Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH QUANG HỌC GIỚI THIỆU VỀ QUANG PHỔ Về mặt lịch sử, “quang phổ (spectroscopy)” nhánh khoa học ánh sáng phân giải thành bước sóng thành phần để tạo phổ quang học, đồ thị vài hàm cường độ xạ với bước sóng tần số Hiện nay, nghĩa quang phổ mở rộng bao gồm nghiên cứu không với xạ khả kiến mà với loại khác xạ điện từ tia X, tử ngoại, hồng ngoại, vi sóng xạ tần số radio Quang phổ đóng vai trò cốt yếu phát triển thuyết nguyên tử đại Hơn nữa, phương pháp đo phổ cung cấp công cụ sử dụng rộng rải việc so sánh cấu trúc loại phân tử phân tích định tính định lượng hợp chất vơ hữu I Tính chất chung xạ điện từ Bức xạ điện từ dạng lượng mà dễ thấy ánh sáng khả kiến xạ nhiêt Những loại khác gồm tia gamma, tia X, tia tử ngoại, vi sóng sóng radio Nhiều tính chất xạ điện từ mơ tả cách thuận tiện kiểu sóng hình sin cổ điển sử dụng nhiều thông số bước sóng, tần số, vận tốc biên độ Khác với nhiều tượng sóng khác âm thanh, xạ điện từ khơng đòi hỏi mơi trường hỗ trợ cho lan truyền nhờ qua mơi trường chân khơng Mơ hình sóng thất bại việc giải thích tượng gắn liền với hấp thụ xạ lượng xạ Để hiểu trình cần thiết phải nhờ đến mơ hình kiểu hạt xạ điện từ xem dòng hạt rời rạc gọi photon, với lượng photon tỉ lệ với tần số xạ Quan niệm lưỡng tính sóng hạt ánh sáng khơng loại trừ lẫn mà có tính chất bổ sung cho Thực vậy, lưỡng tính thấy dòng electron hạt khác proton hoàn toàn lý giải học sóng Các tính chất xạ điện từ Vì nhiều mục đích, xạ điện từ biễu diễn cách thuận lợi trường điện từ trải qua dao động pha hình sin (hình) Ở ta xem xét thành phần điện xạ điện trường chịu trách nhiệm cho hầu hết tượng ta quan tâm truyền qua, phản xạ, khúc xạ hấp thụ Tuy nhiên, điều đáng ghi nhớ thành phần từ trường xạ điện từ chịu trách nhiệm cho hấp thu song tần số radio cộng hưởng từ hạt nhân Bùi Xuân Vững Hóa Phân tích cơng cụ Các thơng số sóng Biên độ A sóng hình sin xem chiều dài vectơ điện trường cực đại sóng Thời gian (giây) đòi hỏi cho khoảng hai cực đại cực tiểu liên tiếp thông qua điểm cố định không gian gọi chu kì p xạ Trong mơi trường chứa vật chất lan truyền xạ bị chậm tương tác điện trường xạ với điện tử nguyên tử phân tử Tính chất sóng ánh sáng mô tả hai đại lượng tần số bước sóng • Tần số ν số dao động điện trường giây, đơn vị S-1 hay gọi Hertz • Bước sóng λ khoảng cách hai điểm cực đại cực tiểu liên tiếp sóng, thường biểu diễn theo mét (m) nanomet (nm) cho bước sóng ngắn (1nm = 10-9 m) Ao (angstrongs, đơn vị không thuộc hệ SI, Ao = 10-10m) • Vận tốc tất xạ điện từ chân khơng (trong khơng khí nhỏ 0.03%) tích tần số bước sóng nó: C = λν = 3.00 x 108 m/s C gọi vận tốc ánh sáng • Giải: Ví dụ: Một đài phát phát sóng có bước sóng 325 cm Hỏi tần số xạ điện từ ν = C/λ = 3.00 x 108 m/s/(325x10-2m) = 9.23 x 107 s-1 Số sóng định nghĩa nghịch đảo bước sóng (cm) cách khác để mô tả xạ điện từ Thứ nguyên số sóng cm-1 Số sóng tiện ích ngược với bước sóng, sử dụng rộng rải phổ hồng ngoại Nó đại lượng tiện lợi trái với bước sóng tỉ lệ thuận với tần số tức với lượng xạ Như ta biễu diễn: = kν Ở k số tỉ lệ phụ thuộc vào mơi trường nghịch đảo vận tốc Ví dụ: tính số sóng xạ hồng ngoại có bước sóng 5.00µm Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ = 1/(5.00x10-4) = 2000 cm-1 3.Tính chất hạt xạ • Năm 1900, để giải thích xạ vật đen (blackbody radiation) bị nung nóng Planck đề thuyết lượng tử Theo thuyết xạ phát hay hấp thụ lượng gián đoạn lượng hay lượng tử lượng • Trên cở sở thuyết lượng tử Planck, Einstein đề xuất thuyết photon ánh sáng để giải thích hiệu ứng quang điện; theo ánh sáng xem chùm ‘hạt’ photon • Năng lượng photon phụ thuộc vào tần số vào bước sóng xạ: ε = hν = hc/λ với h số Planck = 6.626x10-34 J.s • Ví dụ : tính lượng dạng jun photon xạ tạo lò vi sóng có bước sóng 12.0 cm ε = hc/λ = 6.626x10-34 x 3.00x108 / (12 x 10-2) = 1.66 x10-24 J Biểu thức thống lưỡng tính sóng hạt ánh sáng Ánh sáng dạng vật chất theo thuyết tương đối Einstein photon xem ‘hạt’ có khối lượng m phương trình biễu diễn mối quan hệ vật chất (ở photon) với lượng là: ε = mc2 Mặt khác ta có: ε = hν Như ε = hν = mc2 Theo tính chất sóng ánh sáng thì: c =λ.ν Với vài biến đổi đơn giản ta rút đươc biểu thức hay gọi biểu thức thống lưỡng tính sóng – hạt ánh sáng: λ = h/mc II Phổ xạ điện từ Quang phổ xạ điện từ bao gồm dải lớn bước sóng (và lượng) Trong phần xạ khả kiến mà mắt người thấy nhỏ so với vùng phổ khác Cũng cần phải ý phương pháp quang phổ sử dụng khơng vùng khả kiến mà Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ tử ngoại, hồng ngoại thường gọi phương pháp đo quang mắt người không nhạy với hai loại sau Bảng liệt kê dải bước sóng tần số vùng phổ quan trọng mục đích phân tích kèm theo tên phương pháp phổ liên quan Các cột cuối liệt kê loại chuyển dịch lượng tử hạt nhân, nguyên tử phân tử, sở cho kỹ thuật quang phổ khác Loại quang phổ Dải bước sóng Dải số sóng(cm-1) Phát xạ tia gamma 0.005 – 1,4 Ao - Kiểu dịch chuyển lượng tử Hạt nhân Nhiểu xạ, huỳnh quang, phát xạ, hấp thu tia X 0.1-100 Ao - Electron bên Hấp thu tử ngoại chân không 10-180 nm x 10 đến x 104 Các electron liên kết Hấp thu, phát xạ huỳnh quang tử ngoại khả kiến 180-780 nm x 10 đến 1.3 x 104 Các electron liên kết Hấp thu hồng ngoại 0.78-300 µm Hấp thu vi sóng 0.75-3.75 mm Cộng hưởng từ spin cm Cộng hưởng từ nhân 0.6-10 m 1.3 x104 đến 3,3 x 101 Dao động điều hòa/quay 13-27 phân tử Dao động quay phân tử 0.33 Spin electron 1.7x 10-2 đến x 103 từ trường Spin hạt nhân từ trường Bùi Xuân Vững Hóa Phân tích cơng cụ Chương 1: PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ UV-VIS 1.1 Sự hấp thụ phân tử UV-VIS Các phân tử điều kiện bình thường tồn trạng thái bền vững có lượng thấp Khi chúng cung cấp lượng, ví dụ có nguồn sáng kích thích tần số thích hợp, điện tử hóa trị (liên kết) phân tử hấp thụ lượng nguồn sáng chuyển lên trạng thái kích thích có lượng cao Theo học lượng tử, phân tử trạng thái bản, điện tử xếp đầy vào orbitan liên kết σ, π cặp electron hóa trị chưa tham gia liên kết n có mức lượng thấp (ví dụ ngun tử N cặp electron hóa trị chưa tham gia liên kết) Nếu chiếu vào chúng chùm sáng có bước sóng v thích hợp chúng chuyển lên obitan phản liên kết có mức lượng cao σ→σ*, π→π* , n → σ*, n → π * Trạng thái gọi trạng thái kích thích, khơng bền tồn khoảng thời gian ngắn (cỡ phần triệu giây) Năng lượng hν photon hiệu hai mức lượng hai obitan Sự dịch chuyển electron hai obitan gọi dịch chuyển điện tử (electron transition) trình hấp thu gọi hấp thụ điện tử Cùng với chuyển dịch điện tử phân tử thể hai loại khác dịch chuyển cảm ứng xạ dao động quay Những dịch chuyển dao động tạo phân tử có số mức lượng lượng tử hoá gắn với liên kết phân tử Hình sơ đồ mức lượng mơ tả vài q trình xảy phân tử hai nguyên tử khác hấp thu xạ tử ngoại khả kiến, lượng trạng thái kích thích điện tử En phân tử biễu diễn tương đối so với lượng trạng thái Eo Ngoài ra, mức lượng tương đối vài trạng thái dao động nhiều trạng thái lượng dao động quay nhỏ thể sơ đồ (các số 0,1,2 , với giá trị biểu diễn cho mức lượng dao động quay nhỏ nhất) Năng lượng tổng cộng E với phân tử viết sau: E = Eđiện tử(e) + Edao động(d) + E quay(q) Ở đây: Eđiện tử(e) lượng electron obitan lớp vỏ phân tử, Edao động(d) lượng dao động nguyên tử tồn phân tử, Equay(q) giải thích cho lượng liên quan với quay phân tử quanh trọng tâm chúng Giả sử lượng phân tử trạng thái biễu diễn Eo, trạng thái kích thích En hiệu hai mức lượng phân tử hai thạng thái lượng hν photon: ΔE = En – Eo = ΔE(e) + ΔE(d) + ΔE(q) = hν =hc/λ Trong ΔE(e) > ΔE(d) > ΔE(q) Như hình 2, hấp thụ phân tử vùng tử ngoại khả kiến gồm dải hấp thụ tạo nhiều vạch có khoảng cách gần nhau, dẫn đến phổ UV-VIS phổ vạch phổ phát xạ hấp thụ nguyên tử mà phổ đám Như phổ hấp thu phân tử UV-VIS phổ xuất tương tác điện tử hóa trị phân tử hay nhóm phân tử với chùm sáng kích thích có bước sóng nằm vùng UV-VIS tạo Bùi Xuân Vững Hóa Phân tích cơng cụ Hình 1: Các mức lượng điện tử, dao động quay (không theo tỉ lệ) hai mức lượng điện tử phân tử hai ngun tử (ví dụ CO) Hình 2: Phổ hấp thụ phân tử vài hợp chất hữu (phổ đám) phổ hấp thụ nguyên tử Na (phổ vạch) 1.2 Định luật Beer 1.2.1 Định luật Nếu ta chiếu chùm sáng đơn sắc có cường độ Io vào cuvet chứa dung dịch chất mẫu có độ dài l phần chùm sáng qua cuvet, phần phản xạ tán xạ phương va đập vào thành cuvet phần bị phân tử cuvet hấp thu Trong phần hấp thụ phân tử chất màu cuvet Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Nếu sau qua cuvet cường độ ánh sáng I ta có hấp thụ ánh sáng đơn sắc phân tử cuvet biễu diễn bởi:  Đại lượng mật độ quang D = log(Io/I) hay  Độ truyền qua T = I x100 (%) Io Theo định luật Beer: D = εLC Ở đây:  ε hệ số hấp thu phân tử (L.mol-1.cm-1)  L chiều dài dung dịch ánh sáng qua (cm)  C nồng độ chất hấp thu (mol/L) 1.2.2 Áp dụng định luật Beer dung dịch hỗn hợp Định luật Beer áp dụng cho dung dịch chứa loại chất hấp thụ ánh sáng chiếu qua Nếu khơng có tương tác chất, mật độ quang dung dịch cho sau: D tổng = D1 + D2 + … + Dn = ε1LC1 + ε2LC2 + … + εnLCn Ở số 1,2,…,n chất thứ 1,2,…, n Hệ quả: D dung dịch mẫu = Dchất màu + D so sánh  Dso sánh mật độ quang dung dịch trống (blank)  Dung dịch chuẩn bị cho có thành phần dung dịch mẫu đo không chứa chất màu 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến định luật Beer a Ảnh hưởng nồng độ: Định luật Beer trường hợp nồng độ chất phân tích tương đối thấp Tại nồng độ cao (thường lớn 0.01M) khoảng cách trung bình phân tử chất tan hấp thụ ánh sáng bị thu hẹp tới mức tác động đến phân bố điện tích phân tử xung quanh Điều làm thay đổi khả hấp thụ xạ đơn sắc, dẫn đến làm sai lệch mối quan hệ tuyến tính A nồng độ C chất hấp thu xạ Ảnh hưởng tương tự xảy dung dịch mẫu đo có chứa nồng độ chất cần đo thấp chứa nồng độ cao loại khác, đặc biệt chất điện ly Sự tiếp cận ion đến chất hấp thu làm thay đổi hệ số hấp thu phân tử tương tác tĩnh điện Ảnh hưởng giảm thiểu pha loãng Độ lệch Định luật Beer nảy sinh ε phụ thuộc vào số khúc xạ dung dịch đo bị thay đổi thay đổi nồng độ, Tuy nhiên, ảnh hưởng không đáng kể nồng độ dung dịch loãng 0,01M b Độ lêch Định luật Beer trình hóa học Độ lêch từ định luật Beer nảy sinh chất phân tích bị phân ly, kết hợp tương tác hóa học với dung mơi để tạo sản phẩm có phổ hấp thu khác với chất phân tích ban đầu Một ví dụ điển hình cho vấn đề pha loãng chất thị màu axit- bazơ cân bị dịch chuyển : Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ HInd  H+ + IndVì pha lỗng gấp đơi nồng độ chất màu Hind khơng tương ứng giảm nửa Điều dẫn đến sai lệch so với đinh luật Beer c Sai lệch xạ đa sắc Giới hạn nghiêm ngặt đinh luật Beer cho ánh sáng truyền qua thực đơn sắc Tuy nhiên thực tế khó tạo ánh sáng đơn sắc λ mà tạo dải bước sóng quanh giá trị mong ước mà thôi, tức λ + Δλ Thiết bị có đơn sắc hóa tốt Δλ nhỏ lại Điều dẫn đến sai lệch nhỏ so với định luật Sự sai lệch hạn chế đến mức không đáng kể ta chọn dải sóng hấp thụ cực đo mẫu Hình minh họa ảnh hưởng xạ không đơn sắc đến định luật Beer Dải chọn để đo độ sai lệch so với định luật Beer nhỏ (trên hình cho thấy mối quan hệ nồng độ C tuyến tính) giá trị hệ số tắt phân tử ε không thay đổi lớn tồn dải đo Trong dải có độ sai lệch lớn ε thay đổi đáng kể vùng (mối quan hệ D C không tuyến tính) Dải Dải D Bước sóng Dải Dải D Nồng độ C Hình 3: Ảnh hưởng xạ không đơn sắc đến định luật Beer d Sai lệch diện xạ nhiểu tạp (stray) Các xạ sử dụng cho phép đo quang thường bị nhiểm bẩn lượng nhỏ xạ nhiểu tạp khiếm khuyết thiết bị Những xạ kết tượng phát tán từ bề mặt lăng kính, lọc ánh sáng cửa sổ Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Nó thường có bước sóng khác so với xạ dùng, thêm vào khơng qua dung dịch mẫu mà vào trực tiếp detector dẫn đến sai lệch từ tuyến tính mật độ quang nồng độ chất phân tích 1.3 Nguyên tắc trang thiết bị phép đo phổ UV-VIS 1.3.1 Nguyên tắc: Phổ hấp thụ UV-VIS phổ hấp thụ chất phân tích trạng thái dung dịch đồng thể với dung môi nước, methanol, benzen, aceton, CCl4… Như bước đo sau:  Hòa tan chất phân tích dung mơi phù hợp chất có phổ hấp thụ nhạy vùng tử ngoại khả kiến (ví dụ chất hữu cơ); cho chất đó, thường kim loại, tác dụng với thuốc thử dung mơi thích hợp để tạo hợp chất có phổ hấp thụ UV-VIS nhậy  Chiếu vào dung dịch mẫu chứa hợp chất cần phân tích chùm sáng có bước sóng phù hợp chất phân tích hay sản phẩm hấp thu xạ để tạo phổ hấp thu UV-VIS Vì chất phân tích dung mơi cần chứa ống đo (cuvet) có chiều dày xác định  Thu, phân ly phổ chọn sóng cần đo ghi lại giá trị mật độ quang A phổ, nghĩa đo cường độ chùm sáng sau qua dung dịch mẫu nghiên cứu Dựa nguyên tắc vậy, máy đo UV-VIS cần phân sau 1.3.2 Các phận a Nguồn sáng Nguồn sáng cho hấp thụ phân tử cần có lượng đủ lớn vùng bước sóng hấp thụ chất phân tích phép sẵn sàng dò tìm đo Ngồi phải ổn định suốt thời gian đo Có phép đo mật độ quang cho kết lặp lại Nguồn sáng phổ biến để tạo xạ khả kiến cận hồng ngoại đèn dây tóc vonfram W từ 380 nm đến 2500 nm Đèn vonfram-halogen chứa lượng nhỏ iot vỏ bọc thủy tinh thạch anh chứa dây tóc W, cho phép hoạt động nhiệt độ khoảng 3500 K Điều cho phép đèn hoạt động có cường độ cao mở rộng khoảng bước sóng phát vào phần vùng tử ngoại Đèn loại có tuổi thọ cao giảm bay W hoạt động Các W tác dụng tạo WI2 khuếch tán quay lại dây tóc phân hủy tạo lại W Đèn hydro nặng deuterium D2 Đèn gọi đèn hồ quang D2 phóng điện làm phân hủy D2 phát phổ liên tục vùng tử ngoại từ 200 đến 400 nm b Hệ quang học Với máy đơn giản kính lọc màu cho vùng phổ định dùng lăng kính để tách chùm tia đơn sắc Trong máy có độ phân giải cao có độ nhạy cao, đơn sắc hóa cách tử phản xạ (reflection grating) (hình 5)  Bộ cách tử phản xạ bệ thủy tinh phủ lên bề mặt lớp nhơm mỏng khắc vạch có khoảng cách Bùi Xuân Vững    Hóa Phân tích cơng cụ Số lượng vạch đơn vị chiều dài (mm) lớn độ phân giải cao tia tách đơn sắc Các máy UV-VIS có cách tử có só vạch khoảng từ 12001800 vạch/mm, có lên đến 2400 vạch/mm máy có độ phân giải cao Trên bề mặt lớp nhôm lại phủ lớp mỏng SiO2 để bề mặt kim loại tránh bị oxi hóa làm giảm phản xạ Nguyên tắc đơn sắc hóa chùm tia đa sắc dựa vào tượng nhiễu xạ Khi ánh sáng đa sắc đâp vào khe hẹp vạch bị nhiễu xạ khe trở thành nguồn sáng phản chiếu góc khác tia đơn sắc (hình 4) Hình 4: Ngun lí đơn sắc hóa chùm sáng đa sắc cách tử phản xạ Hình 5: (a) Đơn sắc hóa chùm đa sắc cách tử phản xạ (b) lăng kính 10 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Định luật Lambert –Beer chùm sáng bị hấp thu đơn sắc, hệ thống detector thường không cung cấp chùm tia đủ đơn sắc mà dải hẹp chùm tia quanh giá trị bước sóng chọn Một ống đo (flow cell) UV detector có đường kính khoảng mm chiều dài ánh sáng qua khoảng 10 mm, thể tích chứa khoảng µl 8.4.2 Detector chuỗi photodiot (Photodiode Aray Detector) Trong detector UV-VIS chùm sáng đa sắc cho qua mẫu sau hội tụ vào khe vào đơn sắc hóa (monochromator) để tách chùm tia đơn sắc cần đo hướng vào dò tìm Mật độ quang mẫu tìm thấy nhờ so sánh cường độ chùm tia tới dò tìm khơng có mẫu (còn gọi mẫu trống) với chùm tia qua mẫu Để đo mật độ quang bước sóng khác nhau, bước sóng thay đổi nhờ quay chậm lăng kính cách tử (grating) đơn sắc hóa Sự diện phận quay thiết bị giới thiệu thêm sai số (ví dụ giật lùi học) việc quay chậm gây tốn thời gian  Trong detector chuỗi photodiot, chùm tia đa sắc sau qua mẫu tán xạ cách tử cố định rơi vào chuỗi photodiot  Mỗi photodiot đo dải hẹp bước sóng quang phổ, thu nhận số liệu song song, nghĩa tất điểm đo đồng thời Hệ thống có số thuận lợi sau:  Bởi thu nhận số liệu song song nên việc xử lý lưu trữ quang phổ thực khoảng 0.5 s so với vài phút detector UV  Vì khơng có phận di chuyển bị làm mài mòn nên sai số thiết lập lại bước sóng cần chọn giảm xuống thiết bị đòi hỏi bảo dưỡng thiết bị khác  Nhờ khả thực phép đo nhiều bước sóng lúc tốc độ thu nhận số liệu nên kỹ thuật lấy trung bình số liệu khác sử dụng để làm giảm tiếng ồn tăng độ nhạy  Khi sử dụng detector HPLC, đắt tiền so với loại UV truyền thống có ưu điểm đáng kể:  Quang phổ pic sắc ký đồ lưu giữ so sánh với phổ chuẩn giúp tiện lợi việc nhận diện pic  Bước sóng tối ưu cho việc dò tìm dễ dàng tìm thấy thay đổi bước sóng trình dò tìm chương trình hóa để xảy điểm khác sắc ký đồ  Nó cung cấp độ nhạy cực đại cho pic 104 Bùi Xuân Vững Hóa Phân tích cơng cụ 8.4.3 Detector huỳnh quang (fluorescence detector) Nhiều hợp chất có khả hấp thụ chùm tia UV sau phát xạ có bước sóng dài (huỳnh quang) sau trễ thời gian (lân quang – phosphorescence) Thường phần lượng bị hấp thụ sau phát xạ trở lại tương đối thấp có vài hợp chất, phần phát xạ trở lại từ 0.1-1 nên thích hợp cho việc dò tìm huỳnh quang Những hợp chất thường có vòng liên hợp hợp chất vòng thơm có nhiều nhân Nhiều hợp chất khơng có phổ huỳnh quang chuyển sang dẫn xuất có phổ nhờ xử lý với thuốc thử thích hợp 8.4.4 Detector đo số khúc xạ (Refrative index detector) Detector (RI) nhạy với khác số khúc xạ chất rửa giải từ cột với dòng chảy pha động nguyên chất Đây loại detector thông dụng chất hòa tan dò tìm miễn có số khúc xạ khác với dòng chảy pha động nguyên chất.Tuy nhiên, loại detector nhạy khoảng 1000 lần so với detector UV Mức độ tiếng ồn tốt thu vào khoảng 10-7 đơn vị số khúc xạ, điều tương ứng với nồng độ tương đương tiếng ồn khoảng 10-6 g cm-3 cho hầu hết chất tan Có nhiều mẫu thiết kế cho detector đo số khúc xạ, nguyên tắc hoạt động:  Cuvet có hai bình tam giác tích đến 10 microlit bình có dung môi nguyên chất dung dịch chất tan chảy vào  Chùm sáng khả kiến lọc xạ hồng ngoại (có thể làm nóng mẫu) chiếu qua cuvet có dung mơi ngun chất chảy qua bình tam giác hướng vào ống nhân quang điện nhờ đĩa deflection  Khi chất tan với số khúc xạ khác vào cuvet, chùm sáng bị lệch làm tín hiệu ống nhân quang điện thay đổi Detector RI khơng dùng sắc kí rửa giải biến đổi nồng độ (gradient) khơng thể dò tìm xác thành phần pha động bị thay đổi RI nhạy với thay đổi nhỏ nhiệt độ áp suất (0.01oC) Vì có độ nhạy thấp nên khơng dùng phân tích lượng vết RI có khoảng nồng độ tuyến tính hẹp 8.5 Các phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao 8.5.1 Sắc kí phân bố hiệu cao Gồm hai loại phương pháp sắc kí lỏng-lỏng sắc kí pha liên kết 105 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ  Sắc kí lỏng lỏng (LLC) : Pha tĩnh chất lỏng phủ bề mặt hạt chất mang (support) Pha tĩnh thường bị dung môi hòa tan dần làm cột dần hiệu lực nên phương pháp ngày sử dụng  Sắc kí pha liên kết (bonded phase chromatography) Pha tĩnh gắn hóa học (liên kết) với chất mang (hạt silicagen) tạo nên hợp chất cơsiloxan (hình ) Nếu R nhóm phân cực octyl (C8), octadecyl (C18) hay phenyl pha động dung mơi phân cực H2O, methanol, acetonitril có sắc kí pha đảo (hay sắc kí pha ngược) Ở pha tĩnh phân cực pha động, trái với truyền thống sắc kí trước pha tĩnh phân cực pha động Nếu R nhóm phân cực alkylamin –(CH2)nNH2 hay alkylnitril –(CH2)n-CN pha động dung mơi phân cực hexan ta có sắc kí pha thuận Hiện sắc kí pha đảo dùng rộng rãi lí sau: o Các phân tử khơng phân cực, phân cực, ion, ion hóa tách cách hiệu o Pha tĩnh có khoảng phân cực rộng để chọn lựa o Nó cho phép chọn khoảng rộng chất rửa giải o Các chất dung môi rửa giải thông dụng không đắt (nước, methanol acetonitril) o Kỹ thuật rửa giải gradient sử dụng mà khơng sợ hỏng pha tĩnh o Khơng có hạn chế áp suất pha động vào cột o Nó cho kết tách tốt với nhiều đối tượng tách 106 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Hình 8.2: Sơ đồ tổng hợp pha tĩnh pha liên kết hóa học  Chọn pha: thường chọn pha tĩnh có tính phân cực giống với chất cần tách khác với pha động Các chất hữu có độ phân cực tăng theo thứ tự sau: Hydrocacbon no, ôlefin, hydrocacbon thơm, halogenua, sunfua, ête, dẫn xuất nitro, este = andehit = xeton, ancol =amin, sunfon, sunfoxit, amit, axit cacboxilic, nước Thứ tự rửa giải sắc kí pha thuận chất khơng phân cực trước đến chất phân cực mạnh Trong sắc kí pha đảo chất phân cực trước đến chất khơng phân cực sau  Ứng dụng: sắc kí lỏng phân bố hiệu cao dùng việc tách chất thuộc nhiều lĩnh vực như:  Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid  Axit amin, protein, hydrat cacbon, lipid…  Đường nhân tạo, chất chống oxi hóa, chất phụ gia, aflatoxin…  Chất thơm, chất điện hoạt, chất màu, hóa chất cơng nghiệp… 107 Bùi Xn Vững   Hóa Phân tích cơng cụ Thuốc trừ sâu, diệt cỏ, phenol dẫn xuất phenol… Thuốc, chất độc, cồn máu… 8.5.2 Sắc kí hấp phụ hiệu cao (sắc kí lỏng –rắn) Là phương pháp phát triển sớm dùng phổ biến Trong phương pháp này, chất tan bị giữ bề mặt pha tĩnh tức chất hấp phụ bị dung môi đẩy (phản hấp phụ) Pha tĩnh: pha tĩnh bột mịn, silicagen nhôm oxit chất ưa dùng Ở chất bị phân cực bị lưu giữ mạnh chậm rửa giải Pha động: bảng cho ta dãy dung môi với sức rửa giải tăng dần từ xuống (thông số sức dung môi tăng dần) Dãy xếp theo khả đẩy chất khỏi nhơm oxit Nhưng với silicagen ta có dãy tương tự Muốn có dung mơi có vị trí trung gian khơng có bảng ta dùng hỗn hợp dung mơi theo tỉ lệ thích hợp Ứng dụng: Sắc kí hấp thụ dùng nhiều để tách chất tương đối phân cực, chất hữu khơng tan nước có phân tử lượng nhỏ khoảng 5000 Phương pháp mạnh hẳn phương pháp khác việc tách đồng phân εo 0.01 0.01 0.01 0.04 0.18 0.28 0.29 0.32 0.38 0.40 0.42 0.49 0.56 0.56 0.56 0.58 0.65 0.71 0.75 0.82 0.88 0.95 Dung môi Ete dầu hỏa Hexan Heptan Xiclohecxan Tetraclocacbon Ete propylic Toluene Benzene Ete etylic Clorofom Clometylen Dicloetan Aceton dioxan Butanol Etyl acetat Acetonitril Pyridin Dimetylsunfoxit Rượu isopropylic Rượu etylic Rượu metylic 108 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ 8.5.3 Sắc kí trao đổi ion hiệu cao: 8.5.3.1.Nhựa trao đổi ion (ionit)  Là phương pháp sắc kí nhựa trao đổi ion dùng làm pha tĩnh dạng bột mịn  Nhựa trao đổi ion (ionit) hợp chất cao phân tử có chứa nhóm chức chứa ion có khả trao đổi Nhựa trao đổi cation (cationit) có hai loại: cationit axit mạnh có chứa nhóm –SO3-H+ ứng dụng rộng rãi, cationit axit yếu có nhóm –COOH Nhựa trao đổi anion (anionit) có hai loại: anionit bazơ mạnh có nhóm amoni bậc –N(CH3)3+OH- anionit yếu có nhóm trao đổi amin bậc hay  Các nhựa trao đổi ion chế tạo đồng trùng hợp styrene divinyl benzene với divinyl benzene có hàm lượng thay đổi từ dến 16 % để tăng mức liên kết ngang polime, dẫn đến trương nở khơng hòa tan nước  Các nhân benzene sau gắn vào nhóm –SO3H để tạo nhựa cationit nhóm amin –NR3+ tạo nhựa anionit Nếu axit metaacrylic dùng thay cho styrene nhựa cationit axit yếu –COOH tạo thành Liên kết ngang Nhóm chức trao đổi ion  Các ionit không tan nước, tiếp xúc với dung dịch trao đổi ion có trao đổi Với cationit có trao đổi cation, ví dụ trao đổi cation Ca2+ với nhựa cationit axit mạnh: 2RSO3-H+(rắn) + Ca2+ (dd)  (RSO3)2Ca(r) + 2H+(dd) 109 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Với anionit ta có ví dụ: 2R(CH3)3+OH- (r) + SO42-(dd)  [R(CH3)3]2SO42-(r ) + 2OH-(dd) 8.5.3.2 Cân trao đổi ion  Quá trình trao đổi ion nhựa cationit axit mạnh với ion Ca2+ dung dịch viết: 2H+(rắn) + Ca2+(dd)  Ca2+(r) + 2H+(dd) Áp dụng định luật khối lượng ta có: K' [Ca ]r [ H ]2dđ [Ca ]dd [ H ]2r pha rắn nhựa ionit Biểu thức biểu diễn lại sau: K [Ca ]r [Ca ]dd [ H ]r K' [ H ]2d d  K hệ số phân bố Ca2+ dung dịch nhựa ionit Ion có K lớn bị lưu giữ mạnh ionit, K nhỏ bị lưu giữ yếu  K phụ thuộc vào điện tích kích thước ion bị hydrat hóa Nói chung, nhựa trao đổi ion ưu tiên trao đổi với ion có điện tích cao hơn, bán kính hydrat hóa nhỏ  Một thứ tự ưu tiên chọn lựa cho cation biểu diễn sau: La3+ > Ce3+ >Eu3+ >Y3+ > Sc3+ > Al3+ > Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > Ag+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+ 8.5.3.3 Pha động sắc kí trao đổi ion: Rửa giải gradient với tăng lực ion thay đổi pH có giá trị lớn sắc kí trao đổi ion Giả sử xét cột mà anion A- bị lưu giữ mạnh anion B- Ta tách A- khỏi B- cách rửa giải với ion C- có lực với cột yếu A- B- Khi nồng độ C- tăng lên, C- bị thay di chuyển dọc theo cột khỏi cột Khi nồng độ C- tiếp tục tăng lên A- bị rửa giải Trong hình 10 cho thấy tăng dần nồng độ H+ sử dụng để tách trao đổi ion Trật tự rửa giải giống với trật tự hệ số chọn lọc cation Hệ số chọn lọc lớn nồng độ H+ đòi hỏi cao để rửa giải cation khỏi cột 110 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Hình 8.3: Rửa giải La(III) từ cột nhựa trao đổi cation sử dụng gradient nồng độ H+ để tách cách cation lưu giữ mạnh La(III) dò tìm phản ứng với thuốc thử tạo màu sau rửa giải Khi tìm giá trị thích hợp pH cho phép tách cụ thể, điều cần biết giá trị pKA cấu tử có mẫu  Ứng dụng : Phương pháp dùng để tách ion vơ hữu (hình 14) Ví dụ cho dung dịch hỗn hợp ion Ba2+ , Ca2+ , Zn2+ , Mg2+ qua cột cationit axit mạnh ion bị lưu giữ cột Khi dùng dung dịch axit loãng để rửa giải ion khỏi cột Mg2+ , Zn2+ , Ca2+ Ba2+ Có thể phát ion rửa giải khỏi cột nhờ detector đo độ dẫn điện 8.5.4 Sắc kí cặp ion (ion pair chromatography- IPC)  Phần lớn sắc kí cặp ion (IPC) nảy sinh hạn chế sắc kí trao đổi ion như: Các cột có khuynh hướng hiệu cột LC khác Các cột thường không cho kết lặp lại mức độ Các cột thường bền Độ chọn loc  Trong ICP ta sử dụng sắc kí pha thuận lẫn sắc kí pha đảo, loại có mặt thuận lợi riêng Pha tĩnh sắc kí pha đảo gồm có pha tĩnh silic silan hóa sử dụng bình thường ví dụ pha liên kết C18 C8 Pha động ICP gồm dung dịch đệm nước (cộng với dung môi hữu methanol acetonitril cho phép tách pha tĩnh liên kết) ion đối có điện tích ngược dấu với ion phân tử mẫu 111 Bùi Xuân Vững Hóa Phân tích cơng cụ Ví dụ, giả sử cần tách số axit hữu cơ, pha động đệm pH =7 để tất hợp chất mẫu nằm dạng RCOO- Ion đối trường hợp dùng ion tetrabutyl amoni (TBA+) Cột dùng ICP chuẩn bị giống sắc kí pha liên kết pha thuận  Pha phân bố: Bảng sau tóm tắt vài hệ thống ICP báo cáo tài liệu với ứng dụng rõ pha động, pha tĩnh, ion đối Bảng: Các hệ thống sắc kí cặp ion pha thuận pH nước pH Pha động Cyclohexane/CHCl3/1-pentanol 0.1MHClO4 Các hỗn hợp tributyl phosphate, ethyl acetate, butanol, CH2Cl2,và/hoặc hexane ClO4- Các amin Đệm HPO42- /PO43- Butanol/CH2Cl2/Hexane (Butyl)4N+ Các axit cacboxylic 0.1MHClO4 CH2Cl2/ CHCl3/ butanol /hoặc ClO4- Các amin pH 5-6 Pentanol/CH2Cl2 và/hoặc CHCl3 Picrate Các amin pH 6-8.5 Butanol/heptane (Butyl)4N+ Các sunfoamit 0.2-0.25M HClO4 Butanol/CH2Cl2/Hexane ClO4- Amin amin bậc bốn 0.1M methanesunfonic acid Butanol/CH2Cl2/Hexane CH3SO3- Các amin (Butyl)4N+ Các axit cacboxylic pH 8.3 Butanol/CH2Cl2/Hexane Bảng : hệ thống sắc kí cặp ion pha đảo Ion đối N,N-dimethylprotrityline Loại mẫu Các axit cacboxylic  Những nguyên tắc chung việc kiểm soát tách ICP tương tự sắc kí pha đảo pha thuận, Vai trò ion đối: Trong sắc kí pha đảo, lực dung môi thay đổi thay đổi ion đối thay đổi nồng độ o Sự tăng nồng độ ion đối dẫn đến tăng hệ số dung lượng k’ ICP pha đảo o Trong sắc kí ICP pha thuận pha đảo k’ thay đổi thay đổi loại ion đối (ví dụ thay pentasulfonat heptansunfonat chẳng hạn) Sự cộng thêm nhóm –CH2- dẫn đến k’ tăng lên khoảng 2.5 lần (ảnh hưởng lớn nồng độ ion đối thấp) o Phân tử ion đối lớn giá trị k’càng lớn sắc kí pha đảo nhỏ sắc kí pha thuận 112 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích công cụ Độ phân cực dung môi: o Lực dung mơi ICP pha thuận pha đảo thay đổi thay đổi độ phân cực pha động o Trong hệ thống pha đảo, hỗn hợp nước với methanol acetonitril nói chung sử dụng pha động Khi phần trăm nước giảm xuống dung mơi trở nên mạnh k’ mẫu giảm xuống o Các hỗn hợp butanol pentanol với CH2Cl2, CHCl3 có khơng thêm hexan pha động thường dùng sắc kí pha thuận ICP Ảnh hưởng pH o Giá trị k’ mẫu chịu tác động nhiều ICP thay đổi pH thay đổi dung môi dung mơi khác (ví dụ từ acetat etyl thay butanol) o Nếu biết giá trị pKA axit pKB bazơ tách ta dự đốn lưu giữ tương đối hợp chất thay đổi theo pH o Nói chung pH pha động trì hợp chất mẫu ion hóa hồn tồn, tạo thành ion đối đạt cực đại o Ví dụ tách axit pH pha động thấp anion mẫu X- nằm dạng HX dẫn đến số lượng mẫu nằm dạng ion đối pha tĩnh thấp  Ứng dụng: ICP ứng dụng mẫu phân cực bazơ, ion, hợp chất có nhóm ion hóa Các mẫu nước, bao gồm dịch sinh lí, nhận quan tâm ICP 8.5.5 Sắc kí loại theo cở (Size Exclusion Chromatography) Sắc kí loại theo cở hay gọi sắc kí gel cơng cụ mạnh cho phân tích chất có khối lượng phân tử lớn Chất nhồi cột cho sắc kí hạt nhỏ (cở 10 micromet) polime silica chứa mạng lưới lỗ đồng chất tan dung mơi khuếch tán vào Trong lỗ phân tử bị bẫy cách hiệu bị tách từ dòng chảy pha động Thời gian cư ngụ trung bình lỗ phụ thuộc vào kích thước hiệu dụng phân tử Các phân tử có kích thước lớn so với kích thước trung bình lỗ chất nhồi khơng bị lưu giữ Còn phân tử có đường kính nhỏ đáng kể kích thước lỗ thâm nhập sâu vào sâu lỗ cần nhiều thời gian để khỏi lỗ, dẫn đến bị rửa giải sau Nằm hai loại phân tử có kích thước trung bình xâm nhập vào lỗ nhiều hay tùy thuộc đuồng kính chúng Chú y sắc kí loại theo cở khác với trường hợp xét trước đây, khơng có tương tác hóa học vật lí phân tử chất tan pha tĩnh 113 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Chất nhồi cột Có hai loại: Các hạt polime silica có đường kính từ đến 10 micromet Loại sau cứng nên dễ nhồi cột, bền hơn, cho phép sử dụng khoảng rộng dung môi bao gồm nước, cân thiết lập nhanh dung môi mới, bền nhiệt độ cao Những nhược điểm hạt silica có khuynh hướng lưu giữ chất tan hấp phụ có tiềm xúc tác cho phản ứng phân hủy phân tử chất tan Hầu hết sắc kí loại theo cở thực chất nhựa đồng trùng hợp divinyl benzene với styrene Kích thước lỗ loại polime kiểm soát mở rộng liên kết ngang liên quan đến phần trăm divinylbenzen sử dụng để sản xuất nhựa Vì có nhiều loại gel với kích cở lỗ khác Lúc đầu, nhựa đồng trùng hợp kỵ nước sử dụng với pha động dung môi không nước Hiện nay, gel ưa nước có sẵn (ví dụ poliacrylamide) dẫn dến sử dụng dung mơi nước cho phép tách phân tử chất tan nước ví dụ loại đường Các loại silica hạt thủy tinh có kích thước lỗ trung bình khoảng 40 đến 2500 Ao có sẵn thị trường Để giảm hấp phụ, bề mặt chất thường chuyển hóa chất hữu Ví dụ bề mặt chất nhồi ưa nước có cấu trúc: OH OH │ │ │ —Si—CH2—CH2—CH2—CH2—O—CH2—CH—CH2 │ Phương trình rửa giải: Trong sắc kí theo gel thể tích pha động Vm thường gọi thể tích rỗng (Void volume) Vo Đại lượng Kav định nghĩa là: Kav = (Vr – Vo)/(Vt - Vo) Ở o Vr thể tích lưu chất tan, o Vt thể tích tổng cột = πr2 với r bán kính) o Đối với phân tử lớn không xâm nhập vào gel Vr = Vo Kav = o Đối với phân tử nhỏ xâm nhập tự vào gel Vr ≈ Vt Kav ≈ o Các phân tử có kích thước trung bình xâm nhập phần vào lỗ có Kav nằm khoảng từ đến Thực tế luôn có hấp phụ nên Kav ln ln lớn Thể tích rỗng đo cho loại phân tử trơ có kích thước lớn qua cột Thể tích rửa giải Vo 114 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ 8.6 Sắc kí lỏng mặt phẳng Sắc kí giấy sắc kí lớp mỏng xây dựng, phát triển ứng dụng từ lâu Tuy nhiên sắc kí giấy sử dụng Trong sắc kí mặt phẳng, q trình sắc kí tiến hành tờ giấy hay lớp bột rải giữ mặt kính, chất dẻo hay kim loại, ví dụ nhơm Bản thân lớp mỏng pha tĩnh chất mang để giữ pha tĩnh Pha động chất lỏng thấm chạy lớp mỏng tác dụng lực mao dẫn trọng lực điện Phổ biến sắc kí lớp mỏng Ở nước ta phương pháp sắc kí lớp mỏng sử dụng rộng rãi, có nhiều tài liệu, chuyên gia có kinh nghiệm phương pháp 7.1 Vai trò phương pháp SKLM Về mặt lí thuyết chủng loại pha tĩnh động, mặt ứng dụng, SKLM sắc kí lỏng cột giống Vì SKLM dùng để tìm điều kiện tối ưu cho tách săc kí lỏng cột 115 Bùi Xuân Vững Hóa Phân tích cơng cụ Ưu điểm SKLM tiến hành nhanh chóng tốn thí nghiệm thăm dò cho sắc kí cột SKLM dùng để thử độ tinh khiết sản phẩm dùng nhiều phòng thí nghiệm, nghiên cứu sinh học, hóa sinh… 7.2 Nguyên tắc SKLM SKLM thường tiến hành thủy tinh có rải lợp mỏng dính hạt bột mịn Lớp mỏng thường dùng làm pha tĩnh Các pha tĩnh động SKLM tương tự pha sắc kí lỏng hiệu cao (sắc kí hấp phụ, sắc kí phân bố pha thuận pha ngược, sắc kí trao đổi ion, sắc kí gel) Chuẩn bị lớp mỏng Bột dùng để chế tạo lớp mỏng ( ví dụ bột silicagen) thường thêm nước thành bột nhão rải lên bề mặt sach kính hay chất dẻo (hoặc phiến kính dùng để soi kính hiển vi) thành lớp mỏng Người ta thường cho thêm chất kết dính (như bột bó) bột nhão để giữ hạt dính với dính mặt kính Tấm kính để n cho lớp mỏng định hình dính vào mặt kính sau đem sấy vài tủ sấy Một số hãng hóa chất chế tạo sẵn nhiều loại mỏng silicagen thị huỳnh quang tia tử ngoại bước sóng 254 nm Khai triển sắc kí Là q trình cho pha động chạy xuyên qua pha tĩnh kéo mẫu phân tích di chuyển pha tĩnh Thường người ta chấm giọt mẫu phân tích gần mép mỏng Dùng bút chì đánh dấu nơi chấm mẫu Sau giọt mẫu khơ, đặt mỏng vào bình sắc kí bão hòa dung mơi pha động, mép phía chấm mẫu nhúng vào dung mơi pha động không cho điểm chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi động Sau dung môi chạy nửa hay hai phần ba mỏng lấy sấy khơ Có hai cách triển khai: o Sắc kí lên o Sắc kí ngang Trên hình sắc đồ hai chiều số axit amin Mẫu thử chấm góc lớp mỏng (nơi đánh dấu x) cho dung môi A chạy, bay dung môi , quay 90o cho dung môi B chạy, bay dung môi, phun nihidrin thuốc thử màu axit amin Xác định chất cách so sánh vị trí vết mẫu với vết chuẩn 116 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Hình 8.4: Khai triển sắc kí theo hai chiều Phát vết mỏng Có nhiều phương pháp để phát vết: Hai cách phổ biến dùng để phát hầu hết chất hữu phun dung dịch iot hay axit sunfuric: xuất vết màu tối Có thể phun thuốc thử đặc hiệu (như ninhydrin) Cũng thêm chất huỳnh quang vào pha tĩnh: mỏng sáng (huỳnh quang) soi đèn tử ngoại (ví dụ đèn có xạ 254 nm) nơi có chất phân tích tối có màu huỳnh quang khác với màu sáng mỏng Có thể tóm tắt phương pháp phát sau:  Nếu hợp chất có màu cần ánh sáng ban ngày  Dùng tia tử ngoại UV cho hợp chất phát huỳnh quang (có hệ nối đôi liên hợp)  Phun iot cho hợp chất chứa nối đơi  Dùng thuốc thử Dragendorff để dò tìm alkalo id  Dùng thuốc thử FeCl3 cho hợp chất họ pheno l  Dùng aniline phtalat để phát loại đường  Dùng Ninhydrin để phát hợp chất nitro amin, amino axit Phân tích bán định lượng Có thể ước lượng (bán định lượng) lượng chất sắc đồ cách so sánh diện tích vết mẫu thử với diện tích vết chuẩn Có thể thu kết tốt cạo lấy bột chứa vết, chiết lấy chất phân tích đem định lượng phương pháp lí hóa thích hợp 117 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ TÀI LIỆU THAM KHẢO Modern analytical chemistry, David Harvey, Copyright © 2000 by The McGraw-Hill Companies, Inc Analytical Electrochemistry, Joseph Wang, 2000, Second Edi., Wiley Chromatographic methods, A.Braithwaithe and F.J Smith, 1999, Kluwer Academic Publishers Modern practice of Gas chromatography, Robert L Grob, 1995, Wiley-Interscience Publication Practical HPLC methodology and applications,Brian A Bidlingmeyer, 1992, WileyInterscience Publication Quantitative chemical analysis, Deniel C Harris, 1999, W.H Freeman and company 118 ... 1.4 Phân tích định lượng Phổ hấp thụ phân tử dựa xạ UV-VIS công cụ hữu hiệu để phân tích định lượng Những đặc trưng phương pháp phân tích đo quang là: 12 Bùi Xuân Vững Hóa Phân tích cơng cụ ... 1.4.3 Phương pháp thêm với mẫu đo Chuẩn bị dãy mẫu phân tích nồng độ chưa biết Cx với thể tích Vx nguyên tố hay chất phân tích điều kiện chất nền, môi trường pH… Thêm vào mẫu phân tích thể tích. .. biểu Sự tạo sol khí mẫu thực cách: hóa mẫu dòng khí Ar hóa mẫu tần số siêu âm (hiện sử dụng phổ biến) 25 Bùi Xn Vững Hóa Phân tích cơng cụ Trong phương pháp hóa mẫu tần số siêu âm, dung dịch mẫu