science, 331 (6024), pp 15651570 56 Shigematsu Y., T Hanagiri, H Shiota, K Kuroda, T Baba, Y Ichiki, M Yasuda, H Uramoto M Takenoyama and K Yasumoto (2012) ―Immunosuppressive effect of regulatory T lymphocytes in lung cancer, with special reference to their effects on the induction of autologous tumorspecific cytotoxic T lymphocytes‖ Oncology letters, (4), pp 625-630 57 Sohlberg E., S Saghafian‐Hedengren, K Bremme, and E Sverremark‐Ekström (2011), ―Cord blood monocyte subsets are similar to adult and show potent peptidoglycan‐ stimulated cytokine responses‖ Immunology, 133 (1), pp 41-50 58 Steinman R.M (2012) ―Decisions about dendritic cells: past present and future‖ Annual review of immunology, 30, pp 1-22 59 Stuffers S C Sem Wegner H Stenmark and A Brech (2009) ―Multivesicular endosome biogenesis in the absence of ESCRTs‖ Traffic, 10 (7), pp 925-937 65 60 Swart M I Verbrugge and J.B Beltman (2016) ―Combination approaches with immunecheckpoint blockade in cancer therapy‖ Frontiers in oncology, 6, pp 233 61 Szaryńska M K Preis P Zabul and Z Kmieć (2018) ―Diversity of dendritic cells generated from umbilical cord or adult peripheral blood precursors‖ Central-European journal of immunology, 43 (3), pp 306 62 Taieb J., N Chaput, C Ménard, L Apetoh, E Ullrich, M Bonmort, M Péquignot, N Casares, M Terme and C Flament (2006) ―A novel dendritic cell subset involved in tumor immunosurveillance‖ Nature medicine, 12 (2), pp 214 63 Théry C S Amigorena G Raposo and A Clayton (2006) ―Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids‖ Current protocols in cell biology, 30 (1), pp 3.22 21-23.22 29 64 Théry C., M Boussac, P Véron, P Ricciardi-Castagnoli, G Raposo, J Garin, and S Amigorena (2001) ―Proteomic analysis of dendritic cell-derived exosomes: a secreted subcellular compartment distinct from apoptotic vesicles‖ The Journal of Immunology, 166 (12), pp 7309-7318 65 Théry C L Duban E Segura P Véron O Lantz and S Amigorena (2002) ―Indirect activation of naïve CD4+ T cells by dendritic cell–derived exosomes‖ Nature immunology, (12), pp 1156 66 Utsugi-Kobukai S H Fujimaki C Hotta M Nakazawa and M Minami (2003) ―MHC class I-mediated exogenous antigen presentation by exosomes secreted from immature and mature bone marrow derived dendritic cells‖ Immunology letters, 89 (2-3), pp 125-131 67 Van De Laar L P.J Coffer and A.M Woltman (2012) ―Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy‖ Blood, The Journal of the American Society of Hematology, 119 (15), pp 33833393 68 Van De Loosdrecht A.A., S Van Wetering, S.J Santegoets, S.K Singh, C.M Eeltink, Y Den Hartog, M Koppes, J Kaspers, G.J Ossenkoppele, and A.M Kruisbeek (2018) ―A novel allogeneic off-the-shelf dendritic cell vaccine for post-remission treatment of elderly patients with acute myeloid leukemia‖ Cancer Immunology, Immunotherapy, 67 (10), pp 1505-1518 69 Van Pham P., B.T Vu, V.Q Pham, P.M Le, H.T Le, and N.K Phan (2015) ―Production of dendritic cells and cytokine-induced killer cells from banked umbilical cord blood samples‖ Biomedical Research Therapy, (11), pp 402-408 70 Vesely M.D M.H Kershaw R.D Schreiber and M.J Smyth (2011) ―Natural innate and adaptive immunity to cancer‖ Annual review of immunology, 29, pp 235-271 66 71 Wahlund C.J., G Güclüler, S Hiltbrunner, R.E Veerman, T.I Näslund, and S Gabrielsson (2017) ―Exosomes from antigen-pulsed dendritic cells induce stronger antigen-specific immune responses than microvesicles in vivo‖ Scientific reports, (1), pp 17095 72 Wykes M and G Macpherson (2000) ―Dendritic cell–B‐cell interaction: dendritic cells provide B cells with CD40‐independent proliferation signals and CD40‐dependent survival signals‖ Immunology, 100 (1), pp 1-3 73 Yi H.-J and G.-X Lu (2012) ―Adherent and non-adherent dendritic cells are equivalently qualified in GM-CSF, IL-4 and TNF-α culture system‖ Cellular immunology, 277 (1-2), pp 44-48 74 Zappa C and S.A Mousa (2016) ―Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances‖ Translational lung cancer research, (3), pp 288 75 https://www.immunopaedia.org.za/immunology/basics/5-overview-of-t-cell-subsets/ 67 ... ? ?nghiên cứu khả kích thích miễn dịch kháng ung thƣ phổi exosome tế bào tua máu dây rốn trữ đơng” để đánh giá khả kích thích miễn d ch chống ung thư in vitro Exosome thu nhận từ tế bào tua phân lập... ứng miễn d ch cách kích thích tế bào T tiêu diệt tế bào ung thư kích hoạt tế bào nhớ ngăn ngừa ung thư tái phát Tuy nhiên sử dụng vắc xin tế bào tua điều tr ung thư có số nhược điểm Gần nghiên cứu. .. NHIÊN KHOA SINH HỌC Lê Thị Huyền NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH KHÁNG UNG THƢ PHỔI CỦA EXOSOME TẾ BÀO TUA MÁU DÂY RỐN TRỮ ĐÔNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Mã số: 8420101.4