MỤC LỤC Trang I Báo cáo kết thực đề tài .2 1.1 Đặt vấn đề .2 1.2 Nội dung thực 1.3 Nguyên vật liệu, thiết bị phương pháp .4 1.4 Kết quả, biện luận 1.5 Kết luận, đề nghị 21 II Phụ lục Tài liệu tham khảo I BÁO CÁO KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1.1 Mục tiêu việc thực đề tài [1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 14] Đái tháo đường (ĐTĐ) bệnh rối loạn chuyển hóa đường làm đường glucose máu tăng cao đưa đến nước tiểu có đường, thể bị nhiễm độc keto axit, kèm theo triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, gầy nhanh… Bệnh xảy hormone insulin tuyến tụy bị thiếu insulin đủ hoạt động hiệu ĐTĐ gây biến chứng cấp nhiễm trùng, nhiễm toan, hôn mê, tăng thẩm thấu biến chứng mãn tính tai biến mạch máu não, nhồi máu tim, mù lịa, suy thận, rối loạn tiêu hóa, niệu sinh dục, loét bàn chân, bị cắt cụt tứ chi… Trong sản xuất protein tái tổ hợp, mục tiêu hàng đầu tạo số lượng lớn đồng thời protein mục tiêu phải tồn cấu hình có hoạt tính tức phải có gấp cuộn xác Vi khuẩn Gram âm E coli ưu tiên chọn lựa làm tế bào chủ sản xuất protein tái tổ hợp khả sinh sản nhanh, đạt mật độ cao môi trường nuôi cấy rẻ tiền đồng thời gen E coli đơn giản giải trình tự Thơng thường, sử dụng E coli làm tế bào chủ để sản xuất protein tái tổ hợp protein định vị tế bào chất Đây môi trường khử nên protein mục tiêu biểu vượt mức thường có xu hướng kết tụ, hình thành dạng khơng tan (thể vùi) protein khơng có hoạt tính cấu hình khơng xác Để phục hồi hoạt tính mong muốn protein mục tiêu, thể vùi (protein mục tiêu) phải tách chiết từ tế bào chất, hòa tan thể vùi phải tái gấp cuộn để có cấu hình xác Tuy nhiên, hiệu suất trình tái gấp cuộn tùy thuộc nhiều yếu tố, yếu tố quan trọng protein mục tiêu Nếu phân tử protein mục tiêu dạng tự nhiên có nhiều cầu nối disulfide, q trình tái gấp cuộn có hiệu thấp Trong phân tử insulin tự nhiên có cầu nối disulfit, hai cầu nối disulfide vị trí amino acid A7-B7, A20-B19 hình thành vùng A B, cầu nối disulfide amino acid A6-A11 bên chuỗi A Sự diện cầu nối làm cho hiệu suất tái gấp cuộn MPI không cao biểu vượt mức tế bào chất E coli Trong đó, vùng chu chất E coli mơi trường có tính oxi hóa chứa nhiều nhân tố xúc tác hình thành cầu nối disulfide họ protein Dsb (disulfide bond) nên thuận lợi cho tái gấp cuộn cho protein mục tiêu Một ưu điểm khác biểu protein mục tiêu chu chất số lượng chủng loại protein tế bào chủ diện không nhiều chu chất (khoảng 100 loại) so với tế bào chất (trên 3000 loại) nên trình tinh chế protein mục tiêu thuận lợi hiệu protein mục tiêu biểu tế bào chất Những nghiên cứu giới cho thấy Ecotin, protein ức chế trypsin E coli tổng hợp tiết vào chu chất nhờ trình tự tiết nằm đầu N Ecotin Bằng cách dung hợp trình tự tiết trình tự mã hóa Ecotin vào đầu N proinsulin proinsulin chuyển vào chu chất tái gấp cuộn proinsulin có hiệu cao so với việc dung hợp với peptide tín hiệu gen pelB, dsbA, hay ompT Trong nghiên cứu này, trình tự tiết trình tự mã hóa Ecotinđược sử dụng để dung hợp với đầu N MPI để cấu trúc dịng vi khuẩn E colicó khả biểu Ecotin-miniproinsulin dạng tan chu chất có cấu hình gấp cuộn tự nhiên Dòng tái tổ hợp sử dụng nguồn giống để tạo insulin tái tổ hợp có hoạt tính dùng sản xuất thuốc chữa bệnh ĐTĐ 1.1.2 Sự cần thiết nghiên cứu đề tài [6, 7, 8, 9] Số lượng bệnh nhân TĐ ngày gia tăng tạo nhu cầu lớn insulin Quy trình sản xuất insulin thương phẩm dùng điều trị TĐ bắt đầu việc chiết xuất insulin từ tụy bò heo Tuy nhiên, nguồn insulin ly trích từ động vật khơng đủ, có nhiều rủi ro giá thành cao Năm 1955, Frederick Sanger tìm chuỗi axit amin insulin người, tạo sở cho nhà khoa học tổng hợp gen mã hóa cho insulin người dùng công nghệ gen để sản xuất số lượng lớn insulin người tái tổ hợp với hiệu cao giá thành rẻ nhiều lần [9] Vào năm 1978, lần nhà khoa học công ty cơng nghệ sinh học Genetech dịng hóa gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu E coli cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật để sản xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại Humulin Năm 1982, Humulin FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành Đến năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp thức hết hiệu lực, mở hội lớn cho nước phát triển tiếp cận sản xuất loại thuốc Con số điều tra không đầy đủ cho thấy Việt Nam nằm nước có tỷ lệ bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường mức cao, nhu cầu insulin lớn Tuy nhiên, việc phụ thuộc lâu dài vào nguồn insulin nước ngồi với giá thành cao rõ ràng khơng phải đường tối ưu kinh tế Việt Nam Trước tình với điều kiện sở vật chất, trang thiết bị nhân lực PTN Công nghệ Sinh học Phân tử, thuộc Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp Hồ Chí Minh tiến hành nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp phục vụ điều trị bệnh tiểu đường với giá thành phù hợp với mức chi tiêu người dân định hướng nghiên cứu thiết thực cần thiết Mục tiêu nội dung đề tài nằm định hướng nghiên cứu hướng nghiên cứu 1.2 NỘI DUNG THỰC HIỆN Khuếch đại đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết vùng mã hóa ecotin từ gen E coli W3110 phản ứng PCR phân lập; cấu trúc plasmid dòng hóa pGEM-T Easy mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết vùng mã hóa Ecotin; cấu trúc plasmid biểu pET-43a mang đoạn DNA mang trình tự tín hiệu tiết vùng mã hóa Ecotin dung hợp với gen mã hóa miniproinsulin (MPI) người; biến nạp plasmid vào chủng vi khuẩn biểu E coli B834(DE3); khẳng định tính xác protein tái tổ hợp ecotin-miniproinsulin (EMPI) phương pháp Western-blot; khảo sát nồng độ cảm ứng IPTG chất hỗ trợ (ethanol) để tối ưu biểu EMPI dạng tan chu chất; tối ưu hóa điều kiện chiết tách phân đoạn chu chất 1.3 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP 1.3.1 Chủng vi sinh vật - Chủng chủ E coli DH5[F-, 80lacZM15, recA1, endA1, hsdR17 (rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] dùng để dịng hóa gen tạo lượng lớn plasmid tái tổ hợp - Chủngchủ E coli B834(DE3) [F-ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm met (DE3)] dùng để nghiên cứu biểu gen plasmid pET43EMPI - Chủng chủ E coli W3110 [F-λ- rph-1 INV(rrnD, rrnE)] dùng để tách gen - Chủng chủ E coli DH5/pET43Ins mang plasmid chứa gen mã hóa cho mini-proinsulin 1.3.2 Môi trƣờng nuôi cấy Môi trường sử dụng mơi trường LB (Luria-Bertani) có thành phần lít sau: Bacto-Tryptone 10g, cao nấm men 5g 10g NaCl 1.3.3 Hóa chất Các hóa chất phân tích dùng thí nghiệm phân tử mua từ hãng Merck, Fermentas, …, cách thức thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 1.3.4 Phƣơng pháp 1.3.4.1 Cấu trúc gen mpi để đƣợc biểu dạng tan chu chất E coli [5] Nhằm biểu MPI dạng tan chu chất E coli, chúng tơi chọn phương án dung hợp trình tự mã hóa MPI với trình tự mã hóa ecotin thẻ 6xHis đầu N Trình tự tín hiệu (ss) gen mã hóa ecotin giúp cho MPI biểu chu chất E coli Thẻ 6xHis giúp cho bước tinh chế phương pháp sắc kí lực với cột Ni-NTA (GS)6 (trình tự lặp lại lần Gly-Ser) giúp tạo ecotin dạng dimer đồng hóa trị Ngồi ra, vị trí cắt TEV protease (ENLYFQG) chèn vào cấu trúc ecotin 6xHis có vai trị giúp loại bỏ ecotin khỏi protein dung hợp 6xHis-MPI Một gốc methionine (R) chèn thẻ 6xHis MPI giúp việc loại bỏ thẻ 6xHis khỏi MPI CNBr Do đó, bước tinh chế phương pháp sắc kí lực với cột Ni-NTA xử lý cặp enzyme trypsin/ carboxypeptidease B, chúng tơi dự kiến thu nhận insulin hoàn chỉnh giống với cấu trúc tự nhiên Cấu trúc gen để biểu MPI dung hợp với ecotin 6xHis chu chất E coli để thu nhận insulin minh họa Hình Cấu trúc tạo thành cách: (i) Nhân gen mã hóa ecotin với trình tự peptide tín hiệu phản ứng PCR dùng khn DNA gen E coli tạo dòng plasmid pGEM thành plasmid pGEco; (ii) Tổng hợp trình tự linker chứa đoạn (GS)6 trình tự nhận biết TEV protease (ENLYFQG) phản ứng PCR tái tổ hợp; nối trình tự linker vào đầu C ecotin plasmid pGEco tạo thành plasmid pGEcolin chứa gen mã hóa ecotin trình tự linker; (iii) Thu nhận gen mã hóa ecotin trình tự linker từ plasmid pGEcolin nối vào trình tự mã hóa 6xHis-MPI plasmid pET43-Ins vị trí tương ứng với đầu N 6xHis-MPI để có plasmid pET43EMPI biểu MPI dạng dung hợp với ecotin (Hình 1) Hình Sơ đồ mơ tả cấu trúc trình tự mã hóa protein dung hợp ecotin-MPI dịng hóa pET43EMPI Đoạn gen mã hóa ecotin gồm trình tự tín hiệu (ss) gen cấu trúc dung hợp đầu N MPI Đoạn linker gồm trình tự lặp lại Gly-Ser vị trí cắt TEV protease Thẻ 6His gốc methionine (R) giúp loại bỏ thẻ 6His MPI CNBr Vị trí cắt protease mũi tên 1.3.4.2 Cảm ứng biểu ecotin-MPI chủng E coli a Cảm ứng biểu ecotin-MPI Cấy khuẩn lạc dòng E coli/ pET43EMPIvào bình ni cấy chứa 5ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100µg/ml Ni cấy qua đêm, 37oC Hút dịch huyền phù tế bào chuyển vào bình ni cấy chứa 10ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100µg/ml Ni cấy lắc 37oC đến OD600 dịch nuôi cấy đạt đến 0,8 Bổ sung IPTG cho nồng độ cuối đạt 0,5mM tiếp tục nuôi cấy lắc 25 oC, 24 Ly tâm thu sinh khối thời điểm OD 600 = 2,5 với tốc độ 10.000 vòng/phút, 5phút, nhiệt độ phòng Rửa sinh khối tế bào lần với nước cất.Ly tâm 10.000 vòng/phút, phút, loại bỏ hết phần dịch.Hịa sinh khối 100µl dH 2O Bổ sung tiếp 25µl dung dịch nạp mẫu điện di protein 5X Vortex đều, đun sôi 100oC, 10 phút.Ủ vào đá lạnh 15 phút để biến tính protein Ly tâm thu dịch 10.000 vịng/phút, phút, 4oC phân tích điện di SDS-PAGE b Tạo shock thẩm thấu kiểm tra khả tiết ecotin-MPI chu chất Thu 1,5ml dịch nuôi cấy cảm ứng IPTG vào eppendorf.Ly tâm 10.000 vịng, phút.Sinh khối huyền phù 200µl dung dịch chứa sucrose 25%, Tris-HCl 0,3M, MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, pH 8.Để eppendorf nhiệt độ phòng 30 phút.Ly tâm 13.000 vòng, phút, 4oC Dịch loại bỏ cặn làm tan 100µl dung dịch làm lạnh chứa MgCl2 0,5mM, EDTA 1mM, TrisHCl 10mM, pH 8, để đá 30 phút Ly tâm 13.000 vòng, 15 phút, 4oC Dịch (phân đoạn chu chất) thu nhận Cặn tủa (phân đoạn tế bào chất) huyền phù nước Phân tích diện ecotin-MPI chu chất tế bào chất điện di SDS-PAGE c Phân tích biểu ecotin-MPI điện di SDS-PAGE Nạp mẫu vào giếng gel gom gel polyacrylamide 12,5% Điện di với điện 160V, 2mA/giếng phẩm màu xanh tiếp cận đầu gel Dừng điện di nhuộm gel dung dịch nhuộm khoảng Giải nhuộm gel suốt không màu d Xác nhận protein dung hợp ecotin-MPI Western blot * Chuyển màng - Điện di SDS-PAGE mẫu thang phân tử lượng protein nhuộm sẵn Sau điện di cắt bỏ gel gom, đánh dấu gel phân tích Ngâm lắc gel dung dịch chuyển màng (Towbin) 10 phút - Chuẩn bị màng lai nitrocellulose, hai giấy thấm có kích thước phù hợp với kích thước gel Ngâm dung dịch chuyển màng 10 phút - Điện chuyển thẩm: làm ướt tất miếng xốp dung dịch chuyển màng, sau xếp theo thứ tự cực âm, miếng xốp, giấy lọc, gel, màng lai, giấy lọc, miếng xốp, cực dương Khóa điện chuyển màng lại, thêm dung dịch chuyển màng ngập miếng xốp - Lắp vào bồn điện di, chuyển với dòng điện 25V, 350mA - Lấy màng lai ra, đánh dấu mặt * Khóa màng - Chuyển màng lai vào hộp chứa dung dịch khóa màng - Lắc nhẹ giờ, nhiệt độ phòng * Phát protein bắt đặc hiệu với kháng thể - Rửa màng lai lần, với 15ml - 20ml PBST/lần, phút/lần - Bổ sung 15ml dung dịch chứa kháng thể kháng HUI-18 Lắc nhẹ nhiệt độ phòng - Rửa màng lai lần, 15ml - 20ml PBST/lần, phút/lần * Hiện phim - Đặt màng lai lên bìa nylon kiếng, phủ khắp bề mặt màng 1ml hỗn hợp reagent (bộ Kit HyperfilmTM ECL) Đậy màng lai lại nylon - Chuyển vào phòng tối, áp sát mặt phim lên phía trên, với vị trí màng lai, giữ cố định 5-10 phút - Nhúng phim vào dung dịch developer đến vạch protein xuất - Nhanh chóng chuyển phim sang dung dịch fixer, rửa đến phim suốt - Rửa phim lại nước, mang khỏi phịng tối, phơi khơ 1.3.5 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy cảm ứng đến biểu ecotin-MPI chu chất a Ảnh hưởng nồng độ IPTG Chủng nuôi cấy 250C cảm ứng 24 nồng độ IPTG khác 0,25mM, 0,5mM, 0,75mM 1,0mM để phân tích mức độ biểu ecotin-MPI chu chất Ứng với điều kiện, thu sinh khối từ 1,5ml dịch nuôi cấy thu nhận phân đoạn chu chất để kiểm tra mức độ diện ecotin-MPI chu chất điện di SDS-PAGE gel polyacrylamide 12,5% b Ảnh hưởng ethanol Chủng nuôi cấy môi trường LB có bổ sung 1%, 2%, 3%, 4% 5% ethanol với điều kiện nuôi cấy, cảm ứng phân tích tương tự mục a 1.3.6 Các phƣơng pháp ly trích EMPI dạng tan từ chu chất [3, 5, 13] 3.6.1 Ly trích EMPI phƣơng pháp shock thẩm thấu [1] Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, phút Sinh khối huyền phù 500ul dung dịch chứa 25% sucrose, 0.3M Tris–HCl, 0.5 mM MgCl2, mM EDTA, pH 8.0, để nhiệt độ phịng 30 phút sau ly tâm 13000 vịng, phút, 4oC Dịch loại bỏ cặn làm tan 500ul dung dịch làm lạnh chứa 0.5 mM MgCl2, 1mM EDTA, 10 mM Tris–HCl, pH 8.0, để đá 30 phút Ly tâm 13000 vòng, 15 phút, 4oC Dịch phân đoạn chu chất thu nhận chứa EMPI 1.3.6.2 Ly trích EMPI phƣơng pháp shock thẩm thấu [2] Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 13000 vòng, phút, 4oC Rửa dung dịch PBS lạnh (8g NaCl, 0.2g KCl; 1.15g Na2HPO4.7H2O; 0.2g KH2PO4 lít nước cất), pH 7.3, vortex kỹ, lặp lại hai lần Huyền phù sinh khối dung dịch 20% sucrose (20g sucrose 100ml dung dịch Tris-HCl 10mM pH 7.5; giữ lạnh 4oC), vortex, thêm 0,5M EDTA, pH 8.0 Để yên đá 10 phút, ly tâm 13.000 vòng, 10 phút, lấy phần tủa Thêm nước cất lạnh, vortex, để yên đá 10 phút, ly tâm 13.000 vịng, phút Dịch phân đoạn chu chất thu nhận chứa EMPI 3.6.3 Ly trích EMPI phƣơng pháp shock thẩm thấu [3] Lấy 3ml dịch nuôi cấy ly tâm 10000 vòng, phút Sinh khối rửa lần dung dịch chứa 10mM Tris-HCl, pH 8, 30mM NaCl Cặn tái huyền phù dung dịch sucrose 20% (20g sucrose 100ml dung dịch Tris-HCl 30mM), 1mM EDTA, pH Để yên đá 10 phút, ly tâm 13000 vòng, phút Tái huyền phù cặn nước cất Để yên đá 10 phút ly tâm 13.000 vòng, phút Dịch phân đoạn chu chất thu nhận chứa EMPI 1.4 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 1.4.1 Tạo plasmid pET43EMPI biểu ecotin-miniproinsulin chu chất E coli 1.4.1.1 Thu nhận gen mã hóa cho ecotin Đoạn gen ecotin mang trình tự tín hiệu tiết vùng mã hóa ecotin thu nhận phương pháp PCR từ DNA gen E coli W3110 với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR Pfu DNA polymerase Sản phẩm PCR có kích thước khoảng 500bp phân tích gel agarose 1% dự đốn (Hình 2) Sản phẩm tinh chế dịng hóa vào plasmid pGEM 12 b Sàng lọc thể biến nạp (E coli DH5) chứa plasmid pGEco Thể biến nạp E coli DH5 mang plasmid pGEco tuyển chọn kiểm chứng từ khuẩn lạc trắng phương pháp cắt giới hạn với enzyme NdeI EcoRI.Sản phẩm cắt cho hai vạch với kích thước khoảng 3.015bp (tương ứng với kích thước plasmid pGEM) 500bp (tương ứng với kích thước gen ecotin) (Hình 3, giếng 2) Như chúng tơi tạo dịng thành cơng gen ecotin vào plasmid pGEM Plasmid pGEco thu được giải trình tự với cặp mồi T7/ SP6 để thu nhận thông tin trình tự gen ecotin chèn vào Kết so sánh mức độ tương đồng với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen ecotin xác 100% (Hình 4) Plasmid pGEco dùng làm nguồn gen ecotin cho bước Hình Kết kiểm tra E coli DH5 / pGEco phương pháp cắt giới hạn 1, Thang DNA 1kb; 2, pGEM/EcoRI; 3, pGEco/EcoRI; 4, pGEco/NdeIEcoRI; 5, Thang DNA 100bp 13 Hình Kết giải trình tự pGEco kiểm tra trình tự gen ecotin 1.4.1.3 Tạo dịng gen mã hóa ecotin dung hợp với trình tự nhận biết TEV protease Trình tự linker mã hóa đoạn peptide gồm vùng lần lặp lại dipeptide Gly-Ser (GS)6 trình tự nhận biết TEV protease (ENLYFQG) tổng hợp phương pháp PCR tái tổ hợp với cặp mồi A1F/A2R Pfu DNA polymerase Sản phẩm PCR có kích thước 81bp phân tích gel agarose 1% dự đốn lý thuyết (Hình 5giếng 2) Sản phẩm PCR tinh chế dịng hóa vào plasmid pGEco Trình tự linker thu nhận xử lý với cặp enzyme EcoRI-NcoI nối vào plasmid pGEco mở vòng hai enzyme để tạo plasmid tái tổ hợp đặt tên pGEcolin Tiếp theo, sản phẩm nối hóa biến nạp vào chủng E coli DH5 Thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp sàng lọc dựa vào khả kháng ampicillin Trên đĩa môi trường LB-Agar-Amp, tế bào mang plasmid có khả sống sót hình thành khuẩn lạc đơn Đây khuẩn lạc E coli DH5/pGEcolin dự tuyển 14 Hình5 Khuếch đại đoạn linker mồi tổng hợp 1, Thang DNA 100bp 2, Sản phẩm khuếch đại Một số khuẩn lạc chọn để kiểm tra phương pháp PCR, cắt giới hạn Plasmid tách chiết từ khuẩn lac chọn phân tích phương pháp PCR với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR Ec_NdeIF/A2R Kết PCR plasmid điện di gel agarose 1% cho thấy với cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR có vạch đậm mang kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin khoảng 500bp (Hình 6, giếng 2) với cặp mồi Ec_NdeIF/A2R có vạch đậm mang kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker khoảng 581bp (Hình 6, giếng 3) dự đoán lý thuyết Khi plasmid pGEcolin cắt NdeI, sản phẩm cắt cho hai vạch với kích thước khoảng 3.015bp (tương ứng với kích thước plasmid pGEM) 581bp (tương ứng với kích thước gen ecotin-linker) (Hình 7, giếng 2) Plasmid pGEcolin thu nhận giải trình tự với cặp mồi SP6pro/T7ter để thu nhận thông tin trình tự gen ecotin-linker chèn vào Kết so sánh mức độ tương đồng với trình tự lý thuyết cho thấy trình tự gen ecotin-linker xác 100% (Hình 8) 15 Hình Kiểm tra plasmid pGEcolin phương pháp PCR 1, Thang DNA100 bp; 2, Cặp mồi Ec_NdeIF/Ec_EcoRIR; 3, Cặp mồi Ec_NdeIF/A2R Hình Kiểm tra thể plasmid pGEcoLin enzyme cắt giới hạn 1, Thang DNA 1kb; 2, Sản phẩm cắt với NdeI Hình Kết giải trình tự pGEcolin kiểm tra trình tự gen ecotin-linker Các kết trình bày cho phép kết luận chúng tơi tạo dịng thành công gen ecotin-linker vào pGEM tạo thành plasmid pGEcolin Plasmid dùng làm nguyên liệu cung cấp gen ecotin-linker để dung hợp với gen mã hóa MPI 16 1.4.1.4 Tái tạo dịng gen mã hóa ecotin-MPI trongplasmid biểu pET43.1.a Plasmid pET43.1.a biểu ecotin-MPIđược đặt tên pET43EMPI tạo thành từ pGEcolin (mang gen mã hóa ecotin + linker) pET43Ins (mang gen biểu MPI E coli) (Hình 9) Hình Quy trình thiết lập plasmid pET43EMPI biểu MPI dung hợp với ecotin dạng tan chu chất 17 Plasmid pET43Ins tách chiết từ dòng tế bào E coli DH5/pET43Ins cắt mở vòng NdeI Gen ecotin-linkerđược thu nhận từ plasmid pGEcolin enzyme NdeI cho sản phẩm có kích thước khoảng 581bp (Hình 10, giếng 2) Gen ecotin-linker nối vào plasmid pET43Ins mở vòng NdeI Biến nạp hỗn hợp sản phẩm nối vào E coli DH5 trải môi trường LBAmp.Các khuẩn lạc mọc môi trường LB-Amp thể biến nạp chứa plasmid tái tổ hợp pET43EMPI.Plasmid tái tổ hợp pET43EMPI tách chiết kiểm tra phương pháp PCR phương pháp cắt giới hạn Kết PCR plasmid gel agarose 1% với cặp mồi chuyên biệt Ec_NdeIF/ A2R cho thấy có vạch DNA đậm mang kích thước tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker khoảng 581bp (Hình 10, giếng 2) Đồng thời PCR plasmid pET43EMPI với cặp mồi T7P/A2R để kiểm tra chiều vạch có kích thước tương đương với vạch khoảng 631bp (như dự đốn) (Hình 10, giếng 3) Plasmid pET43EMPI cắt NdeI cho vạch: vạch lớn có kích thước 5.740bp (Hình 11, giếng 3) tương ứng với vạch pET43Ins cắt XhoI (Hình 11, giếng 2) vạch bên nhạt có kích thước khoảng 581bp (Hình 11, giếng 4) tương ứng với kích thước đoạn gen ecotin-linker Hình 10 Kiểm tra pET43EMPI PCR 1, Thang 100bp; 2, Cặp mồi Ec_NdeIF/A2R; 3, Cặp mồi T7P/A2R Hình 11 Kiểm tra pET43EMPI enzyme cắt giới hạn 1, Thang 1kb; 2, pET43Ins/XhoI; 3, pET43EMPI/XhoI; 4, pET43EMPI/NdeI 18 Plasmid pET43EMPI sau kiểm tra phương pháp PCR cắt giới hạn giải trình tự Kết (Hình 12) cho thấy gen ecotin-linker chèn vào đồng khung với plasmid pET43Ins Hình 12 Kết giải trình tự pET43EMPI kiểm tra đồng khung gen mã hóa ecotin-MPI Như vậy, chúng tơi tạo dịng thành cơng gen mã hóa ecotin-MPI vào plasmid biểu pET43.1a cho phép biểu MPI dung hợp với ecotin dạng tan chu chất 1.4.2 BIỂU HIỆN ECOTIN-MPI DẠNG TAN TRONG CHU CHẤT 1.4.2.1 Biểu ecotin-MPI chu chất E coli B834(DE3)/pET43EMPI Để đánh giá khả tạo protein tái tổ hợp ecotin-MPI chu chất chủng E coli B834(DE3)/pET43EMPI, mẫu sinh khối sau cảm ứng thu nhận tiến hành ly trích lấy phân đoạn protein chu chất phương pháp shock thẩm thấu Đồng thời tiến hành thu mẫu protein tổng số phân đoạn tế bào chất Các kết thu nhận phân tích kiểm tra SDS-PAGE khẳng định phương pháp Western blot 19 Kết phân tích SDS-PAGE cho thấy phân đoạn chu chất chủng E coli B834(DE3)/pET43EMPI cảm ứng IPTG xuất rõ nét vạch protein ecotin-MPI có kích thước khoảng 30kDA (Hình 11 A, giếng 5) Khi thực lai Western blot với kháng thể kháng thẻ kháng insulin HUI18 thu kết dương tính phim tương ứng với vị trí protein cần khẳng định gel SDS-PAGE Như vậy, protein tái tổ hợp ecotin-MPI biểu thành công dạng tan chu chất E coli mong đợi Bên cạnh đó, protein ecotin-MPI khơng tìm thấy phân đoạn tế bào chất sử dụng phương pháp shock thẩm thấu để thu nhận phân đoạn chu chất Kết cho thấy dịng tế bào E coli B834(DE3) mang plasmid pET43EMPI có khả biểu ecotin-MPI cách vượt mức phân đoạn chu chất Do đó, khẳng định ecotin đưa biểu protein dung hợp với nó, ecotin-MPI vào chu chất cách triệt để Hình 11 Kết khảo sát biểu MPI dung hợp ecotin chu chất (A) Điện di SDS-PAGE; (B) Lai Western-Blot với kháng thể kháng Insulin HUI18 1, Thang phân tử lượng A B protein; 2, B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG; 3, B834(DE3)/pET43EMPI cảm ứng IPTG; 4, Protein phân đoạn tế bào chất; 5, Protein phân đoạn chu chất Vậy thành cơng việc tạo dịng tế bào B834(DE3)/pET43EMPI có khả biểu MPI dạng dung hợp với ecotin chu chất cảm ứng IPTG đồng thời chứng minh biểu vượt mức protein phân đoạn SDS-PAGE Western Blot 20 1.4.3 TỐI ƢU HĨA CÁC ĐIỀU KIỆN NI CẤY ĐỂ NÂNG CAO BIỂU HIỆN MPI DUNG HỢP VỚI ECOTIN TRONG CHU CHẤT E coli Nhằm cải thiện hiệu tổng hợp MPI chu chất E coli, khảo sát điều kiện nuôi cấy, cảm ứng nhằm tìm thơng số thích hợp cho q trình lên men B834(DE3)/pET43EMPI để tổng hợp eccotin-MPI 1.4.3.1 Ảnh hƣởng IPTG IPTG chất cảm ứng T7 promoter promoter điều khiển trực tiếp trình sinh tổng hợp ecotin-MPI.Vì nghiên cứu ảnh hưởng dãy nồng độ IPTG khác điều cần thiết Chúng tiến hành khảo sát biểu ecotin-MPI tái tổ hợp chủng biểu B834(DE3)/pET43EMPI cảm ứng theo nồng độ IPTG khác 0,25mM, 0,5mM, 0,75mM 1mM Kết khảo sát Hình 12 lượng ecotin-MPI chu chất tăng lên không nhiều bổ sung nồng độ IPTG từ 0,25mM lên đến 0,5mM giảm xuống không đáng kể tiếp tục tăng nồng độ IPTG lên 0,75mM 1mM Vạch protein ecotin-MPI đậm ứng với 0,5mM IPTG (Hình 12, giếng 3) Hình 12 Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến biểu ecotin-MPI chu chất 1, Thang protein chuẩn; 2, 0,25mM; 3, 0,5mM; 4, 0,75mM; 5, 1mM; 6, B834(DE3)/pET43EMPI khơng cảm ứng IPTG 21 Như vậy, kết luận nồng độ IPTG tối ưu để cảm ứng biểu ecotinMPI chu chất chủng E coli B834(DE3)/pET43EMPI 0,5mM IPTG 1.4.3.2 Ảnh hƣởng bổ sung ethanol vào môi trƣờng nuôi cấy Việc thêm ethanol vào môi trường nuôi cấy E coli cảm ứng đáp ứng sốc nhiệt sản xuất chaperone phân tử dẫn đến làm tăng sản xuất protein tái tổ hợp E coli (Kusano cộng sự, 1999; Van Dyk cộng sự, 1995) Thêm vào đó, tương tự trình gấp cuộn IGFI, ethanol ảnh hưởng đến gấp cuộn proinsulin chu chất (Hejnaes cộng sự, 1992) Dựa công bố này, khảo sát ảnh hưởng bổ sung ethanol môi trường nuôi cấy đến biểu ecotin-MPI Kết điện di protein Hình 13 cho thấy bổ sung ethanol với nồng độ 1% - 2% lượng protein tái tổ hợp ecotin-MPI biểu chu chất tăng lên đáng kể thể đậm độ vạch kích thước 30 kDa (Hình 13, giếng 3, giếng 4) Tuy nhiên, nồng độ ethanol cao (3%) lượng ecotin-MPI bị giảm biểu protein bị ức chế hoàn toàn 4% - 5% ethanol Như vậy, việc bổ sung ethanol 1% đến 2% (v/v) làm tăng suất biểu protein ecotinMPI chu chất Hình 13 Ảnh hưởng ethanol (%) môi trường nuôi cấy lên biểu ecotin-MPI E coli B834(DE3)/pET43EMPI 1, Thang protein chuẩn; 2, 0%; 3, 1%; 4, 2%; 5, 3%; 6, 4%; 7, 5% 22 1.4.4 Biểu protein dung hợp EMPI dạng tan chu chất theo phƣơng pháp shock thẩm thấu khác Việc kiểm chứng biểu dạng tan protein tái tổ hợp chu chất thực phương pháp SDS-PAGE với việc chuẩn bị mẫu thực mục 1.3.6 Kết phân tích SDS-PAGE cho thấy xuất vạch protein có kích thước khoảng 30kDa tìm thấy sử dụng phương pháp shock thẩm thấu khác để ly trích protein phân đoạn chu chất (Hình 14, giếng 2, 3, 4) dòng E coli B834DE3)/pET43EMPI cảm ứng với IPTG Mẫu đối chứng (Hình 14, giếng 5) không xuất vạch protein Kết cho thấy phương pháp ly trích protein phân đoạn chu chất phương pháp shock thẩm thấu [1] cho lượng protein dung hợp nhiều so với phương pháp ly trích protein phân đoạn chu chất phương pháp shock thẩm thấu [2], [3] Ở phương pháp [2] [3], protein dung hợp ly trích chu chất phương pháp shock thẩm thấu cho lượng tương đương Với kết đạt trên, kết luận phương pháp shock thẩm thấu [1] dùng để ly trích protein mục tiêu dạng tan chu chất E coli phương pháp hiệu giúp ly trích lượng protein dung hợp nhiều 23 kDa 94 67 43 EMPI 30 20.1 14.1 Hình 14 Kết biểu protein EMPI chu chất phương pháp shock thẩm thấu khác điện di SDS-PAGE 1, thang phân tử lượng protein; 2, phân đoạn chu chất thu nhận phương pháp shock thẩm thấu [1] 3, phân đoạn chu chất thu nhận phương pháp shock thẩm thấu [2] 4, phân đoạn chu chất thu nhận phương pháp shock thẩm thấu [3] 5, phân đoạn chu chất chủng B834(DE3)/pET43EMPI không cảm ứng IPTG 1.5 KẾT LUẬN, ĐỀ NGHỊ 1.5.1 Kết luận - Đã thiết lập plasmid biểu pET43EMPI dựa dung hợp gen mã hóa ecotin từ E coli, trình tự linker mã hóa peptide chứa trình tự nhận biết TEV protease gen mã hóa 6xHis-MPI - Đã tạo dịng thành cơng chủng E coliB834(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET43EMPI có khả biểu MPI dung hợp với ecotin tiết chu chất - Đã xác định điều kiệnnuôi cấy cảm ứng biểu gen phương pháp ly trích phân đoạn chu chất tối ưu nhằm tăng cường biểu ecotinMPI chu chất 24 1.5.2 Đề nghị Đã hoàn thành nội dung theo yêu cầu đề tài, đề nghị nghiệm thu đề tài II PHỤ LỤC Tài liệu tham khảo tiếng Việt [1] Bộ môn Sinh lý học, Trường Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (2000) Sinh lý học Y khoa [2.] Gleslie R.D (1994), Y học thường thức bệnh đái tháo đường Nhà xuất Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tham khảo tiếng Anh [3] Ajamaluddin Malik, Marco Jenzsch, Andreas Lubbert, Rainer Rudolph (2007) Periplasmic production of native human proinsulin as a fusion to Escherichia coli ecotin Protein expression and purification 55, p: 100-111 [4] A.Mc Cormack, A McElduff (2004), An update on insulin therapy, Pharmacist, 23, 521-526R.J.Y Ho, M Gibaldi (2003), Biotechnology and Biopharmaceuticals: transforming proteins and genes into drugs, Wiley-Liss [5] Chung, C H., Ives, H E., Almeda, S., and Goldberg, A L (1983), Purification from Escherichia coli of a periplasmic protein that is a potent inhibitor of pancreatic proteases J Biol Chem 258, 11032–11038 [6] F Sanger, E.O.P Thompson, R Kitai (1955), The amide groups of insulin, Biochem J., 59, 509-518 [7] H Berg, M Walter, L Mauch, J Seissler, W Northemann (1993), Recombinant human preproinsulin Expression, purification and reaction with insulin autoantibodies in sera from patients with insulin-dependent diabetes mellitus J Immunol Methods, 164, 221-31 25 [8] J.Q Chen, H.T Zhang, M.H Hu, J.G Tang (1995), Production of human insulin in an E coli system with Met-Lys-human proinsulin as the expressed precursor,Appl Biochem Biotechnology 55, 5-15 [9] Nilsson J, Staahl S, Lundeberg J, Uhlen M, & Nygren PA (1997) Affinity Fusion Strategies for Detection, Purification, and Immobilization of Recombinant Proteins.Protein expression and purification.11 (1), 1-16 [10] S.G Chang, D.Y Kim, K.D Choi, J.M Shin, H.C Shin (1998), Human insulin production from a novel mini-proinsulin which has high receptor-binding activity, Biochem J 329, 631-635 [11] S.Zimmerman, H Scheraga (1977), Local interactions in bends of proteins, Proc Nat Acad Sciences USA, 74, 4126-4129 [12] W Kemmler, J.D Peterson, D.F Steiner (1971), Studies on the conversion of proinsulin to insulin, J Biol Chemistry, 246, 6786-6791 [13] Winter J., Neubauer P., Lockshuber R.G., Rudolph R (2000), Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to dsbA Journal of Biotechnology 84, 175-185 [14] Zhang Y., Olsen R.D., Nguyen B.K.Y., Olson P.S., Rhodes T.E., Mascarenhas D (1998) Expression of Eukaryotic proteins in solube form in Escherichia coli Protein expression and purification 12, 159-165 26 ... tơi tạo dịng thành cơng gen mã hóa ecotin-MPI vào plasmid biểu pET43.1a cho phép biểu MPI dung hợp với ecotin dạng tan chu chất 1.4.2 BIỂU HIỆN ECOTIN-MPI DẠNG TAN TRONG CHU CHẤT 1.4.2.1 Biểu. .. hay ompT Trong nghiên cứu này, trình tự tiết trình tự mã hóa Ecotinđược sử dụng để dung hợp với đầu N MPI để cấu trúc dòng vi khuẩn E colicó khả biểu Ecotin-miniproinsulin dạng tan chu chất có... 1.3.4 Phƣơng pháp 1.3.4.1 Cấu trúc gen mpi để đƣợc biểu dạng tan chu chất E coli [5] Nhằm biểu MPI dạng tan chu chất E coli, chọn phương án dung hợp trình tự mã hóa MPI với trình tự mã hóa ecotin