Đang tải... (xem toàn văn)
Các phương pháp chuyển gen ở thực vật và ứng dụng
Các phương pháp Các phương pháp Chuyển gen ở thực vật Chuyển gen ở thực vật và ứng dụng và ứng dụng Chuyên đề chuyển gen ở thực vậtchuyển gen ở thực vật Hệ thống Hệ thống nuôi cấynuôi cấy và tái sinh tái sinh in vitroin vitro Vectơ chuyển genVectơ chuyển genPhương pháp chuyển DNA vào mô, tế bàoPhương pháp chuyển DNA vào mô, tế bào thực vậtthực vậtChọn lọc và xác định các thể biến nạpChọn lọc và xác định các thể biến nạp Phân tích và mô tả cây chuyển genPhân tích và mô tả cây chuyển gen Hệ thống tái sinh hiệu quảHệ thống tái sinh hiệu quả Tính toàn Tính toàn nngnng của tế bào thực vật của tế bào thực vật Một số tế bào có khả Một số tế bào có khả n ngn ng tái sinh và biến nạp; tái sinh và biến nạp; Một số khácMột số khác + có khả nng hoặc + hoàn toàn không có khả nng tái sinh và biến nạp Khả Khả nngnng tái sinh phụ thuộc: tái sinh phụ thuộc: * Dạng vật liệu ban đầu - Phôi non, mô sẹo tạo thành từ phôi non - Chồi tái sinh trực tiếp hay thông qua phôi soma tạo thành từ cuống lá, lá mầm, mẩu lá, thân mầm * iều kiện nuôi cấy, kiểu gen, tuổi mô, các chất HST Vectơ chuyển genVectơ chuyển gen oạnoạn khởi động gen: khởi động gen: - Không đặc hiệu (đoạn khởi động cơ định): Ubi-P; CaMV35S-P; - Không đặc hiệu (đoạn khởi động cơ định): Ubi-P; CaMV35S-P; Act-P, NOS-P; Adh-PAct-P, NOS-P; Adh-P - Đặc hiệu với các yếu tố - Đặc hiệu với các yếu tố cis cis chuyên biệtchuyên biệt oạn kết thúc gen:oạn kết thúc gen: - Chứa đuôi polyA như AATTAA (AACCAA)- Chứa đuôi polyA như AATTAA (AACCAA) - CaMV35S; - CaMV35S; NOSNOS Gen thỉ thị:Gen thỉ thị: + Chỉ thị chọn lọc:+ Chỉ thị chọn lọc: hpt; npt II; pat, pmi; xylAhpt; npt II; pat, pmi; xylA + Chỉ thị sàng lọc: + Chỉ thị sàng lọc: cat; lacZ, gus; lux, gfpcat; lacZ, gus; lux, gfp Chuyển gen gián tiếp Chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếpChuyển gen trực tiếp Các phương pháp chuyển gen ở thực vậtChuyển gen thông Chuyển gen thông qua qua AgrobacteriumAgrobacterium in vitroin vitroChuyển gen thông Chuyển gen thông qua qua AgrobacteriumAgrobacterium in vivoin vivo- Súng bắn gen Súng bắn gen - Bằng hoá chấtBằng hoá chất- Xung điệnXung điệnPhương pháp khácPhương pháp khácVi tiêm; Vĩ tiêmChuyển gen qua ống phấnủ hạt khô với dung dịch DNA Kỹ thuật siêu âm; Silicon carbide Phương pháp Agrolistic Chọn lọc các tế bào chuyển genChọn lọc các tế bào chuyển gen Mô tả cây chuyển genMô tả cây chuyển gen Thử nghiệm đồng ruộng cây chuyển genThử nghiệm đồng ruộng cây chuyển gen- PCR: xác định sự có mặt của gen được chuyển nạp - Southern: xác định số bản sao của gen được chuyển nạp- Nothern và Western: xác định biểu hiện gen và sinh tổng hợp protein - ánh giá về kiểu hinh và kiểu gen- ánh giá rủi ro, ảnh hưởng của cây chuyển gen đến môi trường, con người -oạn trinh tự lặp lại 25bp (đoạn biên): dấu hiệu nhận biết cho quá trinh chuyển và xâm nhập của T-DNA vào TBTV- oạn biên phải có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T-DNA;- oạn biên trái gián tiếp tham gia vào quá trỡnh chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trinh này kết thúc binh thườngPhương pháp chuyển gen thông qua Phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciensA. tumefaciens Cấu trúc và chức n ng của Ti-plasmidCấu trúc và chức n ng của Ti-plasmid Cấu trúc và chức n ng của đoạn T-DNACấu trúc và chức n ng của đoạn T-DNA- DNA mạch vòng, sợi kép - 4 vùng tương đồng: + T-DNA và vùng VIR: hinh thành khối u ở thực vật + vùng chứa gen mã hoá cho việc sao chép plasmid và chuyển nạp C¬ chÕ ph©n tö cña chuyÓn gen th«ng qua C¬ chÕ ph©n tö cña chuyÓn gen th«ng qua A. tumefaciensA. tumefaciens Ưu điểmƯu điểm:- Số bản sao của gen chuyển nạp thấp, hiệu quả chuyển gen cao;- Tránh được sự hình thành các cây chuyển gen khảm; - Kỹ thuật không phức tạp; Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Nhược điểm: Nhược điểm: ược áp dụng rất thành công ở hầu hết các loại cây hai lá mầm, đối với cây 1 lá mầm còn hạn chế. Hệ thống chuyển gen thông qua Hệ thống chuyển gen thông qua A. tumefaciensA. tumefaciens Hệ thống vectơ chuyển nạpHệ thống vectơ chuyển nạpHệ vector nhị thểHệ vector nhị thể Vectơ chuyển gen:Vectơ chuyển gen: Ti-plasmid nhỏ có khả nng tự sao chép và có phổ vật chủ rộng với đoạn T-DNA được cắt bỏ hết các gen không cần thiết, gắn thêm các đơn vị sao chép; các gen chọn lọc, gen đánh dấu và vùng MCS nằm. Vector bổ trợVector bổ trợ: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng VIR được giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB. [...]... nguyên vẹn, mảnh lá chuyển gen ở cây một lá mầm thông qua A tumefaciens Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp ảnh hưởng của kiểu gen - Hiệu quả chuyển gen rất khác nhau giữa các kiểu gen của cùng một loài - Chuyển gen vào cây lúa ít phụ thuộc vào kiểu gen nhất (40 dòng/giống được chuyển gen) - Chuyển gen thành công với hầu hết các dòng mô hình của ngô (A188), lúa mỳ (Bobwhite và Fielder), lúa mạch... quả trong chuyển gen ở ngô và lúa - Carbenicillin hiệu quả trong chuyển gen ở ngô và lúa mỳ chuyển gen ở cây một lá mầm bằng súng bắn gen Tế bào phôi sau khi bắn gen bị tổn thương lớn do hệ thống nuôi cấy tế bào có khả nng phôi hoá kém Khả nng tái sinh cây giảm, các cây tái sinh thường bị bất thụ và mất hoạt tính của gen đã chuyển nạp Các thể chuyển gen nhận được thường có độ hu thụ thấp và biểu hiện... Vectơ và quy trỡnh chuyển gen đơn giản - Cần một lượng nhỏ plasmid DNA - Biểu hiện gen tạm thời có thể được quan sát sau vài ngày - Khả nng áp dụng cao trong chuyển gen vào các dòng/giống cây trồng thương mại Nhược điểm: Số bản sao của gen chuyển nạp cao, gây khó khn cho việc phân tích biểu hiện của gen đã chuyển, dẫn tới sự biểu hiện của các gen không bền vng; Hiệu quả chuyển gen thấp Hệ thống vectơ chuyển. .. kiện nuôi trồng vật liệu cho phôi Phương pháp chuyển gen khác được áp dụng đối với cây ngô - Chuyển gen bằng xung điện: sử dụng phôi non đã xử lý với enzym hoặc mô sẹo dạng I bị gây tổn thương bằng cơ học hoặc huyền phù tế bào phôi hoá đã xử lý enzym - Chuyển gen vào huyền phù tế bào, mô sẹo dạng II sử dụng kim làm bằng cacbua silic So sánh phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen và thông qua Agrobacterium... octopin - Sử dụng siêu vectơ nhị thể, gen hpt/bar, pmi đã được chuyển vào phôi non dòng ngô A188, HiII và các dòng lai với A188; - Sử dụng vectơ nhị thể + cystein trong môi trường nuôi cộng sinh chuyển gen vào phôi non dòng ngô HiII - Chuyển gen thành công ở ngô bị giới hạn bởi việc sử dụng dòng ngô A188 hoặc dòng lai trong đó dòng A188 là bố hoặc mẹ làm vật liệu - Phôi non mới tách là dạng vật liệu ban... thuộc vào kiểu gen, dạng mẫu mô đích - Là hai phương pháp chủ đạo đối với cây ngô Chuyển gen thông qua Agrobacterium: - Sự kết hợp của đoạn DNA đã được xác định trong bộ gen cây chủ - Dạng mô đích: chủ yếu sử dụng phôi non mới tách - Hầu hết chuyển gen vào các dòng ngô mô hình (A188, HiII) - Tần số biến nạp dao động 0,9-20% Chuyển gen bằng súng bắn gen: - Phạm vi của DNA ngoại lai được chuyển vào tế... kiểu hinh không binh thường Hơn na, các cây tái sinh thường có độ kết hạt thấp, già hoá sớm, cây còi cọc chuyển gen ở cây ngô Chuyển gen vào tế bào trần - Tế bào trần được tách từ huyền phù tế bào phôi hoá tạo thành từ phôi non - Nuôi cấy huyền phù tế bào để tách tế bào trần phụ thuộc nhiều vào kiểu gen thực vật, tần số tạo biến dị soma cao chuyển gen ở cây ngô Chuyển gen thông qua Agrobacterium - Ti... thấp (dưới 23oC) kích thích khả nng chuyển T-DNA và chuyển gen bền vng; Thành phần môi trường lây nhiễm và đồng nuôi cấy - N6/MS + 2,4-D + casein thích hợp cho chuyển gen vào lúa - N6/LS + 2,4-D + nitrat bạc thích hợp cho chuyển gen vào ngô - Acetosyringon có vai trò rất quan trọng trong chuyển gen và tái sinh Các chất kháng sinh để loại bỏ Agrobacterium - Thường sử dụng cefotaxime, carbenicillin, timentin... có khả nng chuyển nạp tốt nhất chuyển gen ở cây ngô Chuyển gen bằng súng bắn gen ở ngô - Là phương pháp tiên phong và thông dụng hiện nay - Sử dụng câc dạng mô đích khác nhau: tế bào huyền phù, mô sẹo dạng I, mô sẹo dạng II, mô phân sinh chồi đỉnh, phôi non Phôi non là dạng mô đích thích hợp nhất - Sử dụng phôi non không ổn định về số lượng cũng như chất lượng do tác động của thời tiết và điều kiện... tế bào thực vật không thể kiểm soát được - Nhiều bản sao của gen chuyển nạp và dạng kết hợp khá phức tạp - Khả năng xuất hiện sự bất hoạt gen và sự sắp xếp lại của DNA cao - Dạng mô đích: mô sẹo, mô sẹo phôi hoá, huyền phù tế bào mô sẹo phôi hoá, phôi non - Chuyển gen vào các dòng ngô thuần/dòng ngô chọn lọc - Tần số biến nạp dao động từ 1-18% Kết luận - Chuyển gen đã trở thành kỹ thuật thông dụng trong . Các phương pháp Các phương pháp Chuyển gen ở thực vật Chuyển gen ở thực vật và ứng dụng và ứng dụng Chuyên đề chuyển. gfp Chuyển gen gián tiếp Chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếpChuyển gen trực tiếp Các phương pháp chuyển gen ở thực vậtChuyển gen thông Chuyển gen