BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGÔ DIỄM NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, KIỂU GEN CỦA BỆNH HbH VÀ CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH BỆNH  THALASSEMIA Chuyên ngành: Y sinh học - Di truyền Mã số: 62.72.01.11 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2018 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Thị Thanh Hương TS Dương Bá Trực Phản biện 1: PGS.TS Trần Văn Khoa Phản biện 2: PGS.TS Trần Minh Điển Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Hà Thanh Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Y Hà Nội Vào hồi 14h ngày tháng năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội ĐẶT VẤN ĐỀ Tính cấp thiết đề tài Bệnh α-thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, đặc trưng suy giảm thiếu hụt tổng hợp chuỗi α globin phân tử Hemoglobin Bệnh thuộc nhóm bệnh di truyền phổ biến nhất, nguyên nhân gây thiếu máu tan máu hàng đầu trẻ em, với khoảng 5% dân số giới người mang gen bệnh Bệnh Hemoglobin H thể trung gian bệnh α-thalassemia, ba bốn gen α globin bị đột biến Trẻ mắc bệnh HbH thường có thiếu máu tan máu, phải phụ thuộc truyền máu, gây hậu nghiêm trọng cho hàng loạt quan thể Nếu không điều trị, trẻ mắc HbH thể nặng thường tử vong sớm, muộn biến chứng bệnh Hội chứng phù thai Hb Bart’s thể nặng bệnh αthalassemia, đột biến hoàn toàn bốn gen α globin, gây thiếu máu nặng, dẫn đến suy tim, tràn dịch đa màng, phù toàn thân, thường chết lưu khoảng từ 28-40 tuần, tử vong vài đầu sau sinh Ngoài ra, hội chứng phù thai Hb Bart’s làm tăng nguy nhiễm độc thai nghén tiền sản giật biến chứng sản khoa khác cho sản phụ Tại Việt Nam, từ năm 1985, bệnh α-thalassemia bắt đầu nghiên cứu Từ năm 2008 đến 2010, phân tích gen α-globin bắt đầu tiến hành Xác định đột biến gây bệnh, mối liên quan kiểu gen kiểu hình bệnh α-thalassemia, đóng vai trị quan trọng vấn đề tiên lượng mức độ nặng bệnh đưa định điều trị, theo dõi phù hợp Đặc biệt, phân tích kiểu gen sở thiết yếu cho tư vấn di truyền cho cặp vợ chồng người mang gen bệnh chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia Đây xem biện pháp hiệu cần thiết để phòng bệnh Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu vấn đề Việt Nam trước 2 Mục tiêu đề tài - Phát số đột biến gen α globin bệnh nhân thalassemia bằng kỹ thuật PCR, MLPA giải trình tự gen Sanger - Nhận xét biểu lâm sàng kiểu gen bệnh nhân mắc HbH - Chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia bằng kỹ thuật sinh học phân tử từ tế bào ối Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Bệnh HbH có kiểu hình kiểu gen đa dạng Nhiều người bệnh HbH có sống bình thường khía cạnh, khơng chẩn đốn phát bệnh thời điểm trưởng thành Tuy nhiên, có trường hợp bệnh HbH xuất triệu chứng từ sớm, biến chứng bệnh đe doạ đến tính mạng người bệnh không điều trị Trước đây, bệnh HbH phân loại nhóm bệnh thể nhẹ, nghiên cứu gần cho rằng bệnh HbH thường có biểu lâm sàng phức tạp mơ tả trước Mối liên quan kiểu gen kiểu hình bệnh HbH khẳng định nhiều nghiên cứu nhiều quần thể khác giới Những nghiên cứu ghi nhận, loại đột biến gen  globin có ảnh hưởng đến mức độ nặng bệnh Đột biến đoạn thường gây nhóm HbH có biểu lâm sàng nhẹ Tuy nhiên, quốc gia phát triển, chẩn đoán phân tử chưa thực cách thường quy việc tiên lượng bệnh HbH chưa quan tâm cách rõ ràng, nghiên cứu mối tương quan kiểu gen kiểu hình bệnh HbH chưa thực cách hệ thống rộng rãi Trong nghiên cứu này, sàng lọc đột biến thường gặp bằng kỹ thuật PCR Đây kỹ thuật đơn giản, thực nhanh chóng, an tồn cho phép nhận định kết cách rõ ràng xác, với chi phí hợp lý Tuy nhiên, phạm vi phát kỹ thuật PCR khu trú đột biến thường gặp Nếu bệnh nhân mang đột biến nằm ngồi nhóm này, tuỳ theo chất đột biến cịn lại đột biến 0 hay +-thalassemia, mà tiếp tục lựa chọn kỹ thuật MLPA giải trình tự gen để phân tích, cho phép kiểm chứng đột biến biết phát đột biến chưa biết Chúng phát số đột biến gặp phát bằng hai kỹ thuật Nhờ việc áp dụng thành công kỹ thuật nói trên, bệnh nhân HbH chẩn đoán xác định bệnh thể bệnh, chẩn đốn sớm, đóng vai trị quan trọng điều trị, tiên lượng, tư vấn quản lý bệnh Ngoài ra, nghiên cứu cịn cơng bố đột biến gặp, làm phong phú hiểu biết đột biến gây bệnh bệnh nhân -thalassemia Việt Nam Đây sở cho chẩn đoán xác định người mang gen bằng phân tích gen  globin, tiến đến tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh, đặc biệt cho trường hợp có nguy sinh mắc -thalassemia thể nặng Cấu trúc luận án: Luận án trình bày 150 trang (khơng kể tài liệu tham khảo phần phụ lục) Luận án chia làm phần: - Đặt vấn đề: trang - Chương 1: Tổng quan tài liệu 33 trang - Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 20 trang - Chương 3: Kết nghiên cứu 39 trang - Chương 4: Bàn luận 53 trang - Kết luận: trang - Kiến nghị: trang Luận án gồm 62 bảng, 12 biểu đồ 40 hình sơ đồ Sử dụng 147 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt, tiếng Anh Phần phụ lục gồm: Danh sách bệnh nhân nghiên cứu, mẫu bệnh án nghiên cứu, kỹ thuật tách chiết DNA, đặc điểm huyết học đột biến gia đình có kiểu gen ( SEA/-αc.2delT), có đột biến gặp, có mắc Hb Bart’s sống sau sinh Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa, thuật ngữ chế bệnh sinh Bệnh α-thalassemia bệnh thiếu máu tan máu di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, giảm hẳn tổng hợp chuỗi α globin phân tử Hb Sự suy giảm tổng hợp dẫn đến tăng tổng hợp mức chuỗi β globin tạo phân tử γ 4, gọi Hb Bart’s (trong thời kỳ bào thai), β4, gọi HbH (trong thời kỳ trưởng thành) Người bình thường có hai gen α globin nằm NST 16, có tổng số bốn gen α globin hai NST 16 tương đồng (αα/αα) Tùy theo số lượng gen α bị đột biến, tùy theo kết hợp đa dạng dạng allen đột biến khác bệnh α-thalassemia, gây biểu lâm sàng nhiều mức độ khác Có gen α globin, α1 α2, với tổng chiều dài khoảng từ đến 2kb Mỗi gen gồm exon, introns - IVS Gen α1 α2 có chiều dài 850bp, mã hóa cho chuỗi α globin gồm 141 acid amin, thành phần cấu tạo nên phân tử Hb thể Bệnh α-thalassemia đột biến gen α globin gây nên 90% bệnh αthalassemia đột biến đoạn gen hai gen α globin Ngồi ra, có 10% không đột biến đoạn gen, mà thường đột biến điểm gen α globin gây nên Các đột biến đoạn không đoạn tạo allen đột biến dạng α0 α+-thalassemia Trong đó, allen α0-thalassemia loại đột biến đoạn hai gen α globin gây nên, allen α+-thalassemia đoạn gen α globin, đột biến khơng đoạn, hay cịn gọi đột biến điểm gây nên Loại allen Mô tả Đột biến Đột biến gen  Allen 0- thalassemia SEA, MED, nhiễm sắc thể dẫn đến THAI, FIL ( ) không tổng hợp chuỗi  globin Đột biến gen  -3.7, -4.2, Allen +-thalassemia nhiễm sắc thể dẫn đến giảm -HbCs, -HbQs (-) (T) tổng hợp chuỗi  globin 1.2 Biểu lâm sàng liên quan đến đột biến gen Tùy vào kết hợp khác hai dạng allen đột biến α0 + α -thalassemia, tạo kiểu hình α-thalassmia khác Bệnh αthalassemia chia thành thể tùy theo số lượng gen α globin bị đột biến, với biểu lâm sàng phong phú khác thể bệnh Người mang gen α+-thalassemia, đột biến gen α globin (/), khơng có triệu chứng lâm sàng công thức máu, nên phân biệt với người bình thường Phân tích gen  globin cho phép chẩn đoán xác định Người mang gen α0-thalassemia, đột biến hai gen α globin, gồm thể: ( /) (-/-) Thể nhẹ, thường khơng có triệu chứng lâm sàng, có thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc mức độ từ nhẹ đến trung bình, với MCV MCH giảm công thức máu Bệnh HbH thể có triệu chứng, đột biến gen α globin, gồm thể đoạn ( /-) thể không đoạn ( /T) Bệnh nhân thường có thiếu máu (2,6-13,3g/dl), có lách to, vàng da, biến dạng xương nhiều mức độ khác Hội chứng phù thai Hb Bart’s thể bệnh nặng αthalassemia, đột biến hoàn toàn gen α globin, gây suy giảm hoàn toàn khả sản xuất chuỗi α globin Thai mắc Hb Bart’s có phù nề, suy tim thiếu máu kéo dài từ giai đoạn thai tử cung Hầu hết thường tử vong giai đoạn thai sau sinh Kiểu hình Gen 1 2 Bình thường gen hoạt động Mang gen α+-thalassemia Mang gen α0-thalassemia (Cis) Mang gen α0-thalassemia (Trans) HbH thể đoạn HbH thể không đoạn Hb Bart’s Dị hợp tử +-thal Dị hợp tử 0-thal Đồng hợp tử +-thal Dị hợp tử kép 0-+thal Dị hợp tử kép 0-+thal Đồng hợp tử 0-thal Kiểu gen (/ ) (-/) ( /) (-/-) ( /-) ( /T) ( / ) 1.3 Biểu cận lâm sàng bệnh α-thalassemia Xét nghiệm huyết học sử sụng để phát người bệnh sàng lọc người mang gen bệnh α-thalassemia, cho phép đánh giá tình trạng thiếu máu (Hb giảm), hồng cầu nhỏ (MCV giảm), nhược sắc (MCH giảm) Tuy nhiên xét nghiệm khơng đặc hiệu khơng có giá trị chẩn đốn xác định Phân tích thành phần Hb sử dụng để phân tích thành phần Hb bất thường, đặc biệt người mắc HbH, có HbA2 thường giảm rõ rệt, ngồi cịn thấy xuất HbH 0,8-40% Phân tích gen  globin cho phép xác định đột biến gen gây bệnh Tuỳ theo loại đột biến điểm hay đột biến đoạn, đột biến biết hay chưa biết mà có lựa chọn kỹ thuật phù hợp, ARMS-PCR, REPCR, GAP-PCR, MLPA, Strip Assays, giải trình tự gen Sanger 1.4 Sàng lọc chẩn đoán trước sinh bệnh α-thalassemia Hiện chưa có biện pháp điều trị đặc hiệu bệnh α-thalassemia Hầu hết thai mắc α-thalassemia thể nặng (Hb Bart’s) phù, chết lưu giai đoạn tháng cuối thai kỳ, tử vong sớm sau sinh Trẻ mắc HbH thể nặng phải phụ thuộc truyền máu thải sắt suốt đời, thường tử vong sớm biến chứng truyền máu Mục tiêu chương trình sàng lọc bệnh -thalassemia hạn chế tỷ lệ sinh mắc bệnh Hb Bart’s, HbH thể nặng Thời điểm sàng lọc tốt trước sinh trước mang thai Tất sản phụ sàng lọc bằng xét nghiệm công thức máu điện di Hb, có bất thường sàng lọc thêm người chồng Nếu cặp vợ chồng người có tiền sử sinh bệnh HbH, có thai bị phù, thuộc nhóm nguy cao sinh mắc -thalassemia Họ cần xét nghiệm phân tích gen  globin để xác định người mang gen bệnh, để tư vấn di truyền chẩn đoán trước sinh Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu cỡ mẫu Thu thập tất bệnh nhân trẻ em người lớn, đủ tiêu chuẩn nghiên cứu Bệnh Viện Nhi Trung Ương (BVNTW) từ 1/2012 đến tháng 12/2016, bao gồm: - 299 bệnh nhân trẻ em người lớn nghi ngờ mắc  thalassemia lâm sàng, với tiêu chuẩn: Tan máu, thiếu máu hồng cầu nhỏ nhược sắc Hb 2,6-13,3g/dl; MCVCAA codon142 gen 2 CTG>CCG codon 125 gen 2 ATG>A-G codon ATG gen 2 AGG>AAG codon 31 gen 2 TAA>TAT codon TAA gen 2 GAG>GAT codon 27 gen 1 Tổng số Kiểu đột biến SEA/αα -α3.7/ -α4.2/ -1/ -αHbCs/ -αHbQs/ -αc.2delT/ -αc.92 G>A/ -αc.426 A>T/ -α c.81G>T/ Số allen 194 42 18 106 12 2 388 % 50 10,8 4,6 0,5 27,3 2,1 3,1 0,5 0,5 0,5 100 Nhận xét: Allen SEA/αα chiếm tỷ lệ cao 50% Tiếp theo đến allen -αHbCs/ 27,8% allen -α3.7/ 10,8% 3.2 Mối liên hệ đặc điểm lâm sàng kiểu gen bệnh HbH 14 Chúng chẩn đoán xác định 97 bệnh nhân mắc bệnh HbH bằng kỹ thuật sinh học phân tử Dựa vào kết phân tích đột biến gen  globin, bệnh nhân HbH chia thành nhóm nghiên cứu - Nhóm HbH có đột biến đoạn ( /-): 31/97 (31,9%) - Nhóm HbH có đột biến khơng đoạn ( /-T): 66/97 (68%) 15 Bảng 3.31 Một số đặc điểm lâm sàng huyết học bệnh HbH Đặc điểm Bệnh HbH P T ( /-α)(31) ( /-α )(66) (N=97) Số lần truyền máu/năm 0,27 ± 0,76 3,2 ± 4,0 < 0,001 Tuổi vào viện 10,58  12,3 6,1  5,8 0,048 Mức độ thiếu máu 24,3% 75,7% 0,004 Gan - cm bờ sườn 22,5% 39,3% 0,001 Gan ≥3 cm bờ sườn 6,4% 31,8% Lách - cm bờ sườn 12,9% 34,8% 17,28pg), MCHC thấp (28,51%6,4%) xuất có Hb Bart’s Những khác biệt kể có ý nghĩa thống kê với p( SEA/-αc.2delT)>( SEA/-HbQs)>( SEA/-4.2)>( SEA/-3.7) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với pA (0,5%), -αc.426 A>T (0,5%) tạo Hb Pakse, -α c.81G>T (0,5%) tạo Hb Hekinan Xác định kiểu gen bệnh HbH: SEA/-αHbCs (54,6%); SEA/-α3.7 (21,6%); SEA/-α4.2 (9,2%); SEA/-αc.2delT (6,1%); SEA/-αHbQs (4,1%); SEA/-α1 (1%); SEA/-αc.92 G>A (1%); SEA/-α c.426 A>T (1%), SEA/-α c.81G>T (1%) Lần phát trường hợp bệnh nhân mắc bệnh Hb Bart’s kiểu gen ( SEA/ SEA), tuổi, phụ thuộc truyền máu Mối liên hệ kiểu gen kiểu hình bệnh HbH Bệnh HbH có mối liên quan chặt chẽ kiểu gen kiểu hình Dựa kiểu gen, 97 bệnh HbH chia thành thể: 31,9% thể đoạn gen ( /-), 68,1% thể không đoạn gen ( /-T) 23 HbH thể khơng đoạn gen có biểu lâm sàng nặng thể đoạn gen ( /-T) > ( /-) (p ( SEA/-HbQs) > (-SEA /-4.2) > ( SEA/-3.7) Chẩn đoán trước sinh bệnh -thalassemia Sàng lọc người mang gen -thalassemia cho 341 cặp vợ chồng có thai bị phù bằng MCV