BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Khánh Hoàng Việt NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG VÀ VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ MODULE TRONG CẤU TRÚC ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE TỪ KHU HỆ VI SINH VẬT TRONG DẠ CỎ CỦA DÊ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9.42.02.01 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Cơng nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS TS Trƣơng Nam Hải Người hướng dẫn khoa học 2: PGS TS Đỗ Thị Huyền Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … , ngày … tháng … năm 2020 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Vi sinh vật nói chung vi khuẩn nói riêng có ý nghĩa thực tiễn vơ to lớn lồi người thơng qua ứng dụng nhiều lĩnh vực y học, nông nghiệp, công nghiệp, xử lý ô nhiễm môi trường Do đó, nghiên cứu đa dạng trình tự từ vi sinh vật nhằm phát gen để khai thác ứng dụng chúng vào phục vụ sống chủ đề quan trọng nhà sinh học đặc biệt quan tâm Mặc dù vậy, phát gần cho thấy phần lớn (khoảng 99%) loài vi sinh vật môi trường chưa nuôi cấy Do vậy, nghiên cứu dựa vào phương pháp nuôi cấy thông thường khơng thể khai thác tồn nguồn gen có tiềm vi sinh vật Trong giai đoạn gần đây, thơng qua kỹ thuật Metagenomics giải trình tự tồn hệ gen tất vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường, gen từ vi sinh vật, kể vi sinh vật không nuôi cấy nghiên cứu, đánh giá cách tổng thể Tại nước ta, với phát triển ngành nông nghiệp với qui mô sản xuất ngày lớn tập trung nay, phụ phẩm nơng nghiệp mà nguồn sinh khối lignocellulose chiếm phần lớn chủ yếu bị đốt bỏ gây lãng phí ảnh hưởng xấu đến mơi trường Trong đó, nhân loại phải đối mặt với tình trạng suy kiệt nguồn ngun liệu hóa thạch hệ nghiêm trọng việc tích tụ khí thải nhà kính Việc nghiên cứu sử dụng nguồn lượng carbonhydrate từ nguyên liệu có khả tái tạo với trữ lượng khổng lồ lignocellulose cấp thiết để tạo sản phẩm thay nhiên liệu sản xuất từ nguyên liệu hóa thạch Lignocellulose nói chung hay cellulose nói riêng sinh khối có cấu trúc vững chắc, chuyển hóa theo nhiều bước để tạo thành sản phẩm cuối mà giai đoạn đường hóa đóng vai trị then chốt Trong q trình này, cellulase xác định nhân tố định tới hiệu suất chuyển hóa giá thành sản phẩm Do vậy, năm gần giới có nhiều cơng trình nghiên cứu tìm kiếm nguồn cellulase có hoạt tính cao, có lực mạnh với chất để chuyển hóa hiệu cellulose Khác với enzyme khác, phần lớn cellulase có cấu trúc module, có nghĩa ngồi vùng có chức xúc tác, enzyme cịn chứa thêm số module khác có cấu trúc độc lập nghiên cứu, điển module FN3, Ig, CBM Hiện giới, nghiên cứu vai trò module chưa biết chức đến hoạt tính xúc tác cellulase chưa công bố nhiều Nhiều giả thiết cho rằng, chúng không tồn vùng nối liên kết vùng hoạt tính mà chúng cịn thể nhiều chức sinh học quan trọng khác ổn định cấu trúc, làm tăng lực enzyme với chất Vì vậy, nghiên cứu làm rõ vai trị sinh học module cấu trúc cellulase có ý nghĩa cho việc lựa chọn thiết kế enzyme để nâng cao hiệu thủy phân nguồn sinh khối cellulose Từ năm 2014 đến năm 2017, nguồn kinh phí Đề tài độc lập cấp Nhà nước (Mã số: ĐTĐLCN.15/14), phòng Kỹ thuật di truyền (Viện CNSH, Viện HLKH&CNVN) giải mã DNA đa hệ gen hệ vi khuẩn cỏ dê chăn thả tự nhiên núi tỉnh Ninh Bình Thanh Hóa Kết từ 8,6 Gb liệu, đề tài khai thác 816 trình tự mã hóa cho cellulase Trong nghiên cứu này, chúng tơi hướng tới việc đánh giá đa dạng trình tự cellulase có cấu trúc module, tìm cấu trúc module đặc thù cho nghiên cứu vai trò module đến hoạt tính enzyme Do đó, chúng tơi thực Luận án: “Nghiên cứu đánh giá đa dạng vai trò số module cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật cỏ dê” Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase cellulase có cấu trúc module từ khu hệ vi sinh vật cỏ dê kỹ thuật Metagenomics; - Nghiên cứu vai trò module chưa rõ chức (FN3 Ig) lên hoạt tính cellulase Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu đề tài, thực nội dung nghiên cứu sau: Phân tích, đánh giá đa dạng họ GH, nguồn gốc cellulase cellulase có cấu trúc module mã hóa từ khung đọc mở (ORF) liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật cỏ dê Việt Nam Phân tích lựa chọn trình tự có cấu trúc module điển hình cho nghiên cứu biểu xác định vai trò vùng chưa biết chức Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế enzyme từ trình tự lựa chọn (XFn3Egc) cấu trúc chứa module (Fn3, XFn3, Egc, Fn3Egc) dạng dung hợp với SUMO 4 Nghiên cứu vai trò module chưa biết chức đến khả phân giải cellulose enzyme Nghiên cứu, đánh giá số tính chất enzyme tái tổ hợp biểu từ trình tự lựa chọn có cấu trúc module Những đóng góp luận án Từ 816 ORF mã hóa cellulase vi khuẩn cỏ dê Việt Nam, 243 ORF mã hóa cellulase xác định có cấu trúc chứa module chưa rõ chức FN3 Ig Trong số cellulase hoàn thiện chứa module FN3, 99,2% FN3 kèm với module xúc tác betaglucosidase GH3 có FN3 kèm với module xúc tác endoglucanase GH5 Toàn module Ig kèm với module xúc tác endoglucanase GH9 Cấu trúc mã hóa endoglucanase GH5 chứa module FN3 cấu trúc phát nghiên cứu Đã tổng hợp biểu trình tự mã hóa endoglucanase GH5 (XFn3Egc) cấu trúc chứa module khác (Fn3, XFn3, Fn3Egc, Egc) E coli để nghiên cứu vai trò FN3 cấu trúc enzyme Module FN3 xác định có khả làm tăng tính tan ổn định cấu trúc vùng xúc tác, nới lỏng cấu trúc tinh thể bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận chất tốt Module FN3 làm tăng lực enzyme lên chất tan CMC SXFn3Egc hoạt động tối ưu 40oC, pH Enzyme ổn định bền nhiệt độ 60 oC 90 phút Km đạt 1,26 mg/ml Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml Hoạt tính enzyme tăng lần sử dụng 40 mM Mn2+ giảm bổ sung ion kim loại (Ca 2+, Mg2+, Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+), loại hóa chất (SDS, urea, 2-mercaptoethanol, EDTA, tween 80, triton X-100) CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan cellulose Cellulose hợp chất cao phân tử cấu tạo từ đơn phân β-D-glucose thành phần chủ yếu thành tế bào thực vật Sử dụng nguồn nguyên liệu có khả tái tạo cellulose số ngành công nghiệp chế biến thực phẩm, sản xuất nhiên liệu sinh học, hóa chất tinh khiết xem xu hướng phát triển bền vững mặt kinh tế môi trường 1.2 Cellulase Cellulase nhóm enzyme quan trọng, có khả cắt mối liên kết -1,4-glycoside phân tử cellulose tạo thành sản cuối có giá trị glucose Cellulase thường chia thành ba loại (endoglucanase, exoglucanase, β-glucosidase) với chế phân cắt khác Cấu trúc cellulase gồm module xúc tác bao gồm module xúc tác liên kết với module bổ sung CBM module chưa rõ chức (FN3, Ig) 1.3 Ứng dụng Metagenomics khai thác gen Metagenomics thuật ngữ bao gồm kỹ thuật sinh học phân tử, tin - sinh học cho phép nghiên cứu đa hệ gen tất vi sinh vật thu nhận trực tiếp từ mẫu môi trường mà không thông qua nuôi cấy Metagenomics chứng minh phương pháp hiệu để khai thác enzyme, hoạt chất sinh học cho nhiều ứng dụng Trong nghiên cứu này, khai thác cellulase mới, đặc biệt cellulase có cấu trúc module (FN3, Ig) từ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase Bộ liệu phân tích từ 164.644 ORF lắp ráp từ 8,46 Gb liệu giải trình tự DNA đa hệ gen vi khuẩn cỏ dê Việt Nam CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng, vật liệu hóa chất thiết bị máy móc  Đối tượng nghiên cứu: Bộ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase từ liệu DNA đa hệ gen vi khuẩn cỏ dê  Các chủng vi sinh vật, plasmid hãng Invitrogen (Mỹ), mồi PCR đặt tổng hợp GenScript (Mỹ); hóa chất BioLab (Mỹ), Fermentas (Mỹ), Sigma (Mỹ), Merck (Đức) 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp sinh học phân tử, vi sinh vật Biến nạp DNA plasmid vào E coli (Froger et al., 2007); tách chiết DNA plasmid từ E coli điện di gel agarose (Sambrook et al., 2001); tinh chế DNA từ gel agarose sử dụng kit DNA Qiagene – QIAquick Gel Extraction Kit; tối ưu mã ba dựa phần mềm trực tuyến Genscript (Rare Codon Analysis Tool) 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh protein Tinh chế protein cột sắc kí lực Ni-NTA (Invitrogen) xác định độ Quantity One (Bio-Rad); định lượng protein Bradford (Bradford, 1976); xác định hoạt tính endoglucanase chất CMC (Miller, 1959) giấy lọc theo phương pháp Camassola cộng (2012) với số cải biển nhỏ; xác định hoạt tính cellulase đĩa thạch agar-CMC (Teather et al., 1982) dựa vào phân tích zymogram (Champasri et al., 2015); đánh giá tác động enzyme lên bề mặt giấy lọc chụp ảnh kính hiển vi điện tử quét SEM (Kataeva et al., 2002) 2.2.3 Các phương pháp tin sinh học Nghiên cứu Pfam trình tự dựa CSDL PFAM (http://pfam.janelia.org/search) vùng bảo thủ sử dụng BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.); dự đoán cấu trúc bậc ba enzyme sử dụng phần mềm trực tuyến Phyre2 Swiss model; khả chịu kiềm/acid sử dụng phần mềm AcalPred khả chịu nhiệt enzyme sử dụng phần mềm TBI 2.2.4 Xử lý số liệu: Sử dụng phương pháp thống kê, Microsoft Excel để tính tốn trình bày kết dạng ±SE (Standard Error) CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá đa dạng GH cấu trúc module cellulase suy diễn từ 816 khung đọc mở 3.1.1 Đánh giá đa dạng cấu trúc họ GH cellulase Từ 816 ORF mã hóa cellulase giải chức thuộc 11 họ GH khác (Bảng 3.1) Trong đó, họ GH3 (400 ORF) GH5 (192 ORF) xác định họ GH phổ biến chiếm tỷ lệ 49% 23,5% Các trình tự hồn thiện (297 ORF) phát tồn dạng cấu trúc chứa vùng xúc tác chứa thêm module chưa rõ chức (FN3, Ig) Trong đó, ORF thuộc họ GH3 có tới 90,9% trình tự có chứa module FN3; 100% ORF họ GH9 chứa module Ig module FN3 kèm với GH5 Do đó, module FN3, Ig không đơn giản vùng nối mà thể số chức sinh học chưa xác định rõ ràng Họ GH GH1 GH3 GH5 GH8 GH9 Bảng 3.1 Tổng hợp trình tự giải mã hóa cho enzyme thủy phân cellulose dựa sở liệu COG KEGG Số Họ Số Module Module ORF GH ORF GH1 16 GH16 GH16 33 GH3 198 GH16-CBM4 Fn3-GH3 202 GH44 GH44 GH5 189 GH48 GH48 Fn3-GH5 GH64 GH64-CBM6 GH5-CBM2 GH74 GH74 GH5-CBM37 GH94 GH94 50 GH8 48 CBM63 CBM63 GH9 11 FN3 FN3 10 GH9-Ig 30 14 GH9-CBM3 GH9-CBM37 GH9-dockerin 3.1.2 Đánh giá đa dạng cấu trúc cellulase hồn thiện có cấu trúc module Trong số 243 ORF mã hóa cellulase chứa cấu trúc module có 148 ORF có cấu trúc hồn thiện (131 ORF chứa FN3, 17 ORF chứa Ig) Trong đó, tồn 17 ORF mã hóa endoglucanase GH9 có chứa module Ig (Ig-GH9); 131 ORF hồn thiện có chứa module FN3 có 130 ORF (99,2%) mã hóa beta-glucosidase GH3 (GH3-Fn3) ORF mã hóa endoglucanase GH5 (Fn3-GH5) Module FN3 đứng trước vùng xúc tác endoglucanase GH5 đầu N cấu trúc gặp cần nghiên cứu để xác định vai trò module đến hiệu thủy phân enzyme 3.1.3 Đánh giá đa dạng nguồn gốc ORF mã hóa cellulase Để hiểu rõ cộng đồng vi khuẩn vai trò chúng q trình tiêu hóa cellulose cỏ dê Việt Nam, xác định nguồn gốc 816 ORF mã hóa cellulase Trong đó, 221 ORF mã hóa cellulase phân loại chủ yếu thuộc ngành Bacteroidetes (153 ORF) Firmicutes (53 ORF) với tỷ lệ tương ứng 69,2% 24,0% Bacteroides uniformis (29 ORF), Prevotella buccae (25 ORF) xác định loài chiếm ưu mang gen mã hóa cellulase; Ruminococcus flavefaciens (7 ORF) xác định lồi điển hình thuộc nhóm vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase có khả phân giải mạnh nguồn sinh khối cellulose 3.1.4 Đánh giá mức độ tương đồng trình tự axit amin suy diễn từ ORF giải mã hóa cho cellulase Dựa CSDL NR CAZy, 297 ORF hồn thiện mã hóa cellulase có độ tương đồng 85% (trình tự mới) với tỷ lệ 80,1% 77,4% Trong 148 ORF hoàn thiện mã hóa cellulase có cấu trúc module có 17 ORF hồn thiện mã hóa endoglucanase chứa module Ig trình tự mới; 131 ORF hồn thiện mã hóa cellulase chứa module FN3 có 90 trình tự chiếm 68% (89 ORF mã hóa beta-glucosidase, 01 ORF mã hóa 10 c3pzvB endoglucanase (độ tin cậy 100%), có vùng chức tách biệt rõ ràng, vùng đầu N có cấu trúc FN3 tách biệt (Hình 3.8) Mn Hình 3.8 Khảo sát vùng bảo thủ Hình 3.7 Khảo sát vùng bảo thủ SwissProt Phyre2 3.2.2 Khảo sát giá trị pI, pH trình tự chứa module FN3 Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 chứa module FN3 dự đốn hoạt động mơi trường pH axit, có khả bền 55oC có số pI tương đồng mức cao vùng chưa biết chức (X domain, module FN3) vùng hoạt tính (Egc) Chỉ số pI tồn phân tử enzyme module tương đồng giúp cho việc nghiên cứu, biểu tối ưu số điều kiện thủy phân enzyme trở lên thuận lợi 3.3 Tách dịng gen XFn3Egc 3.3.1 Phân tích tối ưu mã ba trình tự XFn3Egc Trình tự mã hóa cho endoglucanase GH5 (gen XFn3Egc) tối ưu có tỷ lệ ba có khả sử dụng tốt 97% so với 46% trước tối ưu Các mã ba tối ưu có tới 86% trình tự có mức độ phù hợp từ 91-100% so với trước tối ưu có 49% Trình tự gen trước sau tối ưu để biểu E coli mơ tả Hình 3.10 Gen XFn3Egc sau tối ưu tổng hợp nhân tạo đưa vào pET22b(+) vị trí NcoI+XhoI Vector mang gen đặt tên pET22-XFn3Egc 11 Hình 3.10 Trình tự gen XFn3Egc trước (A) sau tối ưu mã ba để biểu E coli (B) (vùng màu vàng trình tự FN3; vùng màu xanh vùng hoạt tính; chữ màu đỏ trình tự tối ưu) 12 3.3.2 Tạo vector biểu pETSUMO mang gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc Các gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc khuếch đại PCR từ khn pET22-XFn3Egc, sau cắt cặp enzyme hạn chế NcoI + XhoI nối vào vector pET22b(+) tạo vector tái tổ hợp tương ứng Các gen sau đưa vào vector biểu giải trình tự để kiểm tra đưa vào biểu E coli Tuy nhiên, lượng protein biểu thấp chủ yếu nằm pha tủa Do đó, chúng tơi chuyển gen từ vector pET22b(+) sang vector pETSUMO enzyme hạn chế NcoI XhoI Sau nối ghép, vector pET22SUMO-Fn3, pET22SUMO-Egc, pET22SUMO-Fn3Egc, pET22SUMO-XFn3Egc pET22SUMO-XFn3 biến nạp vào tế bào E coli DH10B để tách dòng gen Các khuẩn lạc biến nạp nuôi cấy môi trường LBA để chọn dòng tế bào mang plasmid tái tổ hợp Kết cắt kiểm tra enzyme giới hạn đơn lẻ, plasmid cắt mở vòng cắt cặp enzyme giới hạn gen tương ứng cắt có kích thước tính tốn Như vậy, vector biểu mang gen thiết kế thành công 3.4 Biểu gen tế bào E coli Sau khảo sát điều kiện thích hợp cho biểu hiện, tiến hành biểu chủng E coli BL21 (DE3) mang gen Fn3, Egc, Fn3Egc, XFn3, XFn3Egc mơi trường LB có bổ sung Amp, nhiệt độ biểu 25oC, nồng độ chất cảm ứng 0,5 mM IPTD, thu mẫu sau cảm ứng Kết kiểm tra điện di gel polyacrylamide cho thấy, pha tổng số loại protein biểu tốt, kích thước theo tính tốn Các gen có 13 protein biểu chủ yếu pha tan trừ gen Egc không chứa FN3 biểu protein nằm pha tủa (Hình 3.18) Kết thử hoạt tính cellulase protein tái tổ hợp biểu pha tan đĩa thạch aga-CMC cho thấy có dịch pha tan SXFn3Egc thể khả thủy phân chất CMC rõ Kết thử hoạt tính zymogram cho thấy nhuộm comassie, loại protein (SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3) khơng xử lý biến tính chạy điện di gel khơng biến tính di chuyển vị trí gel Ở gel nhuộm congo red, xuất band sáng tương tự đối chứng dương vị trí SXFn3Egc (Hình 3.19) Do đó, gen XFn3Egc biểu enzyme kích thước tính tốn thể hoạt tính rõ ràng với chất CMC Module FN3 xác định có tác dụng làm tăng tính tan vùng xúc tác Vùng X có vai trị định việc hỗ trợ cho vùng xúc tác thể hoạt tính cellulase mạnh Hình 3.18 Điện di đồ protein SFn3, SEgc, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 pha tổng số, pha tan, pha không tan biểu chủng E coli BL21 (DE3) gel polyacrylamide 12,6% có SDS Đối chứng âm pETSUMO; Marker: protein chuẩn unstained 14 (A) (B) Hình 3.19 Phân tích protein pha tan điện di khơng biến tính (A) zymogram (B); Marker: Thang protein chuẩn unstained (Thermo scientific); cellulase: Đối chứng dương (Sigma) 3.5 Tinh chế protein tái tổ hợp tái tổ hợp xác định hoạt tính 3.5.1 Tinh chế protein tái tổ hợp Các protein tái tổ hợp rửa hồn tồn đệm thu mẫu có nồng độ 400 mM imidazole Kiểm tra điện di đồ phân đoạn tinh chế protein cho thấy, gel xuất băng có kích thước tương đương với protein đích cần tinh chế Kết đánh giá độ phần mềm Quantity One cho thấy protein tái tổ hợp sau tinh chế có độ 99% Hình 3.20 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm phân đoạn tinh chế SFn3 (F1-F9) Hình 3.22 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm phân đoạn tinh chế SFn3Egc (F1-F7) 15 Hình 3.24 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm phân đoạn tinh chế SXFn3Egc (F1-F10) Hình 3.26 Điện di đồ kiểm tra sản phẩm phân đoạn tinh chế SXFn3 (F1-F8) 3.5.2 Đánh giá hoạt tính protein sau tinh chế 3.5.2.1 Đánh giá hoạt tính riêng rẽ chất CMC Kết đánh giá hoạt tính riêng rẽ chất CMC protein SFn3, SFn3Egc, SXFn3Egc, SXFn3 sau tinh chế cho thấy có SXFn3Egc SFn3Egc thể khả thủy phân chất CMC rõ Vịng hoạt tính thủy phân cellulose SXFn3Egc có kích thước lớn (hoạt tính mạnh hơn) so với SFn3Egc 3.5.2.2 Đánh giá khả SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính enzyme CMC Khi phối trộn protein chưa biết chức (SFn3, SXFn3) enzyme chứa vùng hoạt tính, khả thủy phân chất CMC hỗn hợp tăng Phối trộn SFn3 SXFn3 với SFn3Egc làm tăng hoạt tính lên 74,5% 49,9% Phối trộn SXFn3 SFn3 với SXFn3Egc hoạt tính tăng khoảng 27% (Hình 3.29) Kết cho thấy, module FN3 phối trộn có tác dụng làm tăng hoạt tính enzyme chất CMC lên đáng kể so với thử nghiệm với enzyme riêng rẽ Từ kết đưa giả thuyết module FN3 có khả phản ứng với CMC, làm tăng lực enzyme với chất 16 Hình 3.29 Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ phối trộn protein tái tổ hợp sau tinh chế chất CMC; ĐC +: Cellulase (Sigma) 3.5.2.3 Đánh giá khả SFn3, SXFn3 làm tăng hoạt tính enzyme giấy lọc Trên chất giấy lọc, SFn3 SXFn3 có khả làm cho hoạt tính SXFn3Egc tăng lên tương ứng 86,8% 13,6% so với thử nghiệm riêng rẽ có SXFn3Egc SFn3Egc phối trộn với SFn3 SXFn3 có hoạt tính tăng so với thử nghiệm phản ứng có SFn3Egc sai khác khơng có ý nghĩa thống kê Kết chứng tỏ, SFn3 SXFn3 phối trộn có tác dụng làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose enzyme chất giấy lọc Vì SFn3 SXFn3 khơng thể hoạt tính cellulase nên protein có tác dụng hỗ trợ giúp enzyme SXFn3Egc, SFn3Egc tăng khả thủy phân chất Khả làm tăng hoạt tính enzyme chất giấy lọc protein chứa module FN3 hai giả thiết sau: (1) module FN3 có khả làm nới lỏng cấu trúc cellulose tinh thể giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận dễ dàng với sợi cellulose để thực 17 phản ứng thủy phân; (2) module FN3 làm tăng lực với cellulose, giúp enzyme bám dính tốt với chất Hình 3.30 Kiểm tra hoạt tính riêng rẽ phối trộn protein sau tinh chế chất giấy lọc; ĐC +: Cellulase (Sigma) 3.5.3 Đánh giá khả FN3 tăng lực enzyme với chất 3.5.3.1 Cơ chất CMC Hoạt tính cellulase SXFn3Egc, SFn3Egc tăng chất CMC xử lý hấp phụ trước với SFn3 SXFn3 (Hình 3.31).Trên chất hấp phụ với SFn3 SXFn3, hoạt tính SXFn3Egc tăng mạnh so với SFn3Egc Hoạt tính SXFn3Egc SFn3Egc chất CMC phản ứng hấp phụ trước SFn3 tăng 31,5% 23,8% Tuy nhiên, hoạt tính enzyme chất CMC hấp phụ với SXFn3 tăng 7,3% 5,9% Như vậy, SFn3 SXFn3 có khả thúc đẩy phản ứng enzyme với chất lên rõ rệt thông qua việc làm tăng lực enzyme lên chất CMC Quan sát hình dạng băng protein gel khơng biến tính sau phản ứng có chất CMC, SFn3 SXFn3 thể khả liên kết, phản ứng với chất CMC SFn3 SXFn3 có khả làm tăng lực enzyme với chất, làm cho phản 18 ứng diễn mạnh so với phản ứng có enzyme SXFn3Egc phối trộn với SFn3 phản ứng hết với chất CMC khơng cịn quan sát rõ gel so với phối trộn với SXFn3 (Hình 3.32) Điều giải thích lý enzyme phối trộn với SFn3 thường cho có hiệu thủy phân chất tốt so với phối trộn với SXFn3 Hình 3.31 Đánh giá vai trò SFn3 SXFn3 hấp phụ chất CMC đến hoạt tính SFn3Egc SXFn3Egc Hình 3.32 Kiểm tra khả SFn3, SXFn3 làm tăng lực enzyme với chất CMC; M: Thang protein chuẩn (Thermo Scientific) 19 3.5.3.2 Cơ chất giấy lọc Kết đánh giá khả hấp phụ SFn3 SXFn3 làm tăng lực enzyme chất giấy lọc cho thấy hoạt tính SXFn3Egc tăng chất hấp phụ trước với SFn3 SXFn3 Khi thử nghiệm hấp phụ SFn3 với giấy lọc, SXFn3Egc có hoạt tính mạnh so với xử lý hấp phụ trước với SXFn3 (Hình 3.33) Tuy nhiên, hoạt tính SFn3Egc giấy lọc hấp phụ SFn3 SXFn3 không khác nhiều so với giấy lọc không xử lý hấp phụ Từ kết cho thấy, SFn3 SXFn3 có q trình hấp phụ bề mặt giấy lọc (đặc biệt SFn3) làm tăng hoạt tính SXFn3Egc Hình 3.33 Đánh giá vai trị SFn3 SXFn3 hấp phụ chất giấy lọc đến hoạt tính protein SFn3Egc, SXFn3Egc; FP: Giấy lọc (Whatman No 1) 3.5.3.3 Đánh giá khả nới lỏng cấu trúc tinh thể bề mặt giấy lọc Trên ảnh chụp bề mặt giấy lọc độ phóng đại 500 lần 1000 lần quan sát thấy sợi cellulose nới lỏng khơng cịn liên kết chặt chẽ với sợi lân cận so với đối chứng âm mẫu không xử lý với SFn3 SXFn3 (Hình 3.34) Ở độ 20 phóng đại 5000 lần, mẫu giấy lọc xử lý với FN3, bề mặt sợi cellulose phát khơng cịn nhẵn, trơn mẫu không xử lý Như vậy, SFn3 SXFn3 có tác động làm nới lỏng bề mặt giấy lọc giúp cho phản ứng thủy phân chất enzyme thực dễ dàng Hình 3.34 Ảnh SEM cấu trúc bề mặt sợi cellulose giấy lọc (Whatman No 1) không xử lý SFn3 SXFn3 (hàng 1), xử lý với SFn3 (hàng 2), xử lý với SXFn3 (hàng 3) độ phóng đại 500 lần (dãy A), 1000 lần (dãy B) 5000 lần (dãy C) 3.5.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH lên hấp phụ SFn3 SXFn3 với chất Để nghiên cứu tăng khả hấp phụ FN3 lên chất giấy lọc, qua làm tăng hoạt tính thủy phân cellulose enzyme, đánh giá ảnh hưởng pH, nhiệt độ tới hấp phụ Phản ứng hấp phụ SFn3 SXFn3 với chất giấy lọc xác định hiệu điều kiện pH4, sau giảm dần pH6 pH8 Hiệu thủy phân cellulose SXFn3Egc SFn3Egc mạnh SFn3 SXFn3 hấp phụ với chất giấy lọc nhiệt độ 40oC 60oC so với thực nhiệt độ 20oC 21 3.6 Đánh giá số tính chất enzyme SXFn3Egc 3.6.1 Ảnh hưởng pH Hoạt tính tối ưu SXFn3Egc đạt cao pH Enzyme thể hoạt tính mạnh pH phản ứng nằm khoảng từ 35; pH pH 5, hoạt tính enzyme đạt khoảng 80% so với pH Enzyme có hoạt tính yếu giảm dần pH từ đến 3.6.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Trong khoảng nhiệt độ từ 30 oC đến 60oC, enzyme có mức độ hoạt động khác nhau: Từ 30oC đến 40oC, hoạt tính enzyme tăng dần đạt cao 40 oC; 45oC đến 50oC, enzyme thể hoạt tính mạnh (đạt từ 84-88% so với hoạt tính nhiệt độ tối ưu) Tuy nhiên, hoạt tính SXFn3Egc giảm dần nhiệt độ 55-60oC 3.6.3 Đánh giá độ bền nhiệt SXFn3Egc có hoạt tính cịn lại cao sau ủ 30 phút giảm dần sau 60 phút đến 90 phút khoảng nhiệt độ thử nghiệm từ 30oC đến 60oC 3.6.4 Ảnh hưởng số ion kim loại, hóa chất Kết đánh giá ảnh hưởng số ion kim loại (Ca 2+ 2+ + 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ , 3+ Mg , Ni , K , Co , Cu , Mn , Zn , Fe ) loại hóa chất thường sử dụng SDS (1%), urea (1 µM), 2-mercaptoethanol (1 µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X-100 (1 µM) cho thấy có Mn2+ nồng độ 10 mM làm tăng hoạt tính enzyme không đáng kể (108%) Khi tăng nồng độ Mn 2+ lên 20 mM, 30 mM, 40 mM hoạt tính tương đối enzyme tăng tương ứng so với đối chứng 202%, 215%, 222% 3.6.5 Đặc điểm động học XFn3Egc Kết động học enzyme SXFn3Egc xác định có giá trị Km đạt 1,26 mg/ml Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml 22 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ liệu gồm 816 ORF mã hóa cellulase hệ vi khuẩn cỏ dê Việt Nam xác định trình tự thuộc 11 họ GH khác (GH1, 3, 5, 8, 9, 16, 44, 48, 64, 74, 94) giải chủ yếu có hoạt tính beta-glucosidase họ GH3 endoglucanase họ GH5, GH8, GH9 Các trình tự xác định có nguồn gốc chủ yếu thuộc ngành Bacteroidetes Firmicutes với loài chiếm ưu Bacteroides uniformis, Prevotella buccae Đã xác định 243 ORF (148 ORF hồn thiện) mã hóa cellulase có cấu trúc module, chứa module Ig FN3 Trong đó, 100% endoglucanase GH9 có chứa module Ig (17 ORF) Trong tổng số 131 ORF hồn thiện mã hóa cellulase chứa module FN3 phát tới 99,2% module FN3 kèm với module xúc tác betaglucosidase GH3 có module FN3 kèm với endoglucanase GH5 Cấu trúc endoglucanase GH5 chứa module FN3 cấu trúc phát nghiên cứu Đã tổng hợp biểu trình tự mã hóa cellulase GH5 (XFn3Egc) cấu trúc chứa module khác (Fn3, XFn3, Fn3Egc, Egc) E coli để nghiên cứu vai trò module FN3 cấu trúc enzyme Module FN3 xác định có khả làm tăng tính tan ổn định cấu trúc vùng xúc tác enzyme, nới lỏng cấu trúc cellulose tinh thể bề mặt giấy lọc, giúp enzyme tiếp cận chất tốt Module FN3 làm tăng lực enzyme lên chất CMC 23 Enzyme SXFn3Egc hoạt động tối ưu 40 oC, pH Enzyme ổn định bền 60oC 90 phút Các thông số động học enzyme Km đạt 1,26 mg/ml Vmax đạt 148,12 µmol/min/ml Hoạt tính endoglucanase SXFn3Egc tăng lên lần sử dụng 40 mM Mn 2+ giảm bổ sung ion Ca 2+, Mg2+, Ni2+, K+, Co2+, Cu2+, Zn2+, Fe3+ với nồng độ cuối 10 mM loại hóa chất thường sử dụng SDS (1%), urea (1 µM), 2mercaptoethanol (1 µM), EDTA (1 µM), tween 80 (1mM), triton X100 (1 µM) KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu đánh giá vai trò module FN3 module chưa rõ chức khác Ig, X cấu trúc cellulase có cấu trúc module để tiến tới sản xuất hỗn hợp enzyme phù hợp với loại loại chất mục đích sử dụng nhằm ứng dụng xử lý môi trường sản xuất nhiên liệu sinh học 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Trương Nam Hải, Xây dựng probe để khai thác chọn gen mã hoá cho beta-glucosidase GH1 từ liệu giải trình tự DNA metagenome cỏ dê, Tạp chí Y học Việt Nam, 2017, 458, 190-197 Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Nguyễn Thị Minh Thu, Lưu Hàn Ly, Lê Tùng Lâm, Phùng Thị Lan, Trương Nam Hải, Khai thác gen mã hóa cho cellobiose phosphorylase GH94 từ liệu DNA metagenome cỏ dê biểu gen Celp1 E coli, Tạp chí phân tích Hóa, Lý Sinh học, 2018, 23, 75-82 Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Đỗ Thị Huyền, Nguyễn Hữu Đức, Vũ Thị Ly, Trương Nam Hải, Xây dựng probe để khai thác chọn gen mã hóa beta-glucosidase GH3 từ liệu DNA metagenome cỏ dê, Tạp chí KH&CN nhiệt đới, 2018, 15, 50-58 N K H Viet, N T Thao, T N Hai, D T Huyen, Application of bioinformatic tools for prediction of active pH and temperature stability of endoglucanases based on coding sequences from metagenomic DNA data, Biological Forum – An International Journal, 2019, 11(2), 14-20 N K H Viet, D T Khoa, N H Duong, N K Hai, N T Quy, N T Tien, N T M Phuong, T N Hai, D T Huyen, Some characters of bacterial cellulases in goat rumen elucidated by metagenomic DNA analysis and the role of fibronectin module for endoglucanase function, Asian-Australasian Association of Animal Sciences, 2020 (SCIE, reviewed) Nguyễn Thị Quý, Nguyễn Hồng Dương, Đào Trọng Khoa, Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Nguyễn Khánh Hải, Trương Nam Hải, Đỗ Thị Huyền, Lựa chọn điều kiện tinh chế endoglucanase tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn cỏ dê tế bào Escherichia coli, Tạp chí Sinh học, 2020, 42 (1): 73-81 Nguyễn Khánh Hoàng Việt, Hà Thị Thúy Hoa, Trương Nam Hải, Đỗ Thị Huyền, Đánh giá ảnh hưởng số kim loại hóa chất đến hoạt tính endoglucanase GH5 khai thác từ liệu DNA metagenome vi khuẩn cỏ dê, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2020, (Chấp nhận đăng) ... module cấu trúc enzyme thủy phân cellulose từ khu hệ vi sinh vật cỏ dê? ?? Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu đánh giá đa dạng cellulase cellulase có cấu trúc module từ khu hệ vi sinh vật cỏ dê kỹ... giá đa dạng trình tự cellulase có cấu trúc module, tìm cấu trúc module đặc thù cho nghiên cứu vai trị module đến hoạt tính enzyme Do đó, thực Luận án: ? ?Nghiên cứu đánh giá đa dạng vai trò số module. .. kết dạng ±SE (Standard Error) 7 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đánh giá đa dạng GH cấu trúc module cellulase suy diễn từ 816 khung đọc mở 3.1.1 Đánh giá đa dạng cấu trúc họ GH cellulase Từ 816