ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2017 i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC HỒNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HĨA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN – 2017 ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Thái Ngun, tháng 09 năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Tâm tận tình hướng dẫn bảo suốt q trình tơi nghiên cứu thực đề tài Tôi xin cảm ơn PGS.TS Lê Văn Sơn, phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học cơng nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực thí nghiệm nghiên cứu đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn; cảm ơn đóng góp ý kiến quý báu buổi seminar khoa học báo cáo đề cương luận văn Trong trình nghiên cứu, nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng, phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên Tôi xin chân thành cảm ơn môn Sinh học đại GD sinh học, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để thực q trình nghiên cứu Tơi xin cảm ơn thầy cô giáo cán Khoa Khoa học sống, thầy cô cán Bộ phận đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa học Tơi xin bày tỏ lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè động viên, quan tâm, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Thái Nguyên, tháng năm 2016 TÁC GIẢ Hoàng Ngọc Anh iv MỤC LỤC DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu dừa cạn 1.1.1 Đặc điểm phân loại phân bố dừa cạn 1.1.2 Đặc điểm sinh học dừa cạn 1.1.3 Tác dụng dừa cạn 1.2 Hợp chất alkaloid tác dụng 1.2.1 Alkaloid 1.2.2 Alkaloid dừa cạn 1.3 Quá trình sinh tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 10 1.4 Enzyme peroxidase (Prx) gen mã hóa Prx 12 1.4.1 Enzyme peroxidase Prx 12 1.4.2 Gen mã hóa peroxidase (Prx) 13 1.5 Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens 14 1.6 Các nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn 16 1.6.1 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp nuôi cấy mô – tế bào thực vật 16 1.6.2 Nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp vinblastine vincristine dừa cạn phương pháp chuyển gen 17 1.7 Phân tích chuyển gen kỹ thuật PCR 18 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Vật liệu thực vật 20 v 2.1.2 Vật liệu di truyền 20 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 20 2.2.1 Hóa chất, thiết bị nghiên cứu 20 2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy in vitro 21 2.3.2 Phương pháp chuyển gen vào dừa cạn 22 2.3.3 Phân tích chuyển gen 26 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Kết tạo dừa cạn mang gen chuyển crPrx 30 3.1.1 Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào dừa cạn nhờ A tumefaciens 30 3.1.2 Xác định có mặt gen chuyển crPrx hệ gen dừa cạn 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hoa ba giống Catharanthus roseus (L.) G Don [24] Hình 1.2 Cơng thức hóa học Vinblastine (A) Vincristine (B) Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa tạo vinblastine vincristine 11 Hình 1.4 Cấu trúc Cấu trúc intron exon CrPrx [15] 13 Hình 2.1 Sơ đồ chuyển gen vào dừa cạn thông qua vi khuẩn A Tumefaciens 23 Hình 3.1 Gieo hạt tạo in vitro 30 Hình 3.2 Ngâm mảnh mầm dịch huyền phù vi khuẩn 31 Hình 3.3 Mảnh mầm môi trường đồng nuôi cấy CCM 31 Hình 3.4 Mẫu thấm khơ đặt lên môi trường SIM 32 Hình 3.5 Mẫu phát triển đa chồi mơi trường SIM 32 Hình 3.6 Chọn lọc kéo dài chồi SEM 33 Hình 3.7 Cây giá thể 33 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen 36 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Một số loại môi trường tái sinh Dừa cạn 24 Bảng 2.2 Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn 24 Bảng 2.3 : Hóa chấ t pha đê ̣m rửa 28 Bảng 2.4: Hóa chấ t pha đê ̣m chiế t 28 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S 28 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR 29 Bảng 3.1 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào dừa cạn 34 viii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AS Acetosyringone bp base pairs Cặp bazơ nitơ CrPrx Catharanthus roseus Gen Prx dừa cạn peroxidase Cộng cs CCM Cocultivation medium DNA Deoxyribonucleic acid ELISA Enzyme-Linked Môi trường đồng nuôi cấy Xét nghiệm ELISA ImmunoSorbent Assay EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GM Germination medium Môi trường tái sinh GMO Genetic Modify Origanism Lương thực thực phẩm biến đổi gen kb Kilo base LB Luria Bertami Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi khuẩn MS Murashige Skoog, 1962 Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy in vitro theo Murashige Skoog OD Optical Density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Prx Peroxidase Gen mã hóa peroxidase Prx Peroxidase Protein peroxidase RM Rooting Medium Môi trường tạo rễ SEM Shoot Elongation Medium Môi trường kéo dài chồi ix SIM Shoot Induction Medium Môi trường tạo đa chồi T-DNA Transfer DNA Đoạn DNA chuyển vào thực vật Ti-plasmid Tumor inducing – plasmid Vir Virulence region WHO World Health Organization x Plasmid gây khối u Tổ chức y tế giới 2.3.1.1 Nguyên liệu biến nạp Khử trùng hạt cồn 70% lắc phút Sau ngâm hạt dung dịch nước tẩy (Javel 60%) lắc 15 phút Loại bỏ dung dịch nước tẩy rửa hạt nước cất khử trùng Hạt dừa cạn sau khử trùng cho nảy mầm môi trường MS Sau 10 – 14 ngày phát triển, tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng, sử dụng làm nguyên liệu biến nạp gen nuôi cấy in vitro 2.3.1.2 Chuẩn bị vi khuẩn lây nhiễm Cấy trải A tumefaciens cất giữ glycerol lên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung kanamycin 50 mg/ l rifamicin 50 mg/ l, nuôi 28oC 48 - 96 Sau đó, lấy khuẩn lạc vi khuẩn ni mơi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh kanamycin ni lắc với tốc độ 220 vịng/ phút 28oC 16 – 18 Lấy 1ml dịch vi khuẩn ni hoạt hóa 10ml LB lỏng tốc độ 220 vòng/ phút 28oC – Lấy dịch huyền phù vi khuẩn nuôi cấy lần ly tâm với tốc độ 5000 vòng/ phút, 4oC 10 phút Loại bỏ dịch hồ tan cặn với mơi trường 1/ MS pha loãng mật độ tế bào vi khuẩn OD600nm = 0,8 2.3.1.3 Lây nhiễm đồng nuôi cấy Các mảnh mầm dừa cạn gây tổn thương mũi dao nhọn từ – lần vào phần nách mầm dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100µM, 30 phút sau thấm khơ Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc không kháng sinh Q trình đồng ni cấy diễn tối, 25 oC thời gian ngày 2.3.1.4 Cảm ứng tạo chồi môi trường SIM Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu biến nạp rửa mơi trường 1/ MS có bổ sung cefotaxim 500 mg/ l với thời gian 10 phút, 25 sau thấm khơ giấy thấm khử trùng Đặt mẫu lên môi trường tạo cảm ứng đa chồi (SIM) có bổ sung kanamycin 50 mg/ l 2.3.1.5 Kéo dài chồi Sau tuần, cụm chồi sống sót môi trường chọn lọc loại bỏ mầm chuyển sang môi trường phát triển kéo dài chồi (SEM) 2.3.1.6 Tạo rễ Khi chồi phát triển đạt kích thước từ – 3cm chuyển sang môi trường tạo rễ (RM) để tạo hoàn chỉnh 2.3.1.7 Cây mơi trường tự nhiên Cây có chiều cao – 10 cm rễ đạt từ – cm đưa giá thể, để nơi tránh ánh sáng trực tiếp Sau tuần tưới dung dịch MS với tỷ lệ 1/ 10, ngày lần Sau đến tuần sống rễ mới, đưa mơi trường 2.3.2 Phân tích chuyển gen 2.3.2.1 Kiểm tra có mặt gen chuyển kỹ thuật PCR Tách chiết DNA tổng số từ dừa cạn chuyển gen thực phản ứng PCR với cặp mồi 35S để xác định có mặt gen crPrx với thành phần bảng 2.5 theo chu trình nhiệt bước bảng 2.6 Kiểm tra kết điện di gel agarose 0,8% 26 Trình tự mồi 35S: F: 5’ – CAA CGT CTT CAA AGC AAG TGG – 3’ R: 5’ – TTC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C – 3’ Phương pháp tách chiết DNA tổng số - Cân 200 mg mẫu nghiền cẩn thận nitơ lỏng thành dạng bột mịn, chuyển vào ống E ppendorf ml - Bổ sung ml đệm rửa (thành phần bảng 2.3) vào ống Eppendorf ml, voltex tạo thành dịch đồng Ly tâm 12000 vòng/ phút (v/ p) phút ở 4oC - Loa ̣i dich ̣ và lă ̣p la ̣i bước – từ đế n lần - Bổ sung 0,8 ml đệm tách chiết (thành phần bảng 2.4), lắ c đề u và giữ ở 65oC thời gian 30 phút đế n tiế ng - Giữ mẫu nhiệt đô ̣ phòng thời gian 10 phút - Bổ sung 0,8 ml chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo thời gian 10 phút Ly tâm 12000 vòng/ phút 15 phút 4oC - Hút dịch cho vào ống Eppendorf 1,5 ml - Bổ sung mô ̣t thể tích tương đương isopropanol (la ̣nh), đảo nhẹ, để đá 30 phút Ly tâm 12000 vòng/ phút 15 phút 4oC - Loại bỏ dịch thu tủa, bổ sung 0,5 ml cồn 80% Ly tâm 12000 vòng/ phút phút 4oC (bước này thực hiêṇ lầ n), sau nhẹ nhàng loa ̣i bỏ ethanol - Làm khô DNA bằ ng quạt gió, máy hút chân khơng - Hịa tan DNA 100 µl nước khử ion Bổ sung µl RNase (10 mg/ ml) ủ 37oC - Bảo quản DNA tổng số -20oC 27 Bảng 2.3 : Hóa chấ t pha đê ̣m rửa Nồ ng đô ̣ Hóa chất STT Nồ ng đô ̣ sử du ̣ng Thể tích stock Tris- HCl pH 1M 100 mM ml EDTA pH 0,5 M mM 0,5 ml Sorbitol Bô ̣t 0,35 M 3,1885 g NaH2PO4 Bô ̣t 0,4% 0,5 g Thêm nước đế n thể tích cuố i cùng là 50 ml 50 ml Bảng 2.4: Hóa chấ t pha đê ̣m chiế t Nồ ng đô ̣ Hóa chất STT Nồ ng đô ̣ sử stock du ̣ng Thể tích CTAB Bô ̣t 2% 0,5 g NaCl 5M 1,4 M ml EDTA pH 0,5 M 20 mM ml Tris- HCl pH 1M 100 mM 2,5 ml β -MercaptoEthanol 0,1% 25 µl Thêm nước đế n thể tích cuố i cùng 25 ml 25 ml Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 35S Thành phần phản ứng STT Nồng độ Thể tích (µl) - 10 2X 12,5 H2O Master mix Mồi xi 10 pmol/ µl Mồi ngược 10 pmol/ µl AND/ cDNA 100 ng/ µl 0,5 Tổng 25 28 Bảng 2.6 Chu kỳ phản ứng PCR Bước Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Biến tính 94 phút Biến tính 94 30 giây Gắn mồi 56 30 giây Kéo dài chuỗi 72 30 giây Hoàn tất kéo dài chuỗi 72 10 phút Kết thúc phản ứng 15 ∞ Chu kỳ 30 Chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR - Cân 0,4g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sơi để agarose tan hồn tồn Để nguội 45 – 50oC đổ vào khn gel chuẩn bị sẵn Sau 30 phút gel nguội đơng cứng chuyển khay chứa gel vào máy điện di cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di cho đệm ngập gel khoảng 0,5 – cm - Tra mẫu: Sản phẩm PCR tra vào giếng gel - Chạy điện di: Sau tra mẫu điện di xong, máy điện di kết nối với nguồn Đặt 120V, 90mA, 30 phút - Nhuộm gel dung dịch ethibium 15 phút - Quan sát: gel soi đèn tử ngoại, ADN phát sáng nhờ liên kết với EtBr - Chụp ảnh gel 2.3.2.3 Các phương pháp phân tích xử lý số liệu Hiệu suất chuyển gen xác định công thức: Số mang gen chuyển Hiê ̣u suấ t chuyể n gen (%) = x 100 (%) Tổ ng số mẫu biế n na ̣p 29 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tạo dừa cạn mang gen chuyển crPrx 3.1.1 Chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào dừa cạn nhờ A tumefaciens Hạt dừa cạn khử trùng cồn 70% lắc phút javen 60% lắc 15 phút, sau cho nảy mầm môi trường MS đến phát triển (hình 3.1 A-B), mầm tách đôi, loại bỏ đỉnh sinh trưởng để làm vật liệu nhận gen B A C Hình 3.1 Gieo hạt tạo in vitro A: Gieo hạt dừa cạn môi trường MS; B: Hạt phát triển thành con; C: Hai mảnh mầm 30 Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có bổ sung acetosyringone 100 M 30 phút (hình 3.2) Hình 3.2 Ngâm mảnh mầm dịch huyền phù vi khuẩn Sau thấm khơ, cấy mơi trường mơi trường CCM Ni tối ngày (hình 3.3) Hình 3.3 Mảnh mầm môi trường đồng nuôi cấy CCM 31 Hình 3.4 Mẫu thấm khơ đặt lên mơi trường SIM Hình 3.5 Mẫu phát triển đa chồi mơi trường SIM 32 Hình 3.6 Chọn lọc kéo dài chồi SEM Các chồi nhỏ sống sót kéo dài mơi trường SEM có kháng sinh chọn lọc kanamycin chuyển sang môi trường rễ RM sau đem trồng lên giá thể (hình 3.7), tái sinh đưa mơi trường tự nhiên Hình 3.7 Cây giá thể 33 Chúng tiến hành biến nạp cấu trúc gen crPrx nhờ vi khuẩn A tumefaciens qua nách mầm hạt chín dừa cạn, giai đoạn nuôi cấy chọn lọc, kết sau: Lá mầm ngâm dịch huyền phù vi khuẩn có OD600nm = 0,8 bổ sung acetosyringone 100 M 30 phút Sau đồng nuôi cấy ngày, chuyển mẫu lên môi trường nuôi cấy để chọn lọc tái sinh chồi chuyển gen: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + MES 0,59g/ l + muối B5 3g/ l + BAP 0,5mg/ l + cefotaxim 500 mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Các mẫu tạo chồi đưa sang môi trường chọn lọc để tránh mẫu chết sản sinh chất làm ức chế tái sinh mẫu tạo chồi Chồi đạt chiều cao – cm chuyển sang môi trường rễ: MS + sucrose 30g/ l + agar 8g/ l + BAP 0,5mg/ l + IBA 0,4mg/ l + kanamycin 50 mg/ l Cây có chiều cao – 10 cm rễ đạt từ – cm đưa giá thể Kết thu trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Thống kê số lượng mẫu chuyển gen vào dừa cạn Lơ thí Số mẫu thí nghiệm nghiệm Số mẫu tạo chồi Số chồi kéo dài Số chồi rễ Số sống giá thể Lần 300 100 32 18 Lần 366 97 33 22 ĐC 0* 50 0 0 ĐC*1 50 18 13 10 Ghi chú: * ĐC0 mầm dừa cạn không chuyển gen cấy mơi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh *ĐC1 mầm dừa cạn không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Thí nghiệm chuyển cấu trúc mang gen crPrx vào giống dừa cạn hoa hồng nhụy tím qua hai lần biến nạp với 666 mảnh mầm (Bảng 3.1) thu 197 mẫu tạo chồi, 65 mẫu có chồi kéo dài môi trường kháng sinh chọn lọc SEM, 40 chồi rễ khỏe mạnh thu 15 T0 phát triển giá thể 34 Song song với thí nghiệm lây nhiễm vi khuẩn chuyển gen crPrx, có bố trí hai lơ đối chứng ĐC0 ĐC1 (mỗi lô 50 mẫu) Kết lô ĐC0 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy môi trường tái sinh bổ sung kháng sinh chọn lọc), mầm bị đào thải kháng sinh; lô ĐC1 (lá mầm dừa cạn không chuyển gen cấy tái sinh không bổ sung kháng sinh chọn lọc) thu tái sinh không chuyển gen sử dụng làm đối chứng Các dừa cạn T0 tái sinh sau lây nhiễm trồng, chăm sóc ngồi mơi trường tự nhiên khoảng tuần tiến hành thu mẫu để kiểm tra có mặt hoạt động gen chuyển crPrx 3.1.2 Xác định có mặt gen chuyển crPrx hệ gen dừa cạn Trong lĩnh vực cơng nghệ gen thực vật, nói, thành cơng sớm có giá trị lĩnh vực biểu protein thực vật việc sử dụng promoter định có nguồn gốc từ virus vi khuẩn Agrobacterium làm công cụ biểu gen ngoại lai hiệu trồng biến đổi gen Rất nhiều promoter sử dụng rộng rãi công nghệ gen thực vật tiếp tục promoter chọn lựa nghiên cứu biểu nhanh, đơn giản với rủi ro thấp Một promoter sử dụng rộng rãi để điều khiển biểu gen ngoại lai trồng biến đổi gen 35S Promoter 35S promoter dạng định có khả điểu khiển biểu gen mức độ cao, khả hoạt động mạnh nhiều loại mô nhiều loài cây, hoạt động mạnh hệ thống biểu tạm thời tế bào chuyển gen thực vật ổn định [5] Để kiểm tra có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen, sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi 35S để khuếch đại gen cần xác định Tiến hành tách chiết, tinh DNA tổng số từ 15 dừa 35 cạn chuyển gen thực phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 0,8% thể hình 3.8 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen chuyển crPrx dừa cạn chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1-15: sản phẩm PCR chuyển gen; (+): sản phẩm PCR 35S promoter; (-) sản phẩm PCR dừa cạn không chuyển gen Trên gel điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen crPrx (Hình 3.8), chạy điện di số 1-2-4-8-9-10-13 xuất băng DNA với kích thước khoảng 0,3 kb tương ứng kích thước ước tính cho 35S promoter xuất ngang với vị trí băng DNA điện di đối chứng dương (sản phẩm PCR 35S promoter) điều rằng, hệ gen dừa cạn chuyển gen số 1-2-4-8-9-10-13 (ký hiệu DT01- DT02- DT04- DT08- DT09DT010- DT013) có mặt gen crPrx Hiệu suất chuyển gen giai đoạn đánh giá đạt 7/ 666 = 1,05% Các dừa cạn chuyển gen dương tính với phản ứng PCR kết ban đầu đưa đến thành cơng quy trình chuyển gen crPrx vào dừa cạn Các dương tính với phản ứng PCR chăm sóc ưu tiên phát triển nhằm có phân tích khả hoạt động biểu gen chuyển crPrx 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Chuyển thành công gen crPrx vào dừa cạn nhờ Agrobacterium tumefaciens tạo 15 dừa cạn chuyển gen T0 trồng bầu đất ngồi mơi trường tự nhiên 1.2 Gen chuyển crPrx xác định tồn hệ gen dừa cạn hệ T0 hiệu suất chuyển gen đạt 1,05 % Đề nghị Tiếp tục phân tích dịng dừa cạn chuyển gen qua hệ T1, T2, T3… nhằm chọn tạo dịng ổn định có khả tổng hợp vinblastine vincristine cao 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Hà, Lương Thanh Huyền, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu (2014), "Tách dịng phân tử gen mã hóa peroxidase từ hai giống dừa cạn Catharanthus roseus", Tạp chí khoa học cơng nghệ, Đại học Thái Nguyên, 119(15) Bùi Thị Hà, Trần Thị Anh, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2015), "Nghiên cứu hệ thống tái sinh đa chồi in vitro dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don)", Tạp chí Khoa học, 4, pp 56 - 62 Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006), "Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus.", Tạp chí Phát triển Khoa học & Công nghệ - ĐHQG TPHCM, 9(6), pp 59 - 66 Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011), "Nghiên cứu chiết tách alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định", Tạp chí Khoa học Công nghệ - Đại học Đà Nẵng, 43, pp 85 Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Nông Văn Hải (2007), "Promoter ứng dụng cơng nghệ gen thực vật", Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(1), pp - 18 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), "Giáo trình cơng nghệ sinh học nơng nghiệp", NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Viện dược liệu (2001), "Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam", Nxb Khoa học Kỹ thuật, 1, pp 57 - 89 Aerts R.J., Stoker A., Beishuizen M., van de Heuvel M., van der Meijden E., Verpoorte R (1992), "Detrimental effects of Cinchona leaf alkaloids on larvae of the polyphagous insect Spodoptera exigua", J Chem Ecol, 18(11), pp 1955–1964 Bùi Thị Hà, Chu Hoàng Mậu, Nguyên Thị Tâm, Đỗ Huy Hoàng (2016), "Nghiên cứu quy trình chuyển gen gus dừa cạn", Tạp chí Khoa học Cơng nghệ Thái Ngun, 157, pp 71-75 10 Costa M.M., Hilliou F., Duarte P., Pereira L.G., Almeida I., Leech M., et al (2008), "Molecular cloning and characterization of a vacuolar class III peroxidase involved in the metabolism of anticancer alkaloids in Catharanthus roseus", Plant Physiol, 146(2), pp 403 - 417 11 Fattorusso E., Taglialatela O (2008), "Modern alkaloids: structure, isolation, synthesis and biology", Wiley-VCH, Weinheim, Germany 12 Ferreres F., Figueiredo R., Bettencourt S., Carqueijeiro I., Oliveira J., Gil-Izquierdo A., et al (2011), "Identification of phenolic compounds in isolated vacuoles of the medicinal plant Catharanthus roseus and their interraction with vacuator class III peroxidase: an H2O2 affair", J Exp Bot, 62(8), pp 2841-2854 38 13 Guggisberg A., Hesse M (1996), "The Alkaloids", The University of Zurich 14 Javier P., Elisabeth M., Silvia F (1998), "Effect of Agrobacterium rhizogenes T-DNA on alkaloid production in Solanaceae plants", Phytochemistry, 52(7), pp 1287 - 1292 15 Jinwei Liu, Jianhua Zhu, Le Tang, Wei Wen, Shuangshuang Lv, Rongmin Yu (2013), "Enhancement of vindoline and vinblastine production in suspension-cultured cells of Catharanthus roseus by artemisinic acid elicitation", MIRCEN Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, DOI:10.1007/s11274-013-1432 16 Kumar S1., Dutta A., Sinha A.K., Sen J (2007), "Cloning, characterization and localization of a novel basic peroxidase gene from Catharanthus roseus", FEBS J, 274(5), pp 1290-1303 17 Kumar S1., Jaggi M., Taneja J., Sinha A.K (2011), "Cloning and characterization of two new Class III peroxidase genes from Catharanthus roseus", Plant Physiol Biochem, 49(4), pp 404-412 18 Marfori E C., Alejar A A (1993), "Alkaloid yield variation in callus cultures derived from different plant parts of white and rosypurple periwinkle Catharanthus roseus (L.) Don", Philippine Journal of Biotechnology, 19 Pahwa D (2008), "Catharanthus alkaloids", B Pharm Punjab University Chandigarh, 19(1), pp 52 - 63 20 Van der Heijden R., Jabos D., Snoeijer W., Hallard D., Verpoorte R (2004), "The Catharanthus alkaloids: pharmacognosy and biotechnology", Curr Med Chem, 11, pp 607 – 628 21 Wang Q., Xing S., Pan Q., Yuan F (2012), "Development of efficient catharanthus roseus regeneration and transformation system using agrobacterium tumefaciens and hypocotyls as explants", BMC Biotechnology, 29, pp 12 - 34 22 Wang Q., Yuan F., Pan Q., Li M., Wang G., Zhao J., et al (2010), "Isolation and functional analysis of the Catharanthus roseus deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase gene promoter", Plant Cell Rep, 29(2), pp 185 - 192 23 Zhao J1., Zhu W., Hu Q (2001), "Selection of fungal elicitors to increase indole alkaloid accumulation in Catharanthus roseus suspension cell culture", Enzyme Microb Technol, 28(8), pp 666 - 672 24 zz "http://en.wikipedia.org/wiki/Catharanthus_roseus" 25 zz "https://en.wikipedia.org/wiki/Agrobacterium" 39 ... tài ? ?Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase liên quan đến tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don.)” Mục tiêu nghiên cứu Tạo dịng dừa cạn chuyển gen chứa gen mã hóa enzyme. .. HOÀNG NGỌC ANH NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN MÃ HÓA ENZYME PEROXIDASE LIÊN QUAN ĐẾN SỰ TỔNG HỢP ALKALOID Ở CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02... mã hóa enzyme peroxidase Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu chuyển gen mã hóa enzyme peroxidase dừa cạn Phân tích biểu gen chuyển crPrx dòng chuyển gen hệ T0 kỹ thuật PCR Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU