BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THỊ NGỌC ÁNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH TAY CHÂN MIỆNG VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ VÙNG GEN VP1 CỦA EV-A71, CVA16 & CV-A6 LƯU HÀNH TẠI HÀ NỘI, NĂM 2015-2018 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC HÀ NỘI, 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI TRẦN THỊ NGỌC ÁNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH TAY CHÂN MIỆNG VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ VÙNG GEN VP1 CỦA EV-A71, CVA16 & CV-A6 LƯU HÀNH TẠI HÀ NỘI, NĂM 2015-2018 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số : 60720115 LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1.TS.BS Nguyễn Thị Kiều Anh 2.TS.BS Phạm Hồng Nhung HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng người học trò, em xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Kiều Anh, TS Phạm Hồng Nhung hướng dẫn tận tình, giúp đỡ chia sẻ khó khăn em suốt trình học tập nghiên cứu để thực đề tài Sự hướng dẫn tận tình kiến thức q báu đóng vai trị vơ quan trọng trình học tập, nghiên cứu khoa học để em hoàn thành luận văn Em xin gửi cám ơn toàn thể anh chị nhân viên, kỹ thuật viên khoa Xét nghiệm- Chẩn đoán hình ảnh & Thăm dị chức năng, Trung tâm Kiểm soát Bệnh tật Thành phố Hà Nội, TS Trần Thị Nguyễn Hòa anh chị - Khoa Vi rút đường ruột Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương giúp đỡ nhiệt tình, tạo điều kiện mặt trình thực luận văn Em xin cảm ơn tập thể thầy cô, chị kỹ thuật viên giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên em trình học tập thực luận văn Em xin cám ơn Ban Giám Hiệu, phòng Đào tạo Sau đại học, phòng ban chức Trường đại học Y Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành luận văn Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người thân gia đình bạn bè ln ủng hộ em suốt q trình làm đề tài Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019 Trần Thị Ngọc Ánh LỜI CAM ĐOAN Tôi Trần Thị Ngọc Ánh, cao học khóa 26, trường đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh y học Tôi xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Thị Kiều Anh TS Phạm Hồng Nhung Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin cam đoan điều trình bày hồn tồn trung thực xác Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2019 Trần Thị Ngọc Ánh MỤC LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT aa ADN ARN CV-A CV-B E EV IC IFA KSBT Nt PTN PV QĐ RT PCR rRT-PCR SHPT TCM TTYT UTR VP VRĐR VSDTTW Acid amin Acid Deoxyribose Nucleic Acid Ribonucleic Coxsackievirus A Coxsackievirus B Echovirus Enterovirus Intenal control Indirect Fluorescent Assa Kiểm sốt bệnh tật Nucleotide Phịng thí nghiệm Poliovirus Quyết định Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Realtime Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Sinh học phân tử Tay chân miệng Trung tâm Y tế Vùng không dịch mã Viral protein Vi rút đường ruột Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương DANH MỤC BẢNG DANH MỤC BIỂU ĐỒ DANH MỤC HÌNH 10 ĐẶT VẤN ĐỀ Tay Chân Miệng (TCM) bệnh truyền nhiễm lây từ người sang người, dễ gây thành dịch Từ năm 90 kỷ XX, bệnh xuất phổ biến nhiều quốc gia giới số nước khu vực [1] Biểu đặc trưng bệnh tổn thương da, niêm mạc dạng nước niêm mạc miệng, lịng bàn tay, lịng bàn chân, mơng, gối Bệnh lây chủ yếu theo đường tiêu hóa, hay gặp trẻ em tuổi Nguồn lây từ nước bọt, nước phân trẻ nhiễm bệnh Hiện nay, bệnh TCM chưa có vắc xin phịng bệnh thuốc điều trị đặc hiệu Phần lớn trường hợp bệnh TCM diễn biến tự khỏi, nhiên xuất số biến chứng nguy hiểm viêm não - màng não, viêm tim, phù phổi cấp dẫn đến tử vong không phát sớm xử trí kịp thời Những biến chứng thường liên quan đến tác nhân gây bệnh Bệnh số vi rút đường ruột (Enterovirus) gây ra, tác nhân gây dịch bệnh trội Coxsackievirus A16 (CV-A16), Enterovirus type 71 (EV-A71) gần Coxsackievirus A6 (CVA6) Coxsackievirus A10 (CV-A10) [1], [2] Tình hình dịch bệnh tay chân miệng có dấu hiệu gia tăng nước khu vực Châu Á Thái Bình Dương, có Việt Nam khoảng 10 năm gần Bộ Y tế đưa bệnh TCM vào hệ thống giám sát bệnh truyền nhiễm từ năm 2011 Bệnh TCM phát lần đầu khu vực miền Nam Việt Nam kể từ năm 2003 bùng phát dịch năm 2005 [3] Ở miền Bắc Việt Nam, bệnh xác định năm 2008 qui mô nhỏ rải rác 10 tỉnh miền Bắc Một nghiên cứu tỉnh phía Bắc năm 2012, kết có 51.618 trường hợp mắc bệnh bệnh xuất tất tỉnh/ thành miền Bắc, Hải Phịng, Hà Nội, Thanh Hóa có số mắc cao với 3.000 trường hợp mắc/tỉnh [4], tác nhân ghi nhận EV-A71, CVA16, CV-A6, CV-A10 [5] Vài năm gần đây, Hà Nội nằm địa phương có số mắc TCM cao khu vực phía Bắc với hàng nghìn trường hợp mắc năm Từ năm 2011 đến Phụ lục 3C QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTERO VI RÚT VÀ EV-71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG BẰNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR SOP.KXN.XN.MSP.041 Lần ban hành: 1.0 Trang: 148/162 - Ethanol hãng Merck 11 An toàn - Thực Mix phản ứng PCR phòng chuyên để pha mix phản ứng - Thực tách chiết ARN phòng xử lý mẫu đạt ATSH cấp II - Thực khuyêch đại ARN phòng PCR - Mặc quần áo bảo hộ, đội mũ, đeo trang, đeo kính bảo hộ mắt, mang găng tay cao su suốt trình thực xét nghiệm mẫu bệnh phẩm - Các thao tác trình thực kỹ thuật cần tránh tạo khí dung sử dụng pipet, mở nắp ống nghiệm đựng mẫu xét nghiệm sử dụng máy ly tâm mẫu bệnh phẩm - Tuân thủ nội quy, quy định an tồn sinh học u cầu phịng xét nghiệm PCR 12 Các bước thực hiện/ Nội dung quy trình 8.1 Lấy mẫu bệnh phẩm - Lấy mẫu bệnh phẩm dịch ngốy họng: mục 8.1.3.1 quy trình SOP.KXN.XN.MSP.001 - Lấy mẫu bệnh phẩm dịch nốt phỏng: muc 8.1.1 quy trình SOP.KXN.XN.MSP.001 - Lấy mẫu bệnh phẩm phân: mục 8.1.2 quy trình SOP.KXN.XN.MSP.001 8.2 Xử lý mẫu bệnh phẩm 8.2.1 Bệnh phẩm phân - Mẫu bảo quản 4oC -20oC lấy ra, để đến nhiệt độ phòng - Gạt khoảng 2g mẫu vào ống Falcon 50 ml Sau bổ sung 10ml dung dịch PBS 1X, 5-10 hạt thuỷ tinh Vặn chặt nắp ống, dán Parafilm kín nắp ống Phụ lục 3C QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTERO VI RÚT VÀ EV-71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG BẰNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR SOP.KXN.XN.MSP.041 Lần ban hành: 1.0 Trang: 149/162 - Lắc ống máy lắc (800 vòng/phút) 20 phút nhiệt độ phòng - Sau lắc, lấy ống ra, ly tâm 4000 vòng/phút 20 phút oC - Hút 1ml dịch vào ống tube 1,5 ml, dán mã số bảo quản -20 oC 8.2.2 Bệnh phẩm dịch ngoáy họng, dịch nốt - Mẫu bảo quản 40C -200C lấy ra, để đến nhiệt độ phòng - Lắc ống máy lắc (800 vòng/phút) 20phút nhiệt độ phòng - Hút 1ml dịch vào ống tube 1,5 ml, dán mã số bảo quản -200C 8.3 Pha mix - Số lượng mix (n) : Số mẫu cần XN + (gồm mẫu chứng dương + mẫu chứng âm) Thành phần phản ứng (µl) n phản ứng (µl) Super Mix 19 1.5 x n Enzyme Mix 2xn RNA mẫu Tổng lượng phản ứng 25 8.4 Tách chiết: Theo quy trình SOP.KXN.XN.MSP.021 8.5 Chạy máy realtime-PCR 8.5.1 Chuẩn bị mẫu chạy máy Bước 1: Ghi mã mẫu lên tube effendorg 0.2ml, ghi mã số mẫu vào biên xét nghiệm BM.SOP.KXN.XN.MSP.023.01 Bước 2: Chia hỗn hợp sinh phẩm chuẩn bị theo bảng 8.3 vào tube chuẩn bị bước Bước 3: Bổ sung thể tích ARN vào hỗn hợp sinh phẩm chuẩn bị bước Chạy máy Phụ lục 3C QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTERO VI RÚT VÀ EV-71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG BẰNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR SOP.KXN.XN.MSP.041 Lần ban hành: 1.0 Trang: 150/162 Bật máy, chọn chương trình 7500 Software 2.3 Vào New Experiment - Đặt tên cho thí nghiệm mục Experiment Properties - Vào Plate Setup để cài đặt: Thiết lập chu kì phản ứng, mục Add Target chọn kênh tương ứng màu kênh: Quencher CV-A6 Kênh FAM BHQ1 + Trong mục Add Sample, thêm tên mẫu tùy ý, chọn màu cho mẫu Trong mục Run Method, đặt chu kì luân nhiệt sau: Stage Số vòng Thời gian Nhiệt độ Hold 30 phút 50 oC Hold 10 phút 95 oC 10s 95 oC 40s 55 oC Phản ứng khuếch đại (Amplification) 45 Chọn đọc tín hiệu bước thứ vịng ln nhiệt ( bước 55oC 40 giây) Lưu chu trình vào máy Ghi mã số mẫu vào biên xét nghiệm BM.SOP.KXN.XN.MSP.041.01 Chuẩn bị strip đặt lên giá, đậy nắp strip Chia hỗn hợp sinh phẩm chuẩn bị theo bảng vào giếng strip chuẩn bị đẩy lên giá tích lạnh Bổ sung 5µl thể tích ARN chứng mẫu bệnh phẩm vào hỗn hợp sinh phẩm chuẩn bị, ly tâm nhanh giữ giá tích lạnh Chú ý: Nếu chưa chạy nên giữ tube điều kiện 40C Phụ lục 3C QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTERO VI RÚT VÀ EV-71 GÂY BỆNH TAY CHÂN MIỆNG BẰNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR SOP.KXN.XN.MSP.041 Lần ban hành: 1.0 Trang: 151/162 Đặt strip vào máy, khởi động chương trình theo yêu cầu xét nghiệm, tạo tên tệp lưu giữ liệu Ghi chép mã thiết bị sử dụng, ngày sử dụng vào biên xét nghiệm BM.SOP.KXN.XN.MSP041.01 8.6 Phiên giải kết Điều kiện đọc Kết CV-A6 (FAM) Positive Negative Ct ≤ 40 NoCt + Mẫu cho âm tính khơng có đường biểu diễn huỳnh quang vượt khỏi ngưỡng tín hiệu + Mẫu coi dương tính CV-A6 đường biểu diễn huỳnh quang FAM vượt khỏi ngưỡng tín hiệu chu kì