1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TẦN SUẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM VÙNG D – LOOP TRONG HỆ GEN TY THỂ Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 01 14 Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS LÊ QUANG HUẤN Người thực : NGUYỄN THÙY LINH Lớp : Cao học K17 Hà Nội – 2015 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Trong vài năm trở lại đây, hướng nghiên cứu sử dụng ADN ty thể (ADN ty thể) thị sinh học phát triển nhanh chóng nhiều lĩnh vực khác Bên cạnh đó, vấn đề rối loạn ty thể liên quan đến bệnh ty thể, bệnh chuyển hóa gặp, lão hóa….được xem mục tiêu nghiên cứu di truyền học y học Với nhiều phát minh nghiên cứu di truyền từ kỷ trước mà tiêu biểu việc cơng bố trình tự hệ gen người hay cịn gọi “ trình tự tham chiếu” (Cambridge Reference Sequencing – CRS) Anderson cộng công bố vào năm 1981 “trình tự tham chiếu sửa đổi” – rCRS (Andrew cộng 1991) tạo điều kiện thuận lợi cho nhà khoa học nghiên cứu sinh học mà đặc biệt nghiên cứu loài người Sau có đồ gen người, người ta thấy cá thể người giống đến 99.9% khác nhỏ (0.1%) cấu trúc hệ gen Trong 0.1% khác biệt hai cá thể có đến 80% đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymorphism viết tắt SNP) Chính SNP sử dụng rộng rãi mảng y dược học, hình cung cấp kiến thức hữu ích q trình tiến hóa lồi người vùng địa lý bối cảnh lịch sử khác Việc tìm danh sách SNP người Việt Nam góp phần hỗ trợ vào nghiên cứu tiến hóa di truyền, đồng thời cung cấp thơng tin đột biến có liên quan đến bệnh ung thư, rối loạn người Nhận thức tầm quan trọng việc tìm hiểu liệu di truyền dân tộc Việt Nam khn khổ luận văn này, chúng tơi tiến hành nghiên cứu: “Xác định tần suất đột biến điểm vùng D – Loop hệ gen ty thể người Việt Nam” Mục tiêu: - Lập danh sách SNP vùng D – Loop AND ty thể đặc trưng người Việt Nam Nội dung đề tài: - Tách chiết ADN từ mẫu móng tay - Giải trình tự gen vùng D – Loop - Phân tích trình tự gen vùng D – Loop mẫu so sánh trình tự mẫu phân tích với trình tự tham chiếu sửa đổi (rCRS) tìm đặc trưng SNPs chủng người Việt Nam CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu chung ty thể Ty thể (Mitochondrion) bào quan tìm thấy gần tất tế bào có nhân Số lượng ty thể tế bào loài khác Ty thể trung tâm hô hấp tế bào, nơi sản sinh ATP dạng lượng sử dụng cho phản ứng tế bào Khơng có ty thể tế bào phải dựa vào q trình đường phân kỵ khí để cung cấp tất adenosin triphotphat (ATP) cho hoạt động Ty thể có hệ gen độc lập nên có khả tự sinh sản cách phân đơi ty thể mẹ để sinh ty thể (Alberts B, Johnson A, Lewis J cộng 2002) Hình 1.1 Hình 1.1 Ty thể (Thepsychguru.com – 2012) 1.1 Cấu tạo chức ty thể 1.1.1 Cấu tạo Ty thể bào quan có hình trịn hình trụ dài, có kích thước đường kính 0.1 – 0.5 µm, chiều dài – μm Ty thể có cấu trúc màng kép bao gồm màng ngồi (outer membrane) màng (inner membrane) Màng chứa protein tạp kênh lớn (gọi porin) cho phép tất phân tử nhỏ 5kDa thấm qua Màng cuộn gấp phức tạp tạo thành cấu trúc gọi mào lược (cristate) Khác với màng ngoài, màng thấm chọn lọc số ion Vùng bề mặt lớn màng ty thể (intermembrane space) chứa enzym tham gia vào q trình oxy hóa - photphoryl hóa tổng hợp ATP Phần chất (matrix space) ty thể chứa enzym cần thiết cho oxy hóa pyruvat axit béo, enzym tham gia vào chu trình axit tricacboxylic (ATC) (Cooper 2000) Khoang chứa nhiều ADN ty thể, ribosome ty thể, RNA vận chuyển (tRNA) nhiều loại enzym cần thiết cho phiên mã dịch mã gen ty thể Hình 1.2 Hình 1.2 Cấu trúc ty thể (hallcpbio.com) 1.1.2 Chức ty thể Ty thể trung tâm giải phóng chuyển hóa lượng tế bào (photphoryl hóa – oxy hóa) Phần lớn lượng tích lũy nguyên liệu hữu giải phóng chuyển thành dạng ATP sử dụng pha phân giải hiếu khí diễn ty thể Vì ty thể xem “nhà máy lượng” tế bào (Dahout, Gonzalez 2006) Trong tế bào số lượng ty thể dao động từ 50 – 1.000 Các tế bào hoạt động mạnh tế bào tế bào gan có số lượng lớn ty thể Ở nơi tế bào hoạt động nhiều số vách ngăn lại tăng lên, ứng với số enzym tăng lên Bên tế bào ty thể phân bố nơi cần dùng nhiều lượng Ví dụ tế bào gan, ty thể nằm chèn mạng lưới nội chất hạt nơi cần nhiều lượng cho tổng hợp protein Tổng hợp lượng ty thể thơng qua q trình đường phân Chỉ phần nhỏ lượng dự trữ gluco chuyển hóa (2ATP) Sự chuyển hóa cacbohydrat hồn tất sản phẩm trình đường phân (pyruvat) chuyển vào ty thể bị oxy hóa từ O2 thành CO2, nước 36 ATP Các protein liên quan q trình oxy hóa – photphoryl hóa định vị màng ty thể, bao gồm thành phần chuỗi truyền điện tử (phức hệ đến 4), enzym F0F1 ATP synthase Quá trình truyền điện tử tổng hợp ATP tóm tắt hình 1.3 Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp ATP ty thể Ty thể cịn có khả tổng hợp chất: photpholipit, axit béo đặc biệt protein (protein cấu trúc enzym) ADN ty thể chịu trách nhiệm tổng hợp phần protein ty thể Ty thể có khả di truyền độc lập nhân Tuy nhiên có phối hợp nhân, chất tế bào chất với chất ty thể trình biểu gen (phiên mã tổng hợp protein) 1.2 Đặc điểm ADN ty thể người ứng dụng nghiên cứu Ty thể đóng vai trị quan trọng tiến hóa động vật Những nghiên cứu phổ biến di truyền người ADN ty thể (mitochondrial DNA – ADN ty thể) Mặc dù gen ty thể người 0.0005% so với tồn kích thước gen nhân SNP tìm thấy gen ty thể có liên quan đến nhiều bệnh chuyển hóa, rối loạn đặc trưng người đặc biệt SNP vùng D – Loop 1.2.1 Đặc điểm hệ gen ty thể người Hệ gen ty thể người có chiều dài khoảng 16.569 bp, phân tử mạch vịng kín nằm chất ty thể có hàng ngàn tế bào Phân tử ADN ty thể có hai chuỗi khác thành phần nucleotit:  Chuỗi nặng có chứa nhiều Guanin (H – strand), mã hóa cho 28 gen  Chuỗi nhẹ chứa nhiều Cytosin (L – strand), mã hóa cho gen tổng số 37 gen hệ gen ty thể Trong 37 gen có 13 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide cần thiết cho hệ thống photphoryl hóa – oxy hóa, bao gồm tiểu đơn vị phức hệ I (complex I), tiểu đơn vị phức hệ III (complex III), tiểu đơn vị cửa phức hệ VI (complex VI) hai tiểu đơn vị phức hệ V (complex V) Số gen cịn lại mã hóa cho 22 tRNA, rRNA (12S 16S) phục vụ trình dịch mã ty thể (Anderson S 1981) Các chuỗi polypeptit khác cần thiết cho cấu trúc chức ty thể mã hóa gen nhân tổng hợp ribosom tế bào chất Một đặc điểm đáng ý hệ gen ty thể người có phần trình tự khơng mã hóa Chỉ có khoảng 7% gen ty thể người khơng mã hóa protein, rRNA, tRNA phần lớn hệ gen nhân vùng ADN khơng mã hóa (intron) Đoạn ADN gen ty thể khơng có ngắn 10 bp Ở vài gen thay có mã kết thúc mRNA cần polyadenin hóa để tạo thành mã kết thúc Khoảng 90% số gen ty thể khơng mã hóa lại nằm vùng điều khiển hay D – Loop Phần lớn trình tự liên quan tới q trình nhân đơi ADN ty thể hay trình phiên mã nằm gần vùng D – Loop Đoạn D – Loop có kích thước khoảng 1.1 kb ADN ty thể có số vùng bất biến nằm vùng D – Loop bao gồm vùng promoter vùng CSB (Conserved Sequence Block) I, II III Vì trình tự bất biến nằm D – Loop bảo tồn nhiều lồi động vật có xương sống nên chúng cho có vai trị quan trọng q trình nhân đơi ADN ty thể Ví dụ, CSB I có vị trí gần vùng khởi đầu q trình nhân đơi chuỗi nặng (Wallberg and Clayton 1981) Thêm nữa, vùng D – Loop chứa vùng siêu biến (hypervariable regions) HVI, HVII HVIII Những vùng có tần suất đột biến cao đáng kể so với vùng khác hệ gen ty thể (Greenberg 1983) Hình 1.4 Cấu trúc ty thể người (Innovitaresearch – 2003) 1.2.2 Vị trí độ dài vùng gen điều khiển D – Loop Như giới thiệu trên, vùng gen điều khiển D – Loop có chiều dài xấp xỉ 1.100 bp chứa trình tự khởi đầu cho trình tái hệ gen ty thể đoạn điều khiển cho trình phiên mã gen chức vùng mã hóa (Anderson 1981, Lightowlers 2001) Hệ thống đánh số bazơ bắt đầu điểm gần vùng điều khiển hai phía, vùng điều khiển trải dài từ vị trí 16024 đến 16569, sau tiếp tục từ vị trí bazơ 576 Đây vùng xuất nhiều đột biến với tần số đột biến cao so với vùng khác hệ gen ty thể (Horai 1995, Sorenson, Fleischer 1996) Hình 1.5 Hình 1.5 Vùng điều khiển D – Loop ty thể người (http://www.alphabiolab.com)  Vùng siêu biến (HV1) kéo dài từ vị trí 16024 đến 16365  Vùng siêu biến (HV2) kéo dài từ vị trí 73 đến 340  Vùng siêu biến (HV3) kéo dài từ nucleotit 438 đến 574 1.3 Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs) 1.3.1 Đa hình nucleotit đơn gì? Đa hình nucleotit đơn hay gọi SNPs, định nghĩa biến thể trình tự ADN xảy nucleotit đơn A, T, G hay C hệ gen khác biệt so với cá thể khác lồi Hình 1.6 Đa hình nucleotit đơn (learn.genetics.utah.edu) Ở cá thể người, có 99.9% giống nhau, 0.1% khác biệt Sự khác biệt đặc trưng tính trạng Ví dụ phát triển bệnh người kiểu hình … Những biến đổi khơng có hại (những thay đổi kiểu hình), có hại (gây bệnh ung thư, bệnh tim, Huntington’s, bệnh tan huyết bẩm sinh), phát triển sau già (đây biến đổi tìm thấy vùng mã hóa điều hịa gen) 1.3.2 Các vị trí SNP gen SNP nằm vùng mã hóa gen, vùng không mang mã vùng xen gen Các SNP trình tự mã hóa khơng thiết làm thay đổi trình tự axit amin 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol 4:289-333 Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.Molecular Biology of the Cell 4th edition, Garland Science; 2002 Barthelemy, C., de Baulny, H O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):47987 Berger, K H., and Yaffe, M P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance, Experientia 52(12):1111-6 Bowmaker, M., Yang, M Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H T., Huberman, J A., and Holt, I J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9 Brown, T A., Cecconi, C., Tkachuk, A N., Bustamante, C., and Clayton, D A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative lightstrand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76 Butler, J.M., McCord, B.R., Jung, J.M., Wilson, M.R., Budowle, B., Allen, R.O (1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser fluorescence J Chromatogr B 658: 271-280 Butler, J.M and Levin, B.C (1998) Forensic applications of mitochondrial DNA Trends in Biotechnology 16: 158-162 Chen, X J., and Butow, R A., 2005, The organization and inheritance of the mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25 10 Cheng, Y L., Chang, W L., Lee, S C., Liu, Y G., Chen, C J., Lin, S Z., Tsai, N M., Yu, D S., Yen, C Y., and Harn, H J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci 75(13):1579-94 39 11 Clayton, D A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life 55(4-5):213-7 12 Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland 13 Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G J., Pebay-Peyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9 14 Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3 Pt 2):227s-255s 15 Evan, G I., and Vousden, K H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer, Nature 411(6835):342-8 16 Fliss, M S., Usadel, H., Caballero, O L., Wu, L., Buta, M R., Eleff, S M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science 287(5460):2017-9 17 Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M C., 1992, Identifying individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8 18 Goldstein, S., and Shmookler Reis, R J., 1984, Genetic modifications during cellular aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30 19 Greenberg, B D., Newbold, J E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA, Gene 21(1-2):33-49 20 Hanahan, D., and Weinberg, R A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70 Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):136780 21 Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013, Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets 14(5):586-600 40 22 IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO Press Release 23 Lu, J., Sharma, L K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15 24 Majamaa, K., Moilanen, J S., Uimonen, S., Remes, A M., Salmela, P I., Karppa, M., Majamaa-Voltti, K A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K J., and Hassinen, I E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population, Am J Hum Genet 63(2):447-54 25 McFarland, R., Elson, J L., Taylor, R W., Howell, N., and Turnbull, D M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is not good enough, Trends Genet 20(12):591-6 26 McKinney, E A., and Oliveira, M T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA, Genet Mol Biol 36(3):308-315 27 Miyazono, F., Schneider, P M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S E., Dienes, H P., Aikou, T., and Hoelscher, A H., 2002, Mutations in the mitochondrial DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus, Oncogene 21(23):3780-3 28 Mootha, V K., Lindgren, C M., Eriksson, K F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M J., Patterson, N., Mesirov, J P., Golub, T R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E S., Hirschhorn, J N., Altshuler, D., and Groop, L C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes, Nat Genet 34(3):267-73 29 Moraes, C T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C., Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev Neurobiol 53:3-23 41 30 Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: an age-related alteration, J Neurol Sci 100(12):14-21 31 Nass, M M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics I Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611 32 Parkin, D M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606 33 Petersen, K F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D L., DiPietro, L., Cline, G W., and Shulman, G I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2 34 Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J K., Markowitz, S D., Trush, M A., Kinzler, K W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3 35 Ralph, S J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects Med 31(2):145-70 35 Reed, J C., and Green, D R., 2002, Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3 36 Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta 81:448-61 37 Shoubridge, E A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum Mol Genet 10(20):2277-84 38 Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures V Le systeme des cytochromes des mutants ‘petite colonie’, Annales de l'Institut Pasteur:47-63 42 39 Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the ADN ty thể control region are mutational hotspots, Am J Hum Genet 67(4):1029-32 Taylor, R W., and Turnbull, MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined Đặt vấn đề Error! Bookmark not defined Mục tiêu Error! Bookmark not defined Nội dung đề tài Error! Bookmark not defined CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined Giới thiệu chung ty thể Error! Bookmark not defined 43 1.1 Cấu tạo chức ty thể Error! Bookmark not defined 1.1.1 Cấu tạo Error! Bookmark not defined 1.1.2 Chức ty thể Error! Bookmark not defined 1.2 Đặc điểm ADN ty thể người ứng dụng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 1.2.1 Đặc điểm hệ gen ty thể người Error! Bookmark not defined 1.2.2 Vị trí độ dài vùng gen điều khiển D – Loop Error! Bookmark not defined 1.3 Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs) Error! Bookmark not defined 1.3.1 Đa hình nucleotit đơn gì? Error! Bookmark not defined 1.3.2 Các vị trí SNP gen Error! Bookmark not defined 1.3.3 Ứng dụng tầm quan trọng Error! Bookmark not defined 1.4 Đột biến ty thể bệnh ty thể Error! Bookmark not defined 1.4.1 Đột biến ty thể vùng D – Loop Error! Bookmark not defined 1.4.2 Đột biến ty thể nằm vùng D – Loop Error! Bookmark not defined CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.2 Trang thiết bị Error! Bookmark not defined 2.3 Phần mềm tin sinh học Error! Bookmark not defined 2.4 Phương pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.4.1 Phương pháp tách chiết ADN từ móng tay Error! Bookmark not defined 2.4.2 Định lượng ADN tách chiết phương pháp quang phổ kế Error! Bookmark not defined 2.4.3 Nhân đoạn gen phản ứng PCR Error! Bookmark not defined 2.4.4 Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F Sanger Error! Bookmark not defined 2.4.5 Phương pháp phân tích chất lượng liệu trình tự Error! Bookmark not defined 2.4.6 Phương pháp tìm đột biến gen Error! Bookmark not defined CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu sinh phẩm Error! Bookmark not defined 3.2 Nhân gen phương pháp PCR Error! Bookmark not defined 44 3.3 Kết giải trình tự gen Error! Bookmark not defined 3.4 Kết phân tích đột biến Error! Bookmark not defined 3.4.1 Các SNPs công bố Ngân hàng Gen Error! Bookmark not defined 3.4.2 Các vị trí đa hình (SNPs) HV1 vùng D – Loop người Việt Nam Error! Bookmark not defined 3.4.3 So sánh danh sách SNPs người Việt Nam danh sách SNPs thống kê GenBank Error! Bookmark not defined 3.5 Các vị trí đa hình đặc trưng người Việt Nam bệnh ty thể Error! Bookmark not defined 3.6 Tỉ lệ đa hình vị trí đa hình xuất mẫu phân tích Error! Bookmark not defined CHƯƠNG IV – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined TÀI LIỆU THAM KHẢO Error! Bookmark not defined 45 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Mục tiêu: 3 Nội dung đề tài: .3 CHƯƠNG I – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu chung ty thể Hình 1.1 Ty thể .5 1.1 Cấu tạo chức ty thể .5 1.1.1 Cấu tạo Hình 1.2 Cấu trúc ty thể .6 1.1.2 Chức ty thể Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp ATP ty thể 1.2 Đặc điểm ADN ty thể người ứng dụng nghiên cứu 1.2.1 Đặc điểm hệ gen ty thể người Hình 1.4 Cấu trúc ty thể người .9 1.2.2 Vị trí độ dài vùng gen điều khiển D – Loop Hình 1.5 Vùng điều khiển D – Loop ty thể người 1.3 Đa hình nucleotit đơn (Single Nucleotide Polymophisms – SNPs) 10 1.3.1 Đa hình nucleotit đơn gì? 10 Hình 1.6 Đa hình nucleotit đơn 10 1.3.2 Các vị trí SNP gen 10 Hình 1.7 Vị trí SNPs gen 11 1.3.3 Ứng dụng tầm quan trọng 11 1.4 Đột biến ty thể bệnh ty thể 12 1.4.1 Đột biến ty thể vùng D – Loop 12 1.4.2 Đột biến ty thể nằm vùng D – Loop 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu .15 2.1.1 Phương pháp lấy mẫu 15 Hình 2.1 Các bước tiến hành thu thập mẫu sinh phẩm 15 2.1.2 Hóa chất 15 2.2 Trang thiết bị 16 46 Bảng 2.1 Danh sách trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 16 2.3 Phần mềm tin sinh học 16 Bảng 2.2 Phần mềm sử dụng 17 2.4 Phương pháp nghiên cứu .17 2.4.1 Phương pháp tách chiết ADN từ móng tay 17 2.4.2 Định lượng ADN tách chiết phương pháp quang phổ kế 18 2.4.3 Nhân đoạn gen phản ứng PCR 18 Hình 2.2 Sơ đồ nguyên lý phản ứng PCR 19 Hình 2.3 Các bước chu kỳ PCR 20 2.4.4 Phương pháp giải trình tự theo phương pháp F Sanger 21 Hình 2.4 Nguyên lý giải trình tự ADN theo phương pháp Sanger 22 2.4.5 Phương pháp phân tích chất lượng liệu trình tự 22 Hình 2.5 Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa liệu trình tự 23 Hình 2.6 Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự phương pháp phổ thơng .24 2.4.6 Phương pháp tìm đột biến gen 24 CHƯƠNG III – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu sinh phẩm 25 Bảng 3.1 Kết đo kiểm tra giá trị hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm 280 nm 25 3.2 Nhân gen phương pháp PCR .25 Bảng 3.2 Thành phần dùng cho phản ứng PCR 27 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR .27 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm PCR vùng D – Loop 27 3.3 Kết giải trình tự gen 28 Hình 3.2 Kết giải trình tự số mẫu sinh phẩm 28 3.4 Kết phân tích đột biến 28 3.4.1 Các SNPs công bố Ngân hàng Gen 29 Bảng 3.4 Vị trí đa hình HV1 vùng D – Loop công bố Ngân hàng Gen 29 3.4.2 Các vị trí đa hình (SNPs) HV1 vùng D – Loop người Việt Nam 30 Hình 3.3 Phần mềm NovoSNP phân tích mẫu .31 Bảng 3.5 SNPs tìm thấy HV1 mẫu sinh phẩm Việt Nam (NovoSNPS) 31 Hình 3.5 SNP vị trí 16381 .33 3.4.3 So sánh danh sách SNPs người Việt Nam danh sách SNPs thống kê GenBank 33 Hình 3.6 Bản đồ Venn tìm điểm đặc trưng riêng người Việt Nam 34 Bảng 3.6 Các SNP đặc trưng người Việt Nam 34 47 3.5 Các vị trí đa hình đặc trưng người Việt Nam bệnh ty thể 34 3.6 Phần trăm đa hình mẫu phân tích 36 Hình 3.7 Kết phân tích đột biến nhóm người Việt Nam nghiên cứu .36 Bảng 3.8 Phần trăm đa hình 11 SNP đặc trưng người Việt Nam 36 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .38 KẾT LUẬN 38 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO .39 Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev Cell Biol 4:289-333 39 Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.Molecular Biology of the Cell 4th edition, 39 Garland Science; 2002 39 Barthelemy, C., de Baulny, H O., and Lombes, A., 2002, D-loop mutations in mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA depletion?, Hum Genet 110(5):47987 39 Berger, K H., and Yaffe, M P., 1996, Mitochondrial distribution and inheritance, Experientia 52(12):1111-6 39 Bowmaker, M., Yang, M Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H T., Huberman, J A., and Holt, I J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem 278(51):50961-9 39 Brown, T A., Cecconi, C., Tkachuk, A N., Bustamante, C., and Clayton, D A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative lightstrand origins, not via a strand-coupled mechanism, Genes Dev 19(20):2466-76 .39 Butler, J.M., McCord, B.R., Jung, J.M., Wilson, M.R., Budowle, B., Allen, R.O (1994) Quantitation of PCR products by capillary electrophoresis using laser fluorescence J Chromatogr B 658: 271-280 .39 Butler, J.M and Levin, B.C (1998) Forensic applications of mitochondrial DNA Trends in Biotechnology 16: 158-162 39 Chen, X J., and Butow, R A., 2005, The organization and inheritance of the mitochondrial genome, Nat Rev Genet 6(11):815-25 .39 10 Cheng, Y L., Chang, W L., Lee, S C., Liu, Y G., Chen, C J., Lin, S Z., Tsai, N M., Yu, D S., Yen, C Y., and Harn, H J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci 75(13):1579-94 39 11 Clayton, D A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know, IUBMB Life 55(4-5):213-7 40 12 Cooper, G., 2000, The Cell: A Molecular Approach, Sunderland 40 48 13 Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G J., Pebay-Peyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and pathological aspects of the mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology (Bethesda) 21:242-9 40 14 Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell Biol 91(3 Pt 2):227s-255s 40 15 Evan, G I., and Vousden, K H., 2001, Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer, Nature 411(6835):342-8 40 16 Fliss, M S., Usadel, H., Caballero, O L., Wu, L., Buta, M R., Eleff, S M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science 287(5460):2017-9 40 17 Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M C., 1992, Identifying individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet 2(2):135-8 40 18 Goldstein, S., and Shmookler Reis, R J., 1984, Genetic modifications during cellular aging, Mol Cell Biochem 64(1):15-30 40 19 Greenberg, B D., Newbold, J E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in human mitochondrial DNA, Gene 21(1-2):33-49 40 20 Hanahan, D., and Weinberg, R A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell 100(1):57-70 40 Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J Med (359):136780 40 21 Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C., 2013, Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets 14(5):586-600 .40 22 IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five continents, in: WHO Press Release .41 23 Lu, J., Sharma, L K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res 19(7):802-15 41 24 Majamaa, K., Moilanen, J S., Uimonen, S., Remes, A M., Salmela, P I., Karppa, M., Majamaa-Voltti, K A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K J., and Hassinen, I E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike episodes: prevalence of the mutation in an adult population, Am J Hum Genet 63(2):447-54 41 25 McFarland, R., Elson, J L., Taylor, R W., Howell, N., and Turnbull, D M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations: when "definitely maybe" is not good enough, Trends Genet 20(12):591-6 41 26 McKinney, E A., and Oliveira, M T., 2013, Replicating animal mitochondrial DNA, Genet Mol Biol 36(3):308-315 41 27 Miyazono, F., Schneider, P M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U., Baldus, S E., Dienes, H P., Aikou, T., and Hoelscher, A H., 2002, Mutations in the mitochondrial 49 DNA D-Loop region occur frequently in adenocarcinoma in Barrett's esophagus, Oncogene 21(23):3780-3 41 28 Mootha, V K., Lindgren, C M., Eriksson, K F., Subramanian, A., Sihag, S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M J., Patterson, N., Mesirov, J P., Golub, T R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E S., Hirschhorn, J N., Altshuler, D., and Groop, L C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes, Nat Genet 34(3):267-73 .41 29 Moraes, C T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren, C., Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and function, Int Rev Neurobiol 53:3-23 41 30 Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: an age-related alteration, J Neurol Sci 100(12):14-21 .42 31 Nass, M M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics I Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol 19:593-611 42 32 Parkin, D M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer 54(4):594-606 .42 33 Petersen, K F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman, D L., DiPietro, L., Cline, G W., and Shulman, G I., 2003, Mitochondrial dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science 300(5622):1140-2 42 34 Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J K., Markowitz, S D., Trush, M A., Kinzler, K W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours, Nat Genet 20(3):291-3 .42 35 Ralph, S J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation - why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects Med 31(2):145-70 42 35 Reed, J C., and Green, D R., 2002, Remodeling for demolition: changes in mitochondrial ultrastructure during apoptosis, Mol Cell 9(1):1-3 .42 36 Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide: Cytochrome C Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal" Enzyme, Biochim Biophys Acta 81:448-61 42 37 Shoubridge, E A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative phosphorylation, Hum Mol Genet 10(20):2277-84 42 38 Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les levures V Le systeme des cytochromes des mutants ‘petite colonie’, Annales de l'Institut Pasteur:47-63 42 39 Stoneking, M., 2000, Hypervariable sites in the ADN ty thể control region are mutational hotspots, Am J Hum Genet 67(4):1029-32 43 50 Taylor, R W., and Turnbull, 43 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Danh sách trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Phần mềm sử dụng 17 Bảng 3.1 Kết đo kiểm tra giá trị hấp thụ ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm 280 nm 25 Bảng 3.2 Thành phần dùng cho phản ứng PCR 27 Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 27 Bảng 3.4 Vị trí đa hình HV1 vùng D – Loop công bố Ngân hàng Gen 29 Bảng 3.5 SNPs tìm thấy HV1 mẫu sinh phẩm Việt Nam (NovoSNPS) 31 Bảng 3.6 Các SNP đặc trưng người Việt Nam 34 Bảng 3.7 Một số bệnh ty thể liên quan đến đột biến điểm vùng HV1 35 Bảng 3.8 Phần trăm đa hình 11 SNP đặc trưng người Việt Nam 36 51 52 53 ... Bookmark not defined 1.4 Đột biến ty thể bệnh ty thể Error! Bookmark not defined 1.4.1 Đột biến ty thể vùng D – Loop Error! Bookmark not defined 1.4.2 Đột biến ty thể nằm vùng D – Loop Error!... Nam? ?? Mục tiêu: - Lập danh sách SNP vùng D – Loop AND ty thể đặc trưng người Việt Nam Nội dung đề tài: - Tách chiết ADN từ mẫu móng tay - Giải trình tự gen vùng D – Loop - Phân tích trình tự gen. .. CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH TẦN SUẤT ĐỘT BIẾN ĐIỂM VÙNG D – LOOP TRONG HỆ GEN TY THỂ Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên